Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Раневой ботулизм возникает в результате попадания спор в рану, в которой создаются анаэробные условия. При прорастании спор и образовании вегетативных клеток продуцируется ботулинический токсин, который всасывается и вызывает развитие типичных неврологических симптомов. Симптоматика со стороны желудочно-кишечного тракта отсутствует. Ботулизм новорожденных (ботулизм грудных детей, ботулизм младенцев) наблюдается у детей первого года жизни. Заболевание возникает в основном в социально неблагополучных семьях, проживающих в неудовлетворительных санитарно-гигиенических условиях. В кишечнике ребенка, у которого собственная микрофлора еще не сформирована, попавшие споры прорастают и продуцируют токсин. Образующийся токсин всасывается в кровь и достигает клеток-мишеней. Первыми симптомами заболевания являются вялость, слабое сосание, задержка стула. Затем появляются офтальмоплегические симптомы, хриплый плач. Иммунитет. У отдельных людей встречается индивидуальная устойчивость к ботулиническому токсину. Однако естественный иммунитет к ботулизму у человека отсутствует. После заболевания иммунитет также не формируется, так как поражающая доза токсина во много раз меньше иммуногенной дозы. Диагностика ботулизма. Диагностика ботулизма основана на клинической картине заболевания (нарушение зрения, глотания, речи, мышечная слабость), эпидемиологических данных (употребление подозрительных консервированных продуктов) и результатов лабораторных исследований. Лабораторная диагностика в первую очередь направлена на обнаружение токсина и установление его типа. Выделение возбудителя является вторичным этапом исследований. Исследуемым материалом при диагностике ботулизма являются промывные воды желудка, кровь, рвотные массы, фекалии, моча, секционный материал, остатки пищевых продуктов. Пробы отбирают в максимально короткие сроки после заболевания в стерильную посуду, не обработанную дезинфицирующими средствами. Консерванты не добавляют. До поступления в лабораторию исследуемый материал хранят в холодильнике при температуре 4-6 ОС. Кровь исследуют на наличие токсина (биопроба на мышах), фекалии – на наличие возбудителя (посев на питательные среды), остальной материал – на наличие токсина и возбудителя. В качестве экспрессных методов диагностики ботулизма используются полимеразная цепная реакция (ПЦР) и иммуноферментный анализ (ИФА). Основным методом диагностики ботулизма является выявление токсина. Для обнаружения токсина в исследуемом материале используют реакцию нейтрализации токсина на лабораторных животных (биопроба). Для обнаружения токсинов для каждой пробы используют 4 белых мышей. Первое животное подкожно заражают только исследуемым материалом, а остальных мышей – смесью материала с 200 МЕ антитоксической диагностической сыворотки типов А, В и Е. Предварительно смеси выдерживают при комнатной температуре в течение 40 минут дня нейтрализации токсина антитоксином. Наблюдение за животными проводят в течение 4 дней. При наличии в материале токсина в течение 4-5 часов погибают все животные, кроме той мыши, которой была введена смесь токсина и гомологичной антитоксической сыворотки. При введении материала, содержащего ботулинический токсин, у мышей отмечается учащенное дыхание, полное расслабление мышц, развивается типичный симптом поражения - “осиная талия”. Для обнаружения и идентификации токсина используют также РПГА с эритроцитарными иммуноглобулиновыми диагностикумами моноспецифическими типов А, В и Е или диагностикумом ботулиническим эритроцитарным иммуноглобулиновым поливалентным типов А, В и Е. Иммуноглобулиновый (антительный) диагностикум представляет собой эритроциты, сенсибилизированные антитоксином соответствующего типа. ИФА и РПГА используются для быстрого анализа подозрительных продуктов на присутствие в них ботулинического токсина. Перспективным методом диагностики ботулизма является ПЦР, позволяющая идентифицировать возбудитель в пищевых продуктах и содержимом кишечника. Выделение возбудителя производят из кала больного и остатков пищи путем посева в среду Китта-Тароцци и культивирования в анаэробных условиях. Выросшую культуру идентифицируют по морфологическим и тинкториальным свойствам (микроскопия окрашенных по Граму мазков), ферментативной активности и в реакции нейтрализации на мышах с противоботулиническими сыворотками. Серологические исследования при диагностике ботулизма не проводятся, так как заболевание не сопровождается выработкой антител. Лечение больного ботулизмом проводится в стационаре. Первая помощь заключается в промывании желудочно-кишечного тракта 2-5%-ным раствором гидрокарбоната натрия. После промывания желудка больным вводят энтеросорбенты. Затем вводят лечебные противоботулинические сыворотки, которые выпускаются в жидком и лиофильно высушенном виде. До установления типа токсина, вызвавшего заболевание, больному вводят внутримышечно поливалентную антитоксическую сыворотку или смесь сывороток типов А и Е по 10000 МЕ и типа В 5000 МЕ. После установления типа токсина на белых мышах вводят соответствующую моновалентную антитоксическую сыворотку. Перед введением сыворотки ставят внутрикожную пробу с разведенной 1:100 сывороткой для выявления повышенной чувствительности к лошадиному белку. Антитоксическую сыворотку вводят по методу Безредка (0,1 мл подкожно, через 15 минут - 0,2 мл, еще через 15 минут – внутримышечно всю дозу сыворотки, предварительно подогретой до 36-37С). Противоботулиническая сыворотка представляет собой сыворотку крови лошадей, гипериммунизированных анатоксинами возбудителя ботулизма. В качестве консерванта в сыворотку добавляют 0,5% хлороформа. Для лечения ботулизма младенцев в США разработан человеческий противоботулинический иммуноглобулин, получаемый от людей, иммунизированных пентавалентным ботулиническим анатоксином. Наряду с сыворотками используют антибиотики (левомицетин, тетрациклин), детоксикационные, симптоматические и общеукрепляющие средства. Противопоказано применение аминогликозидных антибиотиков (гентамицина, тобрамицина), которые усиливают эффект ботулинических токсинов. При раневом ботулизме проводят тщательную хирургическую обработку раны с последующим использованием антисептиков. Профилактика ботулизма. Неспецифическая профилактика включает комплекс санитарногигиенических мероприятий, направленных на предотвращение попадания бактерий и их спор в пищевые продукты, соблюдение санитарно-гигиенических правил при производстве пищевых продуктов (колбас, консервов). Большое значение имеет разъяснительная работа с населением. При домашнем консервировании продукты следует тщательно мыть, использовать тепловую обработку банок, крышек, продуктов. Хранить домашние консервы следует при температуре 3-6 ОС. Консервы из банок, имеющих признаки бомбажа, не следует использовать в пищу. Приготовленные в домашних условиях консервированные продукты после вскрытия банок целесообразно перед употреблением прогреть при 100ОС в течение 30 минут для разрушения токсина. Продукты питания, не подлежащие термической обработке (соленая или копченая рыба), должны храниться при температуре не выше 10ОС. Лицам, употреблявшим подозрительный продукт, проводят экстренную профилактику с помощью поливалентной или моновалентной (типов А, В, Е) лошадиной сыворотки. С этой целью внутримышечно вводят по 1000-2000 МЕ противоботулинических сывороток типов А, В, Е. За этими лицами проводят медицинское наблюдение в течение 12 дней. Остатки подозрительной пищи изымаются и подвергаются бактериологическому исследованию. Специфическая профилактика проводится с помощью ботулинического полианатоксина (трианатоксина, содержащего анатоксины типов А, В, Е) в составе секстанатоксина, который кроме ботулинических анатоксинов содержит анатоксины Cl. perfringens, Cl. novyi и Cl. tetani. Иммунизация трехкратная. Последующие однократные ревакцинации проводят через каждые 5 лет. Для специфической профилактики применяют также тетраанатоксин очищенный адсорбированный жидкий, формирующий иммунитет против ботулизма и столбняка продолжительностью не менее 5 лет. Этот препарат представляет собой смесь адсорбированных на геле гидроокиси алюминия ботулинических анатоксинов типов А, В, Е и столбнячного анатоксина (рисунок 28). Курс иммунизации состоит из 3 прививок. Одна доза тетраанатоксина (1 мл) содержит 5 ЕС анатоксина типа А, по 3 ЕС анатоксинов типов В и Е и 2,5 ЕС столбнячного анатоксина. Одна доза трианатоксина (1 мл) содержит 5 ЕС анатоксина типа А и по 3 ЕС анатоксинов типов В и Е. Активная иммунизация осуществляется лицам, имеющим контакт с ботулиническим токсином (работники медицинских предприятий, исследовательских лабораторий). Для установления напряженности иммунитета после вакцинации разработан метод иммуноферментного определения титров противоботулинических антител типа А в сыворотке крови. Наличие антител регистрируют в сыворотке крови в титре 1:400 – 1:3200 после второго введения препарата. Вопрос 20. Этиология дифтерии. Свойства возбудителя. Патогенез заболевания. Микробиологическая диагностика. Иммунитет. Специфическая терапия и специфическая профилактика. Дифтерия - это острое инфекционное заболевание, характеризующееся общей интоксикацией организма и образованием в месте входных ворот инфекции пленчатых налетов беловато-серого цвета. Название заболевания происходит от греч. diphthera - пленка, перепонка, кожа. Образование плотной пленки, спаянной с подлежащими тканями, характерно для этого заболевания. Дифтерия относится к антропонозным инфекциям. Таксономическое положение возбудителя. Возбудитель дифтерии относится к типу Actinobacteria, классу Actinobacteria, порядку Corynebacteriales, семейству Corynebacteriaceae, роду Corynebacterium, виду Corynebacterium diphtheriae токсигенный штамм. Название микроба происходит от греч. koryne - булава, bacteria - палочка, diphthera - пленка. Морфологические и тинкториальные свойства. C. diphtheriae – прямая или слегка изогнутая палочка, которая имеет вздутия на концах и напоминает булаву или гантели. После деления клетки коринебактерий не расходятся, а располагаются в мазках под углом, напоминая латинские буквы L, X, V, Y или растопыренные пальцы рук, иероглифы. Возбудитель дифтерии обладает полиморфизмом: в препаратах могут встречаться нитевидные, ветвящиеся, кокковидные, дрожжеподобные формы. Дифтерийные палочки неподвижные, спор не образуют, имеют микрокапсулу и пили. Коринебактерии дифтерии легко окрашиваются анилиновыми красителями. По Граму они окрашиваются в фиолетовый цвет, то есть являются грамположительными. При окраске препаратов щелочным метиленовым синим или по методу Нейссера на полюсах коринебактерий обнаруживаются зерна волютина (зерна Бабеша-Эрнста). Количество зерен волютина у дифтерийной палочки не превышает 6, непатогенные коринебактерии содержат 18-20 зерен. По химической природе волютин представляет собой полиметафосфаты, которые служат для микробной клетки запасными питательными веществами. При окраске по Граму зерна волютина не выявляются. При использовании щелочного метиленового синего тело клетки окрашивается в голубой цвет, а зерна волютина – в темно-синий (темно-бордовый) или черный цвет. Метод Нейссера предусматривает окраску препарата уксуснокислым метиленовым синим и везувином. При этом способе зерна волютина окрашиваются в черный (темно-коричневый) цвет, а тело клетки – в желто-коричневый цвет. Полиморфизм C. diphtheriae, взаимное расположение клеток, наличие зерен волютина по полюсам являются дифференциально-диагностическими признаками и используются при идентификации возбудителя. При люминесцентной микроскопии зерна волютина окрашиваются корифосфином в оранжево-красный цвет, в то время как тела бактерий - в желтозеленый цвет. По строению клеточной стенки коринебактерии отличаются от других грамположительных бактерий. В состав клеточной стенки возбудителя дифтерии входят специфичные только для коринебактерий липиды: эфиры коринемиколовой и коринемиколиновой кислот, димиколат трегалозы, фосфатиды маннозы и инозита (фосфатидилинозитол-маннозит). Миколовые кислоты являются фактором жгутообразования (корд-фактором) коринебактерий. Наличие липидов обусловливает скопление клеток в препарате (мазке). Клеточная стенка содержит также пептидогликан и арабиногалактан – полимеры полисахаридной природы. Поверхностная белковая структура C. diphtheriae представляет собой капсульную субстанцию – микрокапсулу. Слой миколовых кислот и гликолипидов пронизан пориноподобными белками, образующими каналы. В микрокапсуле располагаются пили (фимбрии). У C. diphtheriae выделяют три типа пилей, различающихся по структуре: SpaA, SpaD, SpaH. Геном C. diphtheriae представлен кольцевой молекулой ДНК. Некоторые штаммы C. diphtheriae содержат плазмиды в виде кольцевых молекул ДНК. Плазмиды детерминируют синтез белков. В составе бактериальной хромосомы имеется нуклеотидная последовательность гена tox (1683 п.о.), привнесенная бактериофагом. Указанная нуклеотидная последовательность полностью идентичная у коринефагов β, γ и ω. Культуральные свойства. Коринебактерии - факультативные анаэробы, хорошо растут в аэробных условиях. Оптимальная температура роста - 35-37ºС. Возбудитель дифтерии не растет на простых питательных средах, так как не продуцирует протеазы, расщепляющие белки до аминокислот. Коринебактерии усваивают аминокислоты только из продуктов гидролиза белков, поэтому питательные среды для выращивания таких бактерий должны содержать аминокислоты. Кроме того в состав питательных сред должны входить органические источники энергии, соли магния, кальция, витамины, кровь или сыворотка крови животных, теллурит калия. Элективными средами для выращивания C. diphtheriae являются: -свернутая кровяная сыворотка (среда Ру); -сыворотка с добавлением сахарного бульона (среда Ру-Лёффлера); -кровяной агар (КА); -кровяной теллуритовый агар (среда Клауберга II); -теллурит-шоколадный агар Маклеода; -хинозольная среда Бучина; -цистин-теллурит-сывороточная среда Тинсдаля-Садыковой. На этих средах рост коринебактерий отмечается уже через 10-12 часов. На кровяном агаре возбудитель дифтерии формирует мелкие серо-белые колонии, а на кровяных теллуритовых средах колонии окрашены в темно-серый или черный цвет. Высокие концентрации теллурита калия подавляют рост посторонних микроорганизмов, не оказывая влияния на C. diphtheriae. Колонии возбудителя дифтерии на средах с теллуритом окрашиваются в темно-серый или черный цвет в результате восстановления теллурита до металлического теллура, который накапливается внутри бактерий в виде кристаллов. На среде Бучина (представляет собой смесь сухих компонентов из расчета г/л: питательный бульон сухой – 30,6, Д-глюкоза – 15,0, натрия хлорид – 5,0, водный голубой – 0,25, агар микробиологический – 8,0±1,0, Сода кальцинированная – 0,4, 8-оксихинолин сернокислый (хинозол) – 0,015) через 24-48 часов C. diphtheriae образует колонии синего цвета и на месте колоний среда также приобретает фиолетовый цвет. На среде Тинсдаля-Садыковой C. diphtheriae образуют серые или темно- коричневые колонии, окруженные темно-коричневым ореолом. В настоящее время для выявления коринебактерий широко используется специальная питательная среда – коринебакагар. Эта среда содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, стимулятор роста, натрия хлорид, глюкозу и агар. Перед использованием в среду добавляют теллурит калия. На этой среде коринебактерии образуют шероховатые колонии темно-серого цвета со складчатой поверхностью и неровными изрезанными краями (вид “маргаритки”) или темно-серые (серовато-черные) блестящие гладкие колонии с ровными краями. В бульоне рост коринебактерий проявляется либо в виде равномерного помутнения, либо бульон остается прозрачным, а на его поверхности образуется нежная пленка, которая постепенно утолщается, крошится и хлопьями оседает на дно пробирки. Биохимическая активность. Возбудитель дифтерии обладает высокой ферментативной активностью. Все штаммы C. diphtheriae ферментируют глюкозу, мальтозу, галактозу с образованием кислоты и не разлагают сахарозу, лактозу и маннит. Возбудитель дифтерии восстанавливает с помощью нитратредуктазы нитриты в нитраты (за исключением биовара belfanti), не продуцирует уреазу, не проявляет протеолитической активности. При идентификации выделенных культур используют следующие биохимические особенности возбудителя дифтерии: -ферментация глюкозы, галактозы и мальтозы до кислоты; -отсутствие ферментации сахарозы, лактозы, маннита; -отсутствие разложения мочевины - отрицательная проба Закса – исходный желтый цвет среды с мочевиной и феноловым красным при выращивании дифтерийного микроба в течение 30 минут при 37ОС не меняется, а при наличии уреазы бульон окрашивался бы в красный цвет. Уреазу продуцируют ложнодифтерийные палочки Гофмана и некоторые непатогенные коринебактерии. - наличие цистиназы - положительная проба Пизу – почернение столбика сывороточного агара (образование коричневого облачка по ходу укола) в результате образования сернистого свинца. Сернистый свинец появляется при взаимодействии присутствующего в среде уксуснокислого свинца с сероводородом, выделяющимся при расщеплении цистина цистиназой возбудителя дифтерии. Наличие цистиназы можно обнаружить также по образованию коричневых ореолов вокруг колоний на цистин-теллурит-сывороточной среде Тинсдаля-Садыковой. Представленные признаки позволяют отличать токсигенные коринебактерии от условно-патогенных видов, которые часто встречаются на слизистых оболочках глаз и носоглотки. Биовары возбудителя. По совокупности культуральных и биохимических свойств возбудитель дифтерии подразделяется на биовары: -gravis - грубый; -mitis - тонкий, легкий; -intermedius - промежуточный. Иногда выделяют биовар belfanti, который в настоящее время признается разновидностью биовара mitis. Биовары различаются между собой по форме колоний на средах с теллуритом, характеру роста в жидких средах, гемолитической активности, ферментации углеводов и морфологии клеток. |