Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Морфологические и тинкториальные свойства. Возбудитель туляремии представляет собой мелкие грамотрицательные палочки (коккобациллы). В мазках из культур доминируют кокковидные формы, в мазках из органов – палочковидные. Микроб неподвижен, спор не образует, синтезирует капсулу (особенно в организме животных). Основным компонентом внешней мембраны вирулентных клеток туляремийного микроба является S-форма ЛПС, состоящая из О-полисахарида (О- антигена), присоединенного к липиду А через олигосахарид кора. Фазовые вариации липида А влияют на способность туляремийного микроба к внутриклеточному существованию и размножению. ЛПС туляремийного микроба не способен связываться с ЛПС-связывающим белком и рецептором TLR4 на макрофагах. О- антиген играет важную роль во внутриклеточном выживании туляремийного микроба. В отличие от ЛПС других грамотрицательных бактерий ЛПС туляремийного микроба не обладает токсичностью и не индуцирует синтез провоспалительных цитокинов. Для авирулентных штаммов характерен синтез R- ЛПС без О-цепей. Культуральные свойства. Возбудитель туляремии не растет на простых питательных средах, что является одним из дифференциально-диагностических признаков. Для его культивирования применяют среды, содержащие яичный желток, кровь, витамины, цистин, цистеин, тиамин, экстракты органов и тканей животных. Для выращивания туляремийного микроба используют свернутую желточную среду Мак-Коя, полужидкую среду с кровью Емельяновой, среду Фрэнсиса, полужидкую желточную среду Дрожевкиной, FT-агар. На желточных средах и средах с кровью вирулентные штаммы туляремийного микроба формируют блестящие выпуклые небольшие колонии (1-2 мм) с ровными краями S-формы молочно-белого цвета с голубоватым оттенком. Возбудитель туляремии является факультативным анаэробом, температурный оптимум составляет 36-38°С, рН 6,8-7,4. Посевы выдерживают в термостате от 2 до 14 суток. В жидких питательных средах туляремийный микроб растет только на поверхности среды и значительно хуже, чем на плотных средах. Бактерия хорошо размножается также в желточном мешке развивающегося куриного эмбриона. Биохимические свойства. Туляремийный микроб не обладает выраженной биохимической активностью. Способность разлагать углеводы и спирты у этого микроба выявляется лишь на специальных плотных средах с пониженным содержанием белка и с определенным значением рН. Среды Гисса для этой цели непригодны. Бактерия ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу и мальтозу. В некоторых случаях микроб ферментирует левулезу и маннозу. Другие углеводы туляремийный микроб не ферментирует. Образует сероводород и индол, редуцирует тионин, метиленовый голубой, малахитовый зеленый. Антигенная структура. Вирулентные штаммы возбудителя туляремии (S- форма колоний) имеют два антигенных комплекса, локализованных на поверхности клетки. Vi-антиген является вариантом капсульного антигена, он содержит липиды и белки. О-антиген располагается в клеточной стенке и представляет собой термостабильный гликопротеин. Эти антигены вызывают образование агглютинирующих, преципитирующих и комплементсвязывающих антител, а также участвуют в развитии гиперчувствительности замедленного типа. Антигены возбудителя туляремии родственны антигенам возбудителей чумы и бруцеллеза, поэтому возможны перекрестные серологические реакции, что необходимо учитывать при иммунологических исследованиях. Культуры в R-форме утрачивают Vi-антиген и содержат только О-антиген, поэтому они авирулентны и лишены иммуногенных свойств. Полная потеря вирулентности сопровождается утратой иммуногенных свойств, поэтому у вакцинных штаммов туляремийных бактерий сохраняется “остаточная вирулентность” для белых мышей. Экология возбудителя. Туляремия является природно-очаговой зоонозной инфекцией, возбудитель способен циркулировать среди животных в очаге инфекции длительное время. Природная очаговость заболевания поддерживается дикими грызунами и кровососущими членистоногими. В природных очагах естественными носителями (резервуаром) возбудителя туляремии являются зайцы, кролики, водяные крысы, полевки, среди которых периодически возникают эпизоотии и от которых заражаются синантропные мышевидные грызуны. Инфицированные грызуны сохраняют возбудителя в крови с момента развития септицемии до гибели животного. К туляремийному микробу восприимчивы серые крысы, лесные и домовые мыши, суслики, бурундуки, хомяки, песчанки, кроты, землеройки. Из домашних животных к возбудителю туляремии чувствительны овцы, кошки, собаки, свиньи; из лабораторных животных - морские свинки и белые мыши. Возбудитель туляремии приспособился более чем к 140 видам позвоночных и 100 видам кровососущих членистоногих, способных передавать возбудителя. Переносчиками инфекции являются кровососущие членистоногие. Наибольшее эпидемиологическое значение из переносчиков имеют слепни, клещи, комары. Туляремия у сельскохозяйственных животных возникает спорадически и также протекает без видимых клинических проявлений. Заражение происходит с инфицированными кормами и водой, воздушно-капельным путем, а также в результате укусов кровососущих членистоногих. Туляремия чаще проявляется в весенне-осенний период года, что связано с миграцией грызунов, трансмиссивным характером передачи возбудителя, обмолотом хлебов. Болезнь у сельскохозяйственных животных сопровождается небольшим обсеменением тканей бактериями; в крови и в выделениях возбудитель не обнаруживается. Эпидемиология. Природные очаги туляремии распространены в умеренном климатическом поясе северного полушария. Основными источниками туляремийной инфекции для человека являются обыкновенные полёвки, домовые мыши, ондатры, зайцы. Факторами передачи инфекции могут быть вода, сено, солома, пищевые продукты, контаминированные экскрементами больных животных. Переносчики инфекции - кровососущие членистоногие: иксодовые и гамазовые клещи, блохи, слепни, комары, москиты. Механизмы и пути заражения: - контактный механизм - через микротравмы кожи при снятии шкур, разделке тушек, при укусе грызуна; - трансмиссивный механизм - при укусе инфицированными клещами, комарами, слепнями; -фекально-оральный механизм - через желудочно-кишечный тракт при употреблении пищевых продуктов и воды, инфицированных выделениями грызунов; -аспирационный (аэрозольный) механизм - воздушно-пылевой путь при вдыхании контаминированной возбудителем пыли (частичек сена, соломы). Таким образом, инфекция передается человеку непосредственно при контакте с животными, через зараженные пищевые продукты и воду, аспирационным путем (при уходе за животными, обработке зерновых и фуражных продуктов, обмолоте хлеба), кровососущими членистоногими (слепнями, иксодовыми и гамазовыми клещами, блохами, комарами и др.). Заражающая доза F. tularensis для человека при аэрогенном инфицировании составляет всего 10 микробных клеток. Чаще всего заболевания туляремией регистрируются в сельскохозяйственных районах, примыкающих к пойменноболотным очагам инфекции. Возбудитель туляремии в природе сохраняется в организме мелких грызунов и клещей и передается сельскохозяйственным животным кровососущими насекомыми. Различают 4 вида эпидемических вспышек: -промыслово-охотничьи вспышки; -сельскохозяйственные вспышки; -водные вспышки; -пищевые вспышки. Факторы патогенности. Возбудитель туляремии обладает следующими факторами патогенности: -пили 4-го типа; -капсула (капсулоподобный покров); -структурные белки: белки клеточной стенки (наружной мембраны, периплазматического пространства и внутренней мембраны); белки, образующие систему секреции шестого типа (T6SS); -белки-эффекторы; -секретируемые белки (нейраминидаза, цитруллинуреидаза, каталаза, кислая фосфатаза, супероксиддисмутаза). Пили представляют собой гибкие волокнистые поверхностные структуры, состоящие из белка пилина. Они обеспечивают адгезию микроба на клетках хозяина. Капсула (капсулоподобный покров) полисахаридной природы обеспечивает устойчивость микроба к бактерицидным факторам сыворотки крови. Белки внешней мембраны микробных клеток, периплазмы и внутренней мембраны участвуют в адгезии возбудителя и проникновении его внутрь клеток хозяина. Нейраминидаза обеспечивает инвазию микробных клеток в ткани. Цитруллинуреидаза туляремийного микроба катализирует деградацию цитруллина в орнитин с образованием углекислого газа и аммиака и тем самым снижает уровень продукции окиси азота, обладающей антимикробной активностью. В результате этого возбудитель выживает в макрофагах. Секретируемые белки-эффекторы обеспечивают выход микроба из фагосомы в цитозоль для последующего размножения. Факторы патогенности туляремийного микроба транспортируются с помощью систем секреции, среди которых особое значение имеет система T6SS. Гены, детерминирующие синтез белков, позволяющих туляремийному микробу выживать внутри фагоцитов, локализованы в специфическом участке хромосомы, получившем название туляремийный островок патогенности FPI (Francisella pathogenic island). Патогенез. Возбудитель туляремии является внутриклеточным паразитом, способным выживать не только в фагоцитах, но и в фибробластах, клетках эндотелия, эпителиальных и других клетках. Адгезия возбудителя на клетках организма происходит за счет пилей, капсулы и белков наружной мембраны клеточной стенки. После адгезии возбудитель индуцирует у макрофагов образование асимметричных псевдоподий. Проникнув внутрь клетки, туляремийный микроб некоторое время находится в фагосоме (FCP – Francisella-containing phagosome, FCV - Francisellacontaining vacuole), блокирует созревание фагосомы и после деградации эндосомальной мембраны через 30-60 минут после фагоцитоза проникает в цитоплазму (“убегает” из фагосомы). В цитоплазме возбудитель активно размножается, в результате чего клетка погибает (срабатывает смерть клетки по механизму апоптоза или пироптоза). После этого микроб высвобождается и поражает другие клетки. В лимфатических узлах формируются туляремийные бубоны. Бубоны могут быть первичными (связаны с входными воротами) и вторичными (связаны с заносом возбудителя из первичного бубона). Периодически из очагов инфекции возбудитель проникает в лимфу и кровь (бактериемия). Бактериемия приводит к образованию очагов в печени, селезёнке, лёгких, костном мозге и других органах (вторичные поражения). Проникший в организм с вдыхаемым воздухом возбудитель через М-клетки эпителия бронхиол попадает в подлежащие ткани и поглощается дендритными клетками. Дендритные клетки в региональных лимфатических узлах представляют антигены туляремийного микроба Т-хелперам. Пролиферация Т-хелперов приводит к синтезу цитокинов и активации макрофагов. В результате этого формируется туляремийная гранулема. Туляремийные гранулемы формируются в пораженных внутренних органах и лимфоузлах. По внешнему виду они представляют собой узелки диаметром 1-4 мм. Центральная часть гранулемы представлена участком некроза. Формированию гранулемы способствует незавершенный фагоцитоз, при котором отсутствует внутриклеточный киллинг. Образование гранулемы в первичных бубонах приводит к их нагноению, вскрытию и образованию длительно не заживающих язв. В случае замещения гранулемы соединительной тканью наблюдается склерозирование. Клинические признаки заболевания. Инкубационный период при туляремии длится от 3 до 12 дней. Начало заболевания острое, часто без продромального периода. Больные угнетены, температура тела повышается до 41°С. Лихорадочный период продолжается от 2 до 7 дней, сопровождается головной болью, головокружением, мышечными болями. Пульс и дыхание учащаются. Слизистые оболочки становятся бледными: резко снижается содержание гемоглобина в крови. Лимфатические узлы увеличены. По локализации процесса выделяют следующие клинические формы туляремии: -туляремия с поражением кожи, слизистых оболочек и лимфатических узлов (бубонная, язвенно-бубонная, ангинозно-бубонная формы); -туляремия с преимущественным поражением внутренних органов (легочная, абдоминальная формы); - генерализованная форма. По классификации ВОЗ (1995 г.) выделяют следующие формы заболевания: -ульцерогландулярная (язвенно-бубонная, кожно-бубонная); -окулогландулярная (глазобубонная, офтальмическая); -торакальная (легочная); -абдоминальная (желудочно-кишечная); -генерализованная. По длительности течения туляремия может быть острой, затяжной, рецидивирующей, по тяжести течения - легкой, средней тяжести, тяжелой. Туляремия сопровождается развитием аллергии, которая появляется во время болезни и сохраняется в течение многих лет, иногда всю жизнь. После выздоровления развивается стойкий, пожизненный иммунитет. Летальность в последнее время незначительная. В связи с широким применением антибиотиков в большинстве случаев болезнь заканчивается выздоровлением. Бубонная форма туляремии возникает при проникновении возбудителя через кожу и проявляется воспалением регионарных лимфатических узлов, в которых накапливается возбудитель. Наиболее часто поражаются шейные, подмышечные, паховые и бедренные лимфатические узлы. На 2-3-й день появляется отчетливая болезненность, в последующие дни узел увеличивается до 8-10 см. Кожа не спаяна с бубоном и долго сохраняет нормальную окраску. В дальнейшем бубоны медленно (в течение 1-4 месяцев) рассасываются или нагнаиваются. При нагноении через образовавшийся свищ выделяется густой молочно-белый гной. Заживление свища протекает медленно, с образованием рубца. При язвенно-бубонной форме на месте внедрения возбудителя вначале появляется пятно, которое в последующем трансформируется в язву. При этом поражение регионарных лимфатических узлов протекает по типу первичных бубонов. Глазо-бубонная форма туляремии развивается при попадании возбудителя на конъюнктиву. Для этой формы характерен резко выраженный конъюнктивит, сопровождающийся выделением густого желтоватого гноя. Ангинозно-бубонная форма туляремии развивается при проникновении возбудителя с инфицированными пищевыми продуктами и водой. Для этой формы характерны умеренные боли в горле, затруднение глотания и гиперемия зева. Миндалины отечны, с гнойным налетом. Ангинозно-бубонная форма туляремии сопровождается образованием шейных бубонов. Легочная форма заболевания сопровождается воспалением лимфатических узлов грудной клетки и клинически проявляется загрудинными болями, сухим кашлем, хрипами. Инфильтративные изменения в легких носят очаговый, лобарный или диссеминированный характер. Абдоминальная форма сопровождается поражением мезентериальных лимфоузлов и проявляется схваткообразными болями в животе, тошнотой, рвотой. Генерализованная форма туляремии встречается у ослабленных лиц и сопровождается общетоксическими симптомами: головной болью, слабостью, мышечными болями, повышением температуры тела до 39-40ОС, спутанным сознанием, бредом. Эта форма может осложняться вторичной пневмонией, менингитом, менингоэнцефалитом, полиартритами, миокардиодистрофией. Диагностика туляремии. При диагностике заболевания руководствуются Методическими указаниями МУК 4.2.2939-11 (Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней). Материалом для исследования является содержимое бубонов, отделяемое слизистой оболочки, мокрота, кровь, испражнения. При взятии материала и его доставке в лабораторию соблюдают правила асептики и меры предосторожности. Исследования с материалом, подозрительным на присутствие возбудителя туляремии, проводят в лаборатории, имеющей разрешение на работы с микроорганизмами II группы патогенности. При необходимости исследуют ткани животных (печень, почки, селезенку, лимфатические узлы), солому, фураж, воду. Лабораторная диагностика туляремии включает: -экспресс-диагностику; -культуральное исследование (посев материала на питательные среды, выделение чистой культуры и ее идентификация); -биопробу (заражение белых мышей или морских свинок); -серологические реакции; -кожно-аллергическую пробу. Экспресс-методом диагностики туляремии является прямая РИФ с люминесцирующим туляремийным иммуноглобулином. При обработке исследуемого материала люминесцирующим туляремийным иммуноглобулином в положительных случаях в люминесцентном микроскопе обнаруживается специфическое ярко-зеленое свечение туляремийных бактерий. Эта реакция позволяет выявлять живые или нежизнеспособные бактерии в пунктате бубона, отделяемом, смывах. Однако этот метод является сигнальным, и положительные результаты должны подтверждаться выделением чистой культуры возбудителя. Следует отметить, что выделение культуры не всегда возможно, так как органы и ткани больного человека содержат небольшое количество возбудителя. Кроме того, выделение возбудителя наиболее вероятно в течение первых 2-3 недель от начала заболевания. Для выделения чистой культуры возбудителя проводят посев материала на специальные питательные среды (свернутая желточная среда Мак-Коя, среды Дрожевкиной и Емельяновой). Одновременно делают контрольные посевы на МПА и в МПБ, которые инкубируют в аэробных и анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 10-14 суток (на этих средах рост туляремийного микроба отсутствует). Для выделения возбудителя используют биологический метод, так как получение культуры непосредственно от больного человека в большинстве случаев затруднено. Для биологической пробы подкожно заражают белых мышей или морских свинок материалом от больных. При наличии в исследуемом материале туляремийных бактерий белые мыши погибают через 3-4 суток, морские свинки – через 4-6 суток. При низкой концентрации микробных клеток в исследуемом материале гибель животных отмечается через 8-20 суток. Павших животных вскрывают, из органов делают мазки-отпечатки и производят посев на питательные среды. Полученную чистую культуру идентифицируют по морфологическим и тинкториальным свойствам, характеру роста на желточной среде и отсутствию роста на простых питательных средах (МПА, МПБ). |