Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Специфическая профилактика холеры включает вакцинацию населения по эпидемическим показаниям (вакцинация населения в эпидемических районах или вакцинация людей, выезжающих в неблагополучные по холере регионы). Эффективность применения вакцин не превышает 60-70%, невосприимчивость после вакцинации сохраняется в течение 3-8 месяцев. В настоящее время имеются следующие пероральные противохолерные вакцины: - вакцина WC/BS состоит из инактивированных клеток V. Cholerae серогруппы О1 с добавлением очищенной В-субъединицы холерного анатоксина. Вакцина обеспечивает защиту в течение шести месяцев после подкожного введения двух доз с недельным интервалом; - модифицированная вакцина WC (убитая корпускулярная холерная вакцина) состоит только из инактивированных холерных вибрионов и не содержит В-субъединицы холерного анатоксина. Применяется две дозы с недельным интервалом. Убитые корпускулярные вакцины готовятся на основе вирулентных штаммов холерного вибриона классического биотипа или биотипа Эль-Тор сероваров Инаба и Огава, выращенных при температуре 37ОС в течение 18-20 часов и инактивированных нагреванием (54ОС в течение 1 часа) или формалином. Препараты выпускают в жидком или лиофилизированном виде. - вакцина CVD 103-HgR состоит из ослабленных живых генетически модифицированных штаммов V. cholerae серогруппы О1. Штамм CVD 103- HgR получен путем делеции гена субъединицы А холерного токсина и включения в ген гемолизина маркера устойчивости к ртути. Однократная вакцинация обеспечивает защиту в течение 3-6 месяцев. При создании живых противохолерных вакцин особое внимание уделяют не только иммуногенности и ареактогенности, но и безопасности препаратов. Под безопасностью подразумевают невозможность повторного приобретения вакцинными штаммами факторов вирулентности спонтанно или в результате горизонтального переноса генов от диких штаммов с помощью бактериофага СТХφ in vivo. Препараты для перорального использования предпочтительнее, так как обеспечивают развитие местного иммунитета в слизистой оболочке тонкого кишечника. В нашей стране разработана холерная вакцина на основе холерогенаанатоксина. Препарат представляет собой смесь обезвреженных формалином экзотоксина и О-антигена холерного вибриона серовара Инаба. Холерогенанатоксин получают путем культивирования холерных вибрионов в жидкой питательной среде. В последующем экзотоксин отделяют от бактериальных клеток центрифугированием, очищают сульфатом аммония и обезвреживают формалином. Вакцину выпускают как в жидком, так и в сухом виде. Жидкий препарат анатоксина представляет собой раствор желтовато-коричневого цвета с небольшой опалесценцией. Сухой препарат холерогена-анатоксина представляет собой пористую массу серовато-желтого цвета. Холероген-анатоксин предназначен для создания искусственного активного иммунитета против холеры по эпидемическим показаниям. Применяется однократно. Вопрос 10. Дисбактериоз. Факторы, влияющие на его формирование, лабораторная диагностика. Применение бактериальных препаратов для профилактики и лечения дисбактериоза. Макроорганизм и его микрофлора являются сбалансированной экологической системой. В самом кишечном биоценозе существуют зависимые связи между отдельными родами, видами бактерий. Нарушение биологического равновесия между микробной флорой и организмом приводит к развитию микробного дисбаланса или дисбактериоза. Дисбактериоз - это стойкое качественное и количественное изменение микрофлоры, выходящее за пределы физиологической нормы, при этом отдельные представители микробиоценоза получают преимущества для роста и размножения и становятся доминирующими. Так при дисбактериозе кишечника исчезают (или снижается их число) облигатные представители микробных ассоциаций и, с другой стороны, увеличивается число энтеробактерий, отсутствующих или встречающихся в малых количествах в норме. Это сопровождается нарушением нормальных, физиологических функций микрофлоры кишечника. Снижается барьерная функция нормальной микрофлоры, нарушается участие нормальной микрофлоры в ферментативных процессах, синтезе витаминов, изменяются показатели неспецифических факторов защиты организма. Всегда отмечается снижение числа облигатной микрофлоры, обладающей высокой антагонистической активностью и развитие гнилостных микробов, гноеродных (стафилококк и др.), грибов рода Candida. Качественные изменения состава микробного пейзажа в кишечнике выражается в изменении ряда свойств кишечной палочки -основного симбионта аэробной микрофлоры, снижение ее антагонистических свойств, потеря ферментативной активности, подвижности, появление гемолитических штаммов эшерихий. Причины формирования микроэкологических нарушений: 1. Перенесенные кишечные заболевания (дизентерия, колиэнтериты и др). 2. Длительное применение антибиотиков, антисептиков, гормонов, иммунодепрессантов, лучевой терапии. 3. Хронические воспалительные процессы, злокачественные опухоли. 4. Пребывание в замкнутых коллективах, работа на предприятиях с проф. вредностями, однообразное питание и другие причины. Дисбактериозы различают по локализации (полости рта, глотки, носа, кишечника, кожи, влагалища) и по этиологии (кандидозный, псевдомонадный, стафилококковый, энтеробактериальный и смешанный). Степени дисбактериоза: 1 степень - латентная, компенсированная форма. Характеризуется незначительными изменениями в аэробной части микробиоценоза (увеличение или уменьшение количества кишечной палочки), бифидофлора и лактофлора не изменены. Кишечной дисфункции нет. 2 степень - субкомпенсированная форма. На фоне незначительною снижения количества бифидобактерий выявляется количественное и качественное изменение кишечной палочки или других условно-патогенных микроорганизмов. 3 степень - значительное снижение уровня бифидофлоры (106 - 107) в сочетании со снижением лактофлоры и резким изменением уровня кишечных палочек. Среди УПФ появляются патогенные микроорганизмы (например, гемолитические. E.coli). 4 степень - отсутствие бифидофлоры, значительное уменьшение лактофлоры и изменение количества кишечной палочки (снижение или увеличение), возрастание числа как облигатных, так и факультативных и не характерных для здорового человека видов УПМ в ассоциациях. Выраженная дисфункция кишечника. Выраженные изменения в анаэробной части состава микрофлоры. Микробиологическая диагностика: Диагноз дисбактериоза устанавливается повторным (с интервалом 5-7 дней) бактериологическим исследованием с использованием количественного определения видов и вариантов микроорганизмов, входящих в состав микробиоценоза. Исследование на кишечный дисбактериоз проводится одновременно с исследованием по диагностике острых кишечных заболеваний. Исследование микрофлоры кишечника включает следующие этапы: 1. Забор и транспортировка материала, подготовка к посеву исследуемого материала. Этот этап сопровождается заполнением карты обследуемого пациента; 2. Посев исследуемого материала на селективные питательные среды с последующем определением количественного и качественного состава микрофлора; 3. Регистрация полученных результатов с рекомендациями врача – бактериолога. Материал забирают из последней порции фекалий стерильным шпателем и помещают в пробирку. От момента взятия материала не должно проходить более 2 –х часов. Анаэробная микрофлора. Количественное содержание бифидобактерий определяют высевая 1,0 мл суспензии из разведения. (105 – 1010) на полужидкую печеночную среду Блаурокк. Через 48 часов инкубирования при Т= 37°С пастеровской пипеткой отбирают характерные колонии в виде гвоздиков, комет, крупинок. При просмотре мазков, окрашенных по Граму, учитывают разведение, при котором в мазке выявляются Гр+ палочки, слегка согнутые с разветвлением на одном из двух концов, расположенные в виде римской цифры V или в виде скоплений, напоминающих китайские иероглифы. Все бифидобактерии не образуют индол и каталазу, не восстанавливают нитраты. Посев на бактероиды производят из разведении 106 , 107 и 108 для детей и 108 и 109 для взрослых на анаэробный кровяной агар с канамицином и желчью. Сразу после посева чашки со средами должны быть помещены в микроанаэростат с газовой смесью (5% СО2,,10 % Н2, 85 % N2) и помещают в термостат 37 С на 72 часа. Учет посевов включает в себя макроскопическое и микроскопическое изучение изолированных колоний и их подсчет. Bacteroides fragilis образует блестящие, иногда слизистые, круглые колонии диаметром 3-5 мм, бежевого или коричневого цвета. Молочнокислые палочки (лактобациллы) выделяют на плотной среде МРС-4. Посев производят по 0,05 (0,1) мл из разведении 103 и 107 .Чашки с посевами инкубируют в анаэростатах с газовой смесью без палладиевых катализаторов при 37 0С в течении 48 часов. На этой среде лактобактерии обычно образуют крупные колоние, гладкие или шероховатые, белого цвета. Кроме лактобактерий на этой питательной среде могут расти другие молочно-кислые бактерии, принадлежащие к родам Lactococcus, Streptococcus. Поэтому при учете чашек с посевами необходимо производить окраску по Граму материала из всех типов колоний. Подтверждением принадлежности бактерий к роду Lactobacillus является их морфология, отсутствие спор, каталазы и оксидазы. Спорообразующие анаэробы (клостридии) выявляют посевом 1,0 (0,5) мл суспензии из разведения 103 ,105 и 107 в растопленный столбик среды Вильсон-Блера. После 24 – 48 часов инкубации подсчитывают число черных колоний в глубине агара с образованием газа (разрыв среды). Факультативно-анаэробные микроорганизмы и аэробные микроорганизмы. Бактерии семейства Enterobacteriaceae. Каждый анализ на дисбактериоз должен сопровождаться обследованием пациента на носительство сальмонелл и шигелл. С этой целью посев проводят на среды Плоскирева и селенитовый бульон из 101 разведения. Для выделения других представителей семейства Enterobacteriaceae, входящих в состав нормальной микрофлоры , используют питательные среды: Эндо, Левина, Плоскирева. Посевы на этих средах делают из 105 и 107 разведениях. Обязательное проведение всего объема исследований на выделение патогенных микроорганизмов семейства кишечных. Лак+ и Лак- колоний отсевом на среду Олькеницкого или Клиглера и короткую биохимическую галерею. При этом идентификация проводится вида микроба. Определяют общее микробное число и число Лак+ и Лак-колоний. Вместе с тем, для выявления дисбактериоза можно не детализировать родовой состав лактозонегативных бактерий, а ограничиться определением на среде Эндо общей суммы лактозонегативных колоний. Очень важно для диагностики дисбактериоза определить доминирующую микрофлору и подсчитать ее количество. Если по сев разведения 105 не дает роста E.coli - это безусловный показатель дисбактериоза, так как означает, что E.coli меньше 106 в 1 г фекалий. Синегнойная палочка определяется посевом из разведении 103, 105, 107 на сектора капельным методом с малахитовым агаром. Отмечают рост крупных колоний, зеленовато- синего цвета, с характерным запахом, оксидаза+. Гемолитичсские свойства микроорганизмов определяют путем посева суспензий из разведения 105 на кровяной агар. Через сутки инкубации производят подсчет и микроскопию колоний с зоной гемолиза. Определяют процент гемолитических культур среди колоний одного вида. Стафилококки определяют при посеве 0,05 мл на ЖСА и инкубируют 2 суток с разведений 101 и 103 . Для подтверждения принадлежности бактерий к виду S. Aureus необходимо провести тесты на выявление плазмокоагулазы и ДНК–азы. Энтерококки выделяют на средах Enterococcus- аgar из разведений исходного материала 103 и 105, колонии энтерококков на этой среде имеют характерную розовую, красную или коричневую окраску. Дрожжеподобные и грибы рода Candida выделяют на среде Сабуро с полимиксином. Посев проводят из 101 и 103 разведений. Инкубируют в течение 3-5 дней при Т= 28-30°С после чего проводят микроскопию препарата из живой культуры. К патогенным грибам относят культуры почкующихся клеток при наличии длинных нитей мицелия (псевдомицеллий)или коротких нитей (истинный мицеллий). В отличии от других представителей этого рода, C. albicans в определенных условиях способны образовывать характерные для них хламидиоспоры. Количественное содержание всех видов микроорганизмов в 1 г фекалий подсчет количества каждого вида микроорганизмов в 1 г испражнений проводят по числу колоний, выросших на питательных средах, с пересчетом на количество посевного материала и степень его разведения по формуле: М= 2 х N х 10п+1 , при посевной дозе 0,05 мл М= N х 10п+1 , при посевной дозе 0,1 мл где М – число микробов в 1 г; N – число колоний данного вида; п – степень разведения. Вопрос 11. Иерсинии, их биологические свойства. Чума и иерсиниозы. Роль отечественных ученых в изучении чумы. Патогенез чумы. Иммунитет. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика чумы. Таксономия. Возбудитель чумы относится к семейству Enterobacteriaceae, роду Yersinia, виду Yersinia pestis. Чумная палочка несколько раз меняла свое название: вначале она называлась Bacterium pestis, затем - Bacillus pestis, Pasteurella pestis, а с 1967 г. она стала называться Yersinia pestis в честь А. Иерсена. По способности ферментировать глицерин и мелибиозу выделяют три биовара возбудителя: - antigua – ферментирует глицерин, не ферментирует мелибиозу, распространен в Центральной Азии и Центральной Африке; - medievalis – ферментирует глицерин и мелибиозу, распространен в Средней Азии и Иране; - orientalis – не ферментирует глицерин и мелибиозу, распространен повсеместно. Биовар antigua считают ответственным за Юстинианову чуму, биовар medievalis связывают с “черной смертью” (второй пандемией чумы), а биовар orientalis полагают связанным с третьей пандемией чумы и большинством современных вспышек заболевания. Отечественная классификация выделяет следующие подвиды возбудителя: - pestis – основной подвид; - altaica – алтайский подвид; - caucasica – кавказский подвид; - hissarica – гиссарский подвид; - udegeica – удэгейский подвид. Возбудитель чумы относится к первой группе патогенности. Морфологические и тинкториальные свойства. Y. pestis представляет собой неподвижную грамотрицательную палочку овоидной (бочкообразной) формы. Чумная палочка спор не образует. Характерным признаком чумного микроба является биполярная окраска. Биполярность особенно четко выражена в мазках, приготовленных из органов человека или грызунов. Она хорошо выявляется при окраске метиленовым синим по Лёффлеру (на кончиках синий цвет, а в центре – фиолетовый). Имеет нежную капсулу, предохраняющую бактерии от фагоцитоза. Культуральные свойства. Чумной микроб является факультативным анаэробом. Растет на простых питательных средах (МПА, МПБ, агар Хоттингера, агар Мартена) при рН 6,9-7,2. Оптимальная температура роста 27-28°С, но может расти в диапазоне температур от 2 до 40°С. Капсула образуется при выращивании при температуре 37ОС. Для ускорения роста в питательные среды добавляют стимуляторы роста: сульфит натрия, кровь. При росте на плотных питательных средах через 8-12 часов появляются сероватые слизистые микроколонии с неровными краями в виде “битого стекла”. Через 18-24 часа инкубации формируются плоские колонии с фестончатыми краями (“кружевные платочки”). Через 40-48 часов выращивания образуются крупные колонии с зернистым центром и неровными краями - “ромашки”. На плотных средах, особенно на скошенном агаре, чумной микроб растет в виде вязкого налета. В жидких средах возбудитель чумы растет в виде поверхностной пленки, от которой вниз спускаются нити, напоминающие сталактиты; на дне образуется хлопьевидный осадок. Среда остается прозрачной. Вирулентные штаммы чумного микроба образуют темный пигмент. Биохимические свойства. Биохимическая активность чумного микроба достаточно высокая. Он синтезирует плазмокоагулазу, фибринолизин, гемолизин, лецитиназу, гиалуронидазу, РНКазу. Основные биохимические свойства, характерные для чумного микроба: - протеолитические свойства выражены слабо: не разжижает желатин, не свертывает молоко, индол не образует; - не ферментирует рамнозу и сахарозу; - ферментирует декстрин, глюкозу, маннозу, маннит, мальтозу, арабинозу, салицин, ксилозу, эскулин с образованием кислоты без газа. По способности ферментировать глицерин чумной микроб подразделяется на хемовары: разлагающие глицерин штаммы (глицеринопозитивные) и не разлагающие глицерин штаммы (глицеринонегативные). Антигенная структура. Чумной микроб обладает комплексом антигенов: - F1-антиген является поверхностным капсульным антигеном клетки; - V-антиген представляет собой белок клеточной стенки, обладает антифагоцитарными свойствами, способствует внутриклеточному размножению бактерий; - W-антиген является липопротеином клеточной стенки, оказывающим также антифагоцитарное действие; - О-антиген - эндотоксин микроба, похожий на эндотоксины других грамотрицательных микробов; - активатор плазминогена – протеаза, активирующая лизис фибриновых сгустков; - мышиный токсин – белковоподобное внутриклеточное вещество, обладающее токсическими свойствами; - пестицины – бактериоцины, обладающие иммуногенными свойствами. Многие антигены чумного микроба относятся к факторам патогенности. F1- антиген обладает протективными свойствами. Чумной микроб имеет также антигены, общие с антигенами эритроцитов О-группы крови человека. Патогенность. Факторами патогенности чумного микроба являются следующие компоненты: - липополисахаридный О-антиген (эндотоксин); - фракция 1 (F1-антиген) чумного микроба - поверхностный гликопротеин (защита от фагоцитоза); - активатор плазминогена – протеаза; - V-антиген белковой природы и липопротеиновый W-антиген проявляют антифагоцитарные свойства и способствуют внутриклеточному размножению бактерий; - F2-фракция (мышиный токсин) – белковоподобное вещество, вызывающее шок и гибель лабораторных животных; - плазмокоагулаза; - фибринолизин; - капсула; - система транспорта железа; - зависимость от ионов кальция в среде; - пестицин; - синтез эндогенных пуринов; - термоиндуцибельные белки наружной мембраны; - нейраминидаза; - аденилатциклаза: - пили адгезии. Факторы патогенности чумного микроба детерминируются как хромосомными, так и плазмидными генами. В частности, возбудитель чумы имеет три плазмиды: рРst (6 мДа), рСad (45 мДа), рFra (60 мДа). Плазмида патогенности pYP (pPst) определяет синтез пестицина, фибринолизина, плазмокоагулазы, иммунитет к пестицину. Плазмида токсигенности pYT (pFra) детерминирует синтез F1-антигена, “мышиного токсина” и капсулы. “Мышиный токсин” обладает способностью блокировать адренергические рецепторы и ингибировать дыхательную активность митохондрий, понижая активность НАДФ-редуктазы. Плазмида вирулентности pYV (pCad) обусловливает зависимость роста микроба от температуры, кальция, а также синтез V- и W-антигенов. V- и Wантигены обеспечивают способность чумных бактерий сохраняться в фагоцитах. |