Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Лечение. Бактероиды обладают большей устойчивостью к антибиотикам в сравнении с другими анаэробами. Для лечения данных инфекций применяют метронидазол или клиндамицин, которые эффективны в отношении большинства грамотрицательных анаэробных микроорганизмов. Возможно применение хлорамфеникола, ингибитор-защищенных пенициллинов (амоксиклава), карбапенемов, антианаэробных фторхинолонов (моксифлоксацина, гатифлоксацина). Вопрос 19. Этиология ботулизма. Характеристика токсинов. Патогенез заболевания. Микробиологическая диагностика. Специфическая терапия и профилактика ботулизма. Классификация. Возбудители ботулизма относятся к отделу Firmicutes, порядку Clostridiales, семейству Bacillaceae, роду Clostridium, виду Clostridium botulinum. Возбудитель ботулизма образует экзотоксины, различающиеся по антигенным свойствам. По структуре продуцируемого экзотоксина клостридии ботулизма подразделяются на 7 серотипов: Cl. botulinum A, Cl. botulinum B, Cl. botulinum C (подтипы С1 или Сα и C2 или Сβ), Cl. botulinum D, Cl. botulinum E, Cl. botulinum F и Cl. botulinum G. В патологии человека преобладают серотипы А, В, Е и редко - F. Морфологические и тинкториальные свойства. Возбудитель ботулизма может находиться в двух формах – вегетативной и споровой. Вегетативные клетки возбудителя ботулизма представляют собой крупные грамположительные палочки с закругленными. В мазках палочки располагаются одиночно, небольшими скоплениями или в виде коротких цепочек. Возбудитель ботулизма в неблагоприятных условиях образует споры. Споры возбудителя ботулизма овальные, располагаются терминально и субтерминально, придавая клетке форму теннисной ракетки. Клостридии ботулизма не образуют капсул. За счет перитрихиально расположенных жгутиков вегетативные клетки возбудителя ботулизма обладают подвижностью. У одной клетки может быть от 4 до 35 жгутиков. Культуральные и биохимические свойства. Возбудитель ботулизма является строгим анаэробом. Оптимальная температура роста и токсинообразования 28-35ОС в зависимости от серотипа возбудителя, рН - 7,3-7,6. Для выращивания клостридий применяется жидкая среда Китта-Тароцци, а также плотные питательные среды (печеночный агар, железосульфитный агар, глюкозно-кровяной агар Цейсслера). В среде Китта-Тароцци и МПБ в анаэробных условиях рост клостридий ботулизма сопровождается равномерным помутнением и небольшим газообразованием, при этом отмечается запах прогорклого масла. На печеночном или сахарном агаре в анаэробных условиях клостридии ботулизма формируют шероховатые колонии. На кровяном агаре возбудитель ботулизма образует колонии с ровными или изрезанными краями и блестящей поверхностью, окруженные зоной гемолиза. На желатиновой среде формируются сероватые колонии, окруженные зоной разжиженного желатина. Протеолитические свойства наиболее выражены у бактерий, продуцирующих токсины типов А и В. Менее выражены протеолитические свойства у бактерий, синтезирующих токсин типа F, а у бактерий, продуцирующих токсины типов C, D и E, протеолитическая способность очень слабая. На железо-сульфитном агаре (среде Вильсона-Блера) клостридии ботулизма в анаэробных условиях формируют колонии черного цвета за счет образования сульфида железа под влиянием продуцируемого бактериями сероводорода. Все типы возбудителя ботулизма продуцируют желатиназу и лецитиназу. С. botulinum ферментирует с образованием газа и кислоты глюкозу, левулезу, мальтозу, глицерин, декстрин, салицин, адонит, инозит и не разлагает галактозу, сахарозу, дульцит, маннит, арабинозу и рамнозу. Однако эти свойства непостоянны. По биохимическим свойствам выделяют 4 группы Cl. botulinum: - бактерии I группы обладают выраженными протеолитическими свойствами, гидролизуют желатин и эскулин, ферментируют глюкозу и мальтозу, проявляют липазную активность (в эту группу входят штаммы, продуцирующие нейротоксин типа А, и протеолитические штаммы, продуцирующие нейротоксины типов B и F); - бактерии II группы ферментируют глюкозу и мальтозу, но не обладают протеолитической активностью (эта группа объединяет непротеолитические штаммы, продуцирующие нейротоксины типов B и F, и все штаммы, продуцирующие токсин типа E); - бактерии III группы обладают липазной активностью и гидролизуют желатин (группа включает штаммы, продуцирующие токсины типов С и D); - бактерии IV группы гидролизуют желатин, но не обладают сахаролитическими свойствами и липазной активностью (эта группа предствлена протеолитическими, но не сахаролитическими штаммами, продуцирующими токсины типа G). Антигенная структура. Серотипы возбудителя ботулизма сходны по морфологическим, культуральным свойствам и действию на организм человека. Каждый тип токсина отличается друг от друга по антигенной структуре. Поэтому выделяют 7 антигенных вариантов возбудителя ботулизма (A, D, C, D, E, F, G). Специфичность каждого варианта выявляют в реакции с антитоксическими сыворотками. В вегетативных клетках возбудителя ботулизма выявляют соматический О-антиген и жгутиковый Н-антиген. Эти антигены идентифицируются в реакции агглютинации. Соматический О-антиген является групповым, общим для протеолитических штаммов С. botulinum сероваров А и В. Жгутиковый Н-антиген является типоспецифическим. Он идентичен у бактерий, различающихся по варианту экзотоксинов. Факторы патогенности. Основным фактором патогенности возбудителя ботулизма является ботулинический экзотоксин, продуцируемый вегетативными клетками. К факторам патогенности клостридий ботулизма относятся также ферменты агрессии: протеиназы, лецитиназы, декарбоксилазы. Ботулинический токсин представляет собой белок, обладающий нейротоксическим действием. Ботулотоксин является самым сильным ядом: 1 г кристаллического токсина содержит 1012 смертельных для человека доз. Смертельная доза для человека составляет 1 нг/кг массы тела, то есть менее 1 мкг на человека. Токсинообразование у бактерий типов С, D и Е детерминировано генами умеренных фагов и проявляется при интеграции ДНК бактериофага в бактериальную хромосому. У остальных типов возбудителя токсинообразование определяется хромосомными генами. Ботулинические токсины всех типов синтезируются в виде комплексов (протоксинов), состоящих из нейротоксина и нетоксического белкового компонента, включающего гемагглютинин (НА) и нетоксический негемагглютинирующий белок (NTNH). Протоксин имеет молекулярную массу 450 кД. Действующим началом является нейротоксин. Однако нейротоксин без других белков комплекса является очень лабильным. Белковый компонент является стабилизатором и защищает нейротоксин от действия протеолитических ферментов и соляной кислоты пищеварительного тракта. У ботулинических токсинов идентифицировано 3 типа гемагглютининов (НА17, НА35 и НА70). Нейротоксин состоит из 2 субъединиц (легкой цепи LC и тяжелой цепи НС), соединенных дисульфидной связью. Токсин удерживает около себя нетоксичные протеины: гемагглютинины (НА) и негемагглютинин (NTNH). Токсин сероваров Е и В образуется в виде протоксина и активируется трипсином. Обратить внимание на то, что для людей наиболее патогенными являются типы А, В, Е (очень токсичен Е), менее патогенные – С, Д, F. Все ботулинические нейротоксины синтезируются в виде полипептида с молекулярной массой около 150000 Д. В результате действия протеаз происходит активация токсина. У большинства типов возбудителя протеолиз осуществляется собственными клостридиальными (эндогенными) протеазами, а у возбудителя типа Е – экзогенными протеазами желудочно-кишечного тракта. В последующем в результате действия протеаз токсин распадается на 2 субкомпонента: L-легкую цепь (молекулярная масса 50 кД) и H-тяжелую цепь (молекулярная масса 100 кД). Между ними сохраняется дисульфидная связь. Легкая цепь после разрушения дисульфидной связи приобретает цинк-эндопептидазную активность. Тяжелая цепь соответствует фрагменту В (акцептор) бинарного токсина. Посредством С-концевого (рецепторсвязывающего) домена тяжелая цепь связывается с рецепторами на мембране аксона, а с помощью N-концевого (транслокационного) домена перемещает легкую цепь через мембрану в цитозоль нервной клетки. Легкая цепь токсина соответствует фрагменту А (активатору)бинарного токсина и оказывает непосредственное токсическое действие на клетку-мишень (мотонейрон). Легкая цепь разрушает транспортные белки, отвечающие за слияние секреторного пузырька с пресинаптической мембраной. В результате протеолиза транспортных белков нарушается слияние синаптического пузырька с мембраной, высвобождение ацетилхолина в синаптическую щель и передача импульса с нервного волокна на мышцу. Гены, детерминирующие синтез ботулинического токсина, собраны в кластер, который располагается на бактериальной хромосоме, плазмиде или в геноме бактериофага. Обычно клетки одного штамма продуцируют один тип токсина. Гены токсинообразования могут переноситься между разными штаммами посредством трансформации, конъюгации или трансдукции. Добавление к ботулиническому токсину 0,3-0,5% формалина и инкубирование смеси в термостате при температуре 36-37ОС в течение 3-4 недель приводит к полной потере токсичности. Обезвреженный таким способом токсин называется анатоксином. Ботулинический анатоксин используют для иммунизации людей, а также для гипериммунизации животных (лошадей) с целью получения гипериммунных сывороток (антитоксинов). Типы токсинов различают по антигенной структуре и молекулярной массе, по скорости седиментации выделяют 12S-, 16S- и 19S токсины. 12S-токсины (М-токсины) состоят из молекулы нейротоксина (Н цепь) и молекулы нетоксичного и негемагглютинирующего белка (L цепь); 16S-токсины (L-токсины) состоят из молекулы нейротоксина и гемагглютининового нетоксичного белка; 19S-токсины (L L – токсины) с большой молекулярной массой, включающие в себя нейротоксин и нетоксический белок с гемагглютинирующими свойствами. Гемолизин (лизирует эритроциты барана) и вызывает гибель лабораторных животных. Надо отметить, что гемолизин продуцируют только некоторые штаммы. Эпидемиология. Возбудитель ботулизма обнаруживается в почве, иле озер и прудов, в кишечнике разных видов домашних и диких животных, птиц и рыб (транзиторное состояние). Ботулизм регистрируется повсеместно. Больной человек не представляет опасности для окружающих. В естественных условиях резервуаром и источником возбудителя инфекции является почва. Механизм передачи – фекально-оральный. Путь передачи – алиментарный. Попадая в пищевые продукты, споры клостридий ботулизма прорастают и образуют токсин. Наибольшую опасность представляют приготовленные с нарушением технологического режима мясные, рыбные и овощные герметически укупоренные консервы домашнего приготовления, ветчина, колбасы, копченая и вяленая рыба, маринованные в домашних условиях грибы. Иногда при размножении возбудителя в результате образования газов наблюдается бомбаж (вздутие) консервных банок. Заболевание, возникшее в результате попадания нейротоксина в желудочнокишечный тракт вместе с пищевыми продуктами, протекает как пищевой токсикоз или пищевая интоксикация. В некоторых случаях заболевание развивается при попадании спор возбудителя в рану и размножении в ней (раневой ботулизм) или в результате размножения попавших с пищей спор в кишечнике ребенка (ботулизм детского возраста). В этих случаях происходит размножение возбудителя и продуцирование токсина в организме пострадавшего. Заболевание при таких путях заражения протекает как токсикоинфекция. Патогенез ботулизма. Патогенез пищевого ботулизма включает следующие стадии: 1. Споры возбудителя ботулизма попадают в пищевые продукты, где в процессе размножения в анаэробных условиях продуцируют токсин. 2. Токсин вместе с пищевыми продуктами попадает в организм человека, сорбируется на клетках слизистой оболочки кишечника и всасывается в кровь. Токсин может всасываться также через слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. 3. Вместе с кровью токсин разносится по организму, попадает в мышцы и достигает периферических нервных окончаний, где нарушает передачу сигнала с нервного окончания на мышечное волокно путем блокировки выделения ацетилхолина в мионевральные синапсы (“химическая денервация”). В результате этого нарушается передача нервного импульса в мышцу, и развиваются характерные параличи мышц. В норме для передачи сигнала с нервной клетки на мышечное волокно необходим выброс ацетилхолина из нервного окончания в синаптическую щель. Для этого выброса мембрана находящегося в нервном окончании синаптического пузырька, содержащего ацетилхолин, сливается с пресинаптической мембраной аксона. В процессе выброса ацетилхолина из синаптического пузырька в синаптическую щель участвуют специфические транспортные белки нервной клетки, входящие в белковый комплекс SNARE. SNARE (англ. soluble NSF attachment receptor) – это группа белков, осуществляющих слияние внутриклеточных везикул с клеточной мембраной и экзоцитоз нейромедиаторов в синаптическую щель. В комплекс SNARE входят белки синаптобревин, синтаксин и SNAP-25. Синаптобревин является небольшим трансмембранным белком секреторных везикул (везикуло-ассоциированный мембранный белок, VAMP). SNAP-25 (синаптосомально-ассоциированный протеин) осуществляет стыковку синаптического пузырька с пресинаптической мембраной нейрона, а синтаксин обеспечивает слияние синаптического пузырька с пресинаптической мембраной. При этом синаптобревин располагается на поверхности синаптического пузырька, а синтаксин и SNAP-25 – на пресинаптической мембране. Ацетилхолин, высвобождающийся из нервного окончания в синаптическую щель, связывается с рецепторами на поверхности мышечной клетки и вызывает сокращение иннервируемой мышцы. При ботулизме попавший в продукт возбудитель размножается и синтезирует токсин. Вместе с пищей токсин проникает в организм человека. Всасывание токсина происходит через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, начиная с полости рта, но наибольшее количество - через слизистую оболочку желудка и тонкой кишки. Всосавшийся токсин попадает в лимфу, а затем - в кровь. С током крови токсин заносится в синаптическую щель. В синаптической щели ботулотоксин с помощью тяжелой цепи связывается со специфическими гликопротеиновыми рецепторами на пресинаптической мембране и в течение 30 минут путем рецептор-опосредованного эндоцитоза проникает в нервное окончание (интернализация токсина). В нервном окончании токсин формирует везикулы, в которых дисульфидный мостик между цепями токсина разрывается, и легкая цепь через поры выходит в цитозоль нервной клетки. В цитозоле легкая цепь связывается с синаптическими белками, которые участвуют в выбросе ацетилхолина из нервного окончания в пресинаптическую щель, и разрушает эти белки. В частности, мишенью для токсинов типов А и Е является белок SNAP-25, токсинов типов В, D, F и G – синаптобревин, токсина типа С – синтаксин и SNAP-25. В результате разрушения синаптических белков не происходит слияния ацетилхолиновых пузырьков с пресинаптической мембраной, ацетилхолин в синаптическую щель не попадает, и сигнал на мышцу не поступает. Результатом действия ботулинического токсина является развитие вялых параличей. Экспериментально установлено, что для блокирования одного синапса достаточно 10 молекул ботулинического токсина. В первую очередь нарушается иннервация мышц глазодвигательного аппарата, мышц глотки и гортани. В результате нарушения вегетативной иннервации снижается секреция слюнных, слезных, потовых желез (парез желудочно-кишечного тракта, гипогидроз). Поражение, вызванное ботулиническим токсином, является обратимым и со временем двигательная функция полностью восстанавливается. Восстановление двигательной активности происходит за счет образования новых синаптических связей. Клиника ботулизма. В соответствии с рекомендациями ВОЗ различают 4 категории ботулизма: - пищевой ботулизм, возникающий после употребления в пищу продуктов, содержащих накопившийся ботулинический токсин; - раневой ботулизм, развивающийся при загрязнении почвой раны, в которой имеются анаэробные условия для прорастания попавших спор и токсинообразования; - ботулизм детского возраста (ботулизм новорожденных, ботулизм младенцев), возникающий у детей первого года жизни при попадании спор возбудителя ботулизма с пищей; - неклассифицированный ботулизм, при котором не бывает установленной связь заболевания с каким-либо пищевым продуктом. Основной формой заболевания является пищевой ботулизм, который возникает при употреблении продуктов, содержащих ботулинический токсин. При этом инкубационный период колеблется от 2 часов до 4 дней в зависимости от дозы токсина. В единичных случаях инкубационный период продолжается до 9-12 дней. Чаще всего инкубационный период при ботулизме составляет 18-36 часов. Вначале появляются желудочно-кишечные расстройства - тошнота, рвота, боли в животе. Лихорадка, как правило, отсутствует. Затем развиваются неврологические симптомы. Наиболее типичными ранними признаками ботулизма являются офтальмоплегический и бульбарный синдромы. Офтальмоплегический синдром проявляется жалобами на нарушение зрения: двоение предметов (диплопия), туман перед глазами. При обследовании выявляются блефароптоз (опущение верхнего века), горизонтальный нистагм (непроизвольные колебательные движения глаз), мидриаз (расширение зрачка), анизокория (поражение сфинктера зрачка), вялая реакция зрачка на свет. Одновременно с глазными симптомами появляются признаки поражения ядер IX и XII пар черепных нервов (бульбарный синдром): нарушение речи (гнусавость или осиплость голоса вплоть до полной афонии), затруднение глотания (дисфагия), ограничение подвижности мягкого неба и языка, гиперсаливация или гипосаливация. Для ботулизма характерна симметричность неврологической симптоматики. В последующем у больного отмечается прогрессирующая мышечная слабость в результате развития двусторонних нисходящих вялых параличей мышц: вялость движений, адинамия, парезы и параличи глоточных, гортанных мышц, мышц шеи и конечностей. Слабость затылочных мышц приводит к тому, что голова свисает, и больные вынуждены поддерживать ее руками. Слабость межреберных мышц выражается поверхностным дыханием. Из-за слабости скелетной мускулатуры больные малоподвижны. Смерть наступает от острой дыхательной недостаточности на фоне сохраненной сердечной деятельности и ясного сознания. Выздоровление протекает медленно – в течение нескольких месяцев. |