Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Биовар gravis на плотных теллуритовых средах образует сухие сероваточерные плоские радиально исчерченные колонии R-формы диаметром 2-3 мм. Радиальная исчерченность придает колониям вид “маргаритки”. В жидких средах биовар gravis растет в виде пленки на поверхности и зернистого осадка, жидкость остается прозрачной. Этот биовар не вызывает гемолиза, ферментирует глюкозу, мальтозу, крахмал, гликоген. Клетки этого биовара короткие, содержат единичные зерна волютина. Биовар mitis образует мелкие (1-2 мм) гладкие блестящие черные колонии с ровными краями (S-форма), в бульоне вызывает равномерное помутнение и порошкообразный осадок. Обладает гемолитической активностью разлагает глюкозу и мальтозу. Палочки этого биовара длинные, изогнутые, содержат несколько зерен волютина. Биовар intermedius образует круглые гладкие блестящие (S-форма) или шероховатые колонии с изрезанными краями (R-форма) диаметром менее 1 мм. Клетки этого биовара самые крупные, с бочковидными очертаниями. Этот биовар ферментируют глюкозу, мальтозу, гликоген.
Первоначально распределение дифтерийных бактерий на биовары основывалось на тяжести течения дифтерии. Например, биовар gravis чаще выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии и вызывает групповые вспышки. Биовар mitis вызывает более легкие случаи заболевания, возникающие спорадически. Биовар intermedius занимает промежуточное положение между ними. Однако не все биохимические признаки у биоваров одинаково стабильны. Наиболее стабильным признаком возбудителя дифтерии является тест на ферментацию крахмала. По этому показателю возбудитель дифтерии подразделяется на два биовара: gravis (ферментирует крахмал) и mitis (не ферментирует крахмал). Антигенная структура. C. diphtheriae содержит соматический термостабильный О-антиген липидно-полисахаридной природы и поверхностный термолабильный К-антиген белковой природы. О-антиген обусловливает родовую специфичность, а К-антиген – типовую специфичность. По особенностям К-антигена выделяют 58 сероваров, в том числе у биовара gravis 14 сероваров, у биовара mitis – 40 сероваров, у биовара intermedius – 4 серовара. Для определения серовара применяют развернутую реакцию агглютинации с типовыми неадсорбированными дифтерийными агглютинирующими сыворотками. За рубежом принята классификация дифтерийных бактерий по антигенной структуре, включающая 5 серологических вариантов (I-V). В России используется серологическая классификация, по которой различают 11 серологических вариантов дифтерийных бактерий. Семь сероваров (1-7) встречаются наиболее часто, а 4 серовара (8-11) выделяются редко. Серовары 1, 2, 3, 4, 5 и 7 относятся к биовару gravis, а серовары 6, 8, 9, 10 и 11 - к биовару mitis. Недостатком серотипирования является способность многих нетоксигенных штаммов к спонтанной агглютинации. Фаготипирование. Для внутривидовой идентификации C. diphtheriae применяют фаготипирование с помощью набора из 9 коринефагов (А, В, С, D, F, G, Н, I, К). Факторы патогенности. Основными факторами патогенности возбудителя дифтерии являются дифтерийный экзотоксин, гиалуронидаза, нейраминидаза, микрокапсула (К-антиген), миколовые кислоты и пили. Пили и микрокапсула возбудителя дифтерии способствуют адгезии бактерий на клетках организма в месте входных ворот инфекции. Каждый тип пилей (SpaA, SpaD, SpaH) взаимодействует с соответствующими рецепторами эпителиальных клеток, что позволяет возбудителю дифтерии колонизировать различные виды слизистых оболочек. Кроме фимбрий в процессе адгезии C. diphtheriae участвуют поверхностные белки PS1 и PS2. Адгезия возбудителя с участием пилей происходит по типу замка – молнии: вначале с рецепторами клетки связываются концы пилей, затем – боковые субъединицы от верхушки до основания пилей, а в заключении – белковые молекулы на клеточной стенке коринебактерий. В результате этого обеспечивается тесный контакт микробной клетки с клеткой макроорганизма. Нейраминидаза (сиалидаза) отщепляет от различных гликопротеинов, гликолипидов и олигосахаридов сиаловые кислоты. Под влиянием этого фермента повреждаются мембраны клеток. Гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав основного межклеточного вещества соединительной ткани. В результате этого повышается проницаемость кровеносных сосудов, происходит выход плазмы и отек окружающих тканей. Вышедший из сосудов фибриноген контактирует с тромбокиназой некротизированных клеток и превращается в фибрин, который в виде пленок откладывается в месте входных ворот инфекции. Главным фактором патогенности дифтерийного микроба является дифтерийный экзотоксин - один из наиболее сильных биологических ядов. Летальная доза дифтерийного токсина составляет 0,5 мг/кг массы тела. Дифтерийный экзотоксин образуется как на питательных средах, так и в организме человека. Он синтезируется в виде неактивного предшественника (протоксина), который представляет собой полипептидную цепь с молекулярной массой 58,36 кД. Под действием протеаз полипептидная молекула расщепляется на две субъединицы (А и В). Субъединица А представляет собой С-домен (каталитический домен), а субъединица В состоит из Т-домена (трансмембранного или транспортного домена) и R-домена (рецепторного или рецепторсвязывающего домена). Субъединицы А и В объединены между собой дисульфидными связями. Субъединица В распознает специфический рецептор на поверхности эукариотической клетки и связывается с ним R-доменом. Рецептором для дифтерийного токсина является рецептор предшественника гепарин-связывающего фактора роста клеток (heparin binding epidermal growth factor-like precursor, НВEGF). Затем связанный с мебраной токсин подвергается рецептор-опосредованному эндоцитозу. В эндосоме субъединица А удерживается дисульфидной связью с субъединицей В. При снижении рН Т-домен формирует внутримембранный транспортный канал для транслокации С-домена в цитозоль клетки. Субъединица А проникает по каналу в цитозоль эукариотической клетки, и С-домен катализирует реакцию АДФ-рибозилирования фактора элонгации EF-2, который участвует в построении полипептидных молекул на рибосомах эукариотических клеток. В результате этого синтез белка в клетке останавливается, и эукариотическая клетка погибает. Прокариотические клетки нечувствительны к действию дифтерийного токсина, так как они в процессе белкового синтеза используют другой фактор элонгации (EF-6). Переход нетоксигенных штаммов коринебактерий в токсигенные осуществляется путем заражения нетоксигенного штамма умеренным бактериофагом в процессе фаговой конверсии Конверсия нетоксигенного штамма в токсигенный может происходить как in vivo, так и in vitro. Утрата клеткой профага или мутации в tox-опероне делают клетку нетоксигенной. Дифтериеподобный токсин обнаружен также у C. pseudotuberculosis и C. ulcerans. Эпидемиология. В естественных условиях к дифтерии восприимчив только человек. К действию дифтерийного токсина чувствительны некоторые виды животных (кролики, морские свинки, обезьяны). Источником инфекции является больной человек или бактерионоситель. Носители токсигенных штаммов защищены от токсина антитоксическими антителами, поэтому они не болеют дифтерией, но служат источником инфекции. Больные заразны с появления первых признаков болезни до выздоровления. Особенно опасны больные стертыми, атипичными формами дифтерии. Длительность носительства составляет в среднем 2-3 недели, в 9-25% случаев носительство продолжается более месяца. Бактерионосители являются резервуаром токсигенных штаммов C. diphtheriae, так как для них терапия антибиотиками не всегда является эффективной. Это связывают со способностью возбудителя дифтерии формировать биопленки. Образованию биопленок способствуют некоторые компоненты клеточной стенки C. diphtheriae (ацетилглюкозамин, ацетилгалактозамин, маннозо-подобные кислотные остатки и др.). Эти компоненты осуществляют “якорную” функцию и инициируют образование биопленки. Основной механизм заражения – аэрогенный. Основной путь передачи инфекции - воздушно-капельный. Возможен воздушно-пылевой путь передачи инфекции. Микробы выделяются в окружающую среду больными или бактерионосителями при разговоре, кашле или чихании. Вместе с воздухом микробные клетки попадают на слизистые оболочки ротоглотки и верхних дыхательных путей здоровых людей. Возможно также проникновение возбудителя в организм контактно-бытовым (предметным) и алиментарным (через молоко) путями. Контактно-бытовым путем возбудитель передается через предметы общего пользования (полотенца, игрушки, носовые платки). Попадание возбудителя в молоко, где он активно размножается, обусловливает алиментарный путь передачи инфекции. Патогенез. Входными воротами для возбудителя дифтерии являются слизистые оболочки верхних дыхательных путей (миндалины, зев, носоглотка, гортань, трахея), реже - конъюнктива глаз, кожа наружного слухового прохода, раневая поверхность кожи, слизистая половых органов. В месте входных ворот происходит адгезия возбудителя, его размножение и синтез дифтерийного токсина. В результате этого наблюдается некроз эпителия, выход фибриногена из сосудистого русла, превращение фибриногена в фибрин под влиянием тромбокиназы (фактора свертывания крови III или тканевого тромбопластина), освобождающейся при некрозе эпителиальных клеток. Образовавшиеся нити фибрина вместе с некротизированным эпителием, эритроцитами, лейкоцитами и размножившимися бактериями формируют фибринозную пленку. На слизистых оболочках с многослойным плоским эпителием (ротоглотка, надгортанник, голосовые связки, некоторые отделы полости носа) возникает дифтеритическое воспаление. В этих участках все клетки прочно связаны как между собой, так и с подлежащей соединительнотканной основой, поэтому фибринозная пленка также плотно спаяна с подлежащей тканью и не снимается тампоном (дифтеритическая пленка). При попытке снятия такой пленки обнажается кровоточащая поверхность. На слизистых оболочках, покрытых однослойным цилиндрическим эпителием (гортань, трахея, бронхи), возникает крупозное воспаление. В этих местах пленка рыхло связана с подлежащей тканью и легко от нее отделяется (крупозная пленка). При крупозном воспалении поврежденные ткани, содержащие микробные клетки, легко отторгаются. Больные с крупозным воспалением часто откашливают отторгнутые ткани в виде слепков различных отделов дыхательных путей. При распространении процесса из ротоглотки вниз по дыхательным путям последовательно поражаются трахея и бронхи. В результате отека и отслоения крупозной пленки со слизистой трахеи может развиться дифтерийный круп (шотл. croup - каркать) – асфиксия, возникающая при закупорке респираторного тракта. Дифтерийный или истинный круп характеризуется крупозным воспалением слизистой оболочки гортани и трахеи. В дисфоническую стадию развития крупа наблюдается нарастающая осиплость голоса, “лающий” кашель. Затем появляются симптомы стеноза верхних дыхательных путей (шумное дыхание, напряжение дыхательной мускулатуры). В асфиксическую стадию процесса может наступить удушье в результате закрытия просвета дыхательных путей отеком или пленкой. Дифтерия является токсинемической инфекцией, при которой возбудитель остается в месте входных ворот, а основные клинические проявления заболевания связаны с действием экзотоксина, проникающего в кровь. Наиболее часто при токсинемии поражаются миокард, нервная ткань, надпочечники и почки. В этих органах развивается дегенерация паренхимы, некроз, обширные кровоизлияния. Клиническая картина дифтерии. Различают следующие периоды болезни: - инкубационный период (от 2 до 10 дней, в среднем 5-7 суток); -период манифестных проявлений и ранних токсических осложнений (5- 10 суток); -период поздних токсических осложнений (до 6 недель); -период реконвалесценции (2-3 месяца). Начало заболевания в легких случаях постепенное, при тяжелом течении - острое. Температура тела повышается до 38-40°С. Наиболее часто развивается дифтерия зева. В месте входных ворот инфекции отмечается гиперемия, отек слизистой оболочки и пленка серовато-белого цвета. Пленка содержит большое количество клеток возбудителя. Наличие пленки является характерным признаком дифтерии. При локализации процесса в зеве увеличиваются региональные (шейные) лимфатические узлы, в области шеи развивается выраженный отек мягких тканей - симптом “бычья шея”. Иммунитет. После переболевания дифтерией формируется пожизненный напряженный антитоксический иммунитет. В 5-6% случаев все же возможно повторное заболевание. Диагностика дифтерии. Лабораторную диагностику дифтерии проводят согласно МУК 4.2.3065-13. Бактериоскопическое исследование при дифтерии проводится редко, так как эффективность этого метода очень низкая в связи с возможностью обнаружения в мазках коринебактерий – представителей нормальной микробиоты. Например, в носоглотке часто обнаруживается C. pseudodiphtheriticum (палочка Хофмана), а на слизистой оболочке глаз - C. xerosis. Бактериологическое (культуральное) исследование предусматривает выделение чистой культуры на элективных питательных средах и изучение ее биохимических свойств. Особое внимание уделяется пробе Пизу на цистиназу, пробе Закса на уреазу, изучению ферментативной активности с использованием укороченного пестрого ряда (глюкоза, сахароза, крахмал). В обязательном порядке проводится определение токсигенности выделенных чистых культур. Серологические методы диагностики являются ретроспективными. Бактериологическое исследование проводят в следующих случаях: -диагностическое обследование детей и взрослых с острыми воспалительными явлениями в области зева, носа и носоглотки, особенно при подозрении на дифтерию; -обследование по эпидемическим показаниям детей и взрослых, бывших в контакте с источником инфекции; -выявление возможных бактерионосителей среди лиц, вновь поступающих в детские дома, школы-интернаты. Исследуемый материал. В качестве исследуемого материала используют слизь и пленки из очагов воспаления. Сбор материала необходимо проводить в течение 3-4 часов (не позже 12 часов) с момента обращения больного. Для взятия материала используют сухие ватные тампоны (если посев будет проведен не позднее 2-3 часов после сбора материала) или тампоны, предварительно смоченные 5% раствором глицерина (при транспортировке материала на дальние расстояния). Материал для исследования берут отдельными тампонами из ротоглотки (с миндалин) и из носа. Отбор материала следует проводить не ранее чем через 2 часа после еды. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, кожная рана) материал берут с пораженных участков, а также с миндалин и из носа. При наличии налетов материал берут с границы пораженных и здоровых тканей. Посев материала необходимо провести не позднее чем через 3 часа после его взятия. Схема микробиологического исследования при дифтерии: 1 день: -бактериоскопическое исследование (окраска мазков корифосфином, по Граму и Нейссеру); -посев исследуемого материала на одну из рекомендованных плотных питательных сред. 2 день: -определение характера роста культур, микроскопия мазков, приготовленных спосевов и окрашенных по Граму и Нейссеру; -посев из отдельных колоний на среду для определения токсигенности (посев из половины колонии); -посев на скошенный сывороточный агар для получения чистой культуры (посев из другой половины колонии). 3 день: -посев чистой культуры на укороченный пестрый ряд (глюкоза, сахароза, крахмал); -посев чистой культуры для выявления гемолиза, цистиназы (проба Пизу) и уреазы (проба Закса); -постановка реакции агглютинации. 4 день: -учет результатов; -выдача заключения о выделении токсигенных или нетоксигенных коринебактерий. Окончательный ответ о наличии токсигенных бактерий выдается через 48-72 часа. Окончательный ответ по биохимическим свойствам нетоксигенных бактерий выдается через 72-96 часов. Для определения токсигенности выделенной культуры (реакция преципитации в геле, тест иммунодиффузии Илека или Элека) полоску фильтровальной бумаги смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой и помещают на поверхность питательной среды в чашке Петри. Испытуемые культуры высевают бляшками или штрихами по обе стороны от полоски. На одну чашку высевают несколько штаммов, один из которых является заведомо токсигенным (из коллекции лаборатории) и служит контролем. Чашки с посевами инкубируют при 37ОС, результаты учитывают через 24-48 часов. В результате встречной диффузии антитоксина и токсина на месте их взаимодействия образуется четкая полоса преципитации в виде полукруглой линии или “усов”. В настоящее время для выявления токсигенных дифтерийных бактерий используют следующие методы: -иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием меченых пероксидазой или щелочной фосфатазой антитоксических антител; -тест с иммунохроматографическими полосками (ICS), на которые нанесены антитоксические антитела, меченые коллоидным золотом; -полимеразная цепная реакция (ПЦР) для непосредственного обнаружения tox-оперона. | |||||||||||||||||||||||||||