Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Серологические реакции. Реакция агглютинации (РА) используется в качестве метода ретроспективной диагностики, а также для обнаружения антител в сыворотке крови привитых людей. Для постановки реакции агглютинации используют коммерческий диагностикум туляремийный жидкий для РА. Для определения титра антител используется эритроцитарный туляремийный антигенный диагностикум, а для выявления антигенов – диагностикум эритроцитарный туляремийный иммуноглобулиновый. Антитела в крови больных появляются на 10-15 день заболевания в титре 1:50-1:100, а в последующем нарастают до титра 1:400-1:800. Диагностическим титром считается 1:100 и выше. Для подтверждения заболевания обязательно должно выявляться нарастание титра антител. У привитых против туляремии лиц антитела обнаруживаются через 2-3 недели после вакцинации, затем нарастают до титра 1:160-1:320, в последующем незначительно снижаются и сохраняются в течение 5-7 лет. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) является более чувствительной, чем реакция агглютинации. Она используется как для ранней, так и для ретроспективной диагностики, а также с целью определения иммунологического состояния привитых лиц. У больных туляремией антитела обнаруживаются через 1-2 недели после заболевания, через 1-1,5 месяца их титр достигает максимальных показателей (1:10000-1:20000), после чего титр антител снижается и длительное время сохраняется на уровне 1:100-1:200. У привитых лиц количество антител повышается через 1-1,5 месяца до титра 1:2000-1:5000, а затем снижается и сохраняется в течение нескольких лет на уровне 1:20-1:80. РПГА проводят с эритроцитами, сенсибилизированными туляремийным антигеном (диагностикум эритроцитарный туляремийный антигенный жидкий). Для диагностики туляремии и определения состояния иммунитета у вакцинированных используют иммуноферментный анализ (ИФА). Этот метод позволяет обнаруживать специфические антитела через 6-10 дней после заболевания. Для постановки ИФА применяют иммуноферментную диагностическую тест-систему. Выявление туляремийных антител происходит за счет взаимодействия антигена туляремийного микроба, адсорбированного на носителе (планшете), с туляремийными антителами сыворотки крови. Образовавшийся комплекс “антиген+антитело” выявляют с помощью конъюгата и субстрата (конъюгат - антиглобулиновые антитела, меченые ферментом; субстрат или хромоген – соединение, изменяющее окраску под действием фермента). Для раннего выявления туляремии или ретроспективной диагностики ставят кожную аллергическую пробу с тулярином, так как состояние аллергии возникает рано (на 3-5 день болезни) и сохраняется длительное время (несколько лет). Аллергическая проба проводится внутрикожно (для ранней диагностики туляремии) или накожно (для определения иммунитета у привитых лиц). Для внутрикожной пробы используют тулярин (аллерген туляремийный), представляющий собой взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70ОС в течение 1 часа. Взвесь готовят на 3% глицерине. В 1 мл препарата содержится 500 млн. убитых бактерий. Препарат выпускается в ампулах, содержащих 1 мл взвеси (10 человеко-доз). Вводится 0,1 мл (100 млн. микробных клеток) препарата строго внутрикожно в области предплечья. Результаты учитываются через 24-48 часов. Положительная реакция проявляется формированием инфильтрата (уплотнения) и гиперемии диаметром не менее 0,5 см. Положительная аллергическая проба отмечается во время болезни, у переболевших лиц, а также у привитых против туляремии. Для определения иммунитета у привитых против туляремии лиц применяют накожный тулярин, который содержит в 1 мл 10 млрд. убитых бактерий (20 человеко-доз). Каплю препарата наносят на кожу в области плеча и стерильным скарификатором производится две насечки. Затем тулярин тщательно втирают в насечки. Учет результатов проводится через 48-72 часа. Положительная реакция проявляется отечностью кожи вокруг насечек и гиперемией диаметром не менее 0,5 см. При наличии противопоказаний к применению тулярина (повышенная сенсибилизация) используют метод аллергодиагностики in vitro – реакцию лейкоцитолиза (РЛ). Эта реакция основана на учете степени разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического аллергена (антигена). РЛ становится положительной через 3-4 дня после заболевания (вакцинации) и сохраняется в течение многих лет. В качестве одного из методов диагностики туляремии у человека используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), направленная на обнаружение в патологическом материале ДНК возбудителя. Для проведения этого исследования выпускаются комплекты реагентов для амплификации ДНК и последующей электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле. Профилактика туляремии осуществляется в соответствии с Санитарноэпидемиологическими правилами СП 3.1.7.2642-10. Для специфической профилактики туляремии применяют живую ослабленную вакцину, разработанную в 1946 г. Н.А. Гайским и Б.Я. Эльбертом на основе штамма №15 НИИЭГ. Вакцина выпускается в сухом вид. Вакцинация людей живой туляремийной вакциной приводит к формированию специфического и длительного гуморального и клеточного иммунитета. Такой же иммунитет формируется и у людей, переболевших туляремией. В1956 г. культура штамма F. tularensis 15 НИИЭГ была передана в США. При посеве культуры было получено 2 типа колоний – голубые и серые. В дальнейшем на основе голубых колоний был получен вакцинный штамм LVS (Live Vaccine Strain). Внастоящее время для приготовления вакцин против туляремии используются 2 штамма: в России – штамм F. tularensis 15 НИИЭГ, в США и странах Западной Европы – штамм F. tularensis LVS. Вакцина на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ применяется накожно и внутрикожно. Прививкам подлежит население, проживающее на энзоотичных по туляремии территориях. Ежегодно в России против туляремии прививают более 1,5 млн. человек. В частности, в 2012 г. было вакцинировано 275559 человек и ревакцинировано 1240626 человек. В целях профилактики туляремии важное значение имеет контроль за природными очагами инфекции, истребление грызунов и переносчиков, охрана источников водоснабжения, складских помещений, жилищ от грызунов. При мониторинге за природными очагами туляремии проводят выделение культур возбудителя или выявление туляремийного антигена в объектах внешней среды. Обязательно периодически производится анализ заболеваемости людей туляремией, прогнозирование эпизоотической и эпидемической ситуации, обоснование объемов проведения профилактических мероприятий. Лечение. Для лечения туляремии применяют антибиотики (стрептомицин, гентамицин, амикацин, нетилмицин, тетрациклин, доксициклин, левомицетин, рифампицин). Стрептомицин назначают по 1,0 г в сутки в течение 8-10 дней, тетрациклин – по 2,0 г в сутки, доксициклин – 0,2 г в сутки, левомицетин – 2-2,5 г в сутки, канамицин – по 0,5 г 4 раза в сутки, сизомицин – по 0,1 г 3 раза в сутки. Курс лечения антибиотиками продолжают до 5-7 дня нормальной температуры тела. Наряду с антибиотиками используют дезинтоксикационные средства, антигистаминные и противовоспалительные препараты, витамины. Вопрос 14. Этиология сибирской язвы. Свойства возбудителя. Заболевания у человека. Иммунитет. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и специфическая терапия. Сибирская язва (антракс) – остро протекающая опасная инфекционная болезнь, характеризующаяся тяжелой интоксикацией организма, лихорадкой, септицемией, возникновением карбункулов, поражением кишечника и реже – легких. Это одна из опасных инфекционных болезней, общих для животных и человека (зооантропоноз). Таксономическое положение. Возбудитель сибирской язвы относится к домену Bacteria, типу Firmicutes, классу Bacilli, порядку Bacillales, семейству Bacillaceae, роду Bacillus, виду Bacillus anthracis. Морфологические и тинкториальные свойства. Возбудитель сибирской язвы представляет собой крупную неподвижную палочку. Микроб встречается в трех формах: -вегетативная бескапсульная палочка; -вегетативная капсульная палочка; -спора. Вегетативные бескапсульные клетки образуются на простых питательных средах и представляют собой крупные неподвижные палочки с обрубленными слегка утолщенными концами. Палочки располагаются в виде цепочках, напоминая “бамбуковую трость”. Цепочки могут быть как короткими, так и длинными. Вегетативные клетки по Граму окрашиваются положительно. Вегетативные капсульные клетки сибиреязвенного микроба образуются в организме человека и животных, а также на специальных питательных средах в определенных условиях культивирования (сывороточный или бикарбонатный агар, атмосфера углекислого газа). В этих условиях возбудитель продуцирует хорошо выраженную капсулу, которая зачастую является общей для всех клеток, входящих в состав цепочки. Капсулу образуют только вирулентные штаммы возбудителя. Вакцинные штаммы капсулу не синтезируют. Для выявления капсулы мазки окрашивают специальными методами: по Ребигеру, метиленовой синькой Леффлера, тушью по Бурри-Гинсу, по Романовскому-Гимзе и другими. Споры образуются только при неблагоприятных условиях: во внешней среде при доступе кислорода воздуха или на питательных средах при длительном инкубировании в аэробных условиях. При этом в вегетативных клетках образуются центрально расположенные овальные споры. Поперечник спор не превышает поперечного размера вегетативной клетки. При доступе кислорода при температуре 12-42ОС споры образуются в течение 6-8 часов, на плотных питательных средах при температуре 34-36ОС они формируются через 4 суток. В каждой вегетативной клетке образуется только одна эндоспора, располагающаяся центрально, реже – субтерминально. При температуре ниже 12ОС и выше 42ОС, а также в живом организме или невскрытом трупе споры не образуются. После образования спор цитоплазма клетки лизируется, клеточная стенка разрывается, а спора выходит наружу. Для окраски спор используют методы Ауески (Ожешки), Пешкова, Циля Нильсена. При окраске по Цилю-Нильсену вегетативные клетки окрашиваются в синий (фиолетовый) цвет, а споры - в красный. Культуральные свойства. По способу дыхания сибиреязвенный микроб относится к факультативным анаэробам. Температурный оптимум 34-37ОС, рН 7,2- 7,5. Возбудитель сибирской язвы хорошо растет на обычных питательных средах (МПБ, МПА, МПЖ). На МПА уже через 24 часа инкубирования возбудитель образует крупные шероховатые матовые колонии R-формы сероватого или серовато-белого цвет. R-форма колоний на МПА характерна для вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы. Такие колонии образованы бескапсульными вегетативными клетками. При малом увеличении край колонии имеет мелковолокнистую структуру и волнистые очертания, так как он представлен переплетающимися цепочками клеток. В результате этого край колоний сравнивают с локонами волос, гривой льва или головой Медузы Горгоны. На специальных питательных средах (сывороточный агар, бикарбонатный агар, жидкая среда ГКИ) в атмосфере углекислого газа возбудитель сибирской язвы через 1-2 суток инкубирования образует крупные гладкие выпуклые колонии S- формы слизистой консистенции, состоящие из вегетативных капсульных клеток. На 3-5%-ном кровяном агаре образуются шероховатые нежные колонии R- формы диаметром 3-4 мм без зоны гемолиза. При посеве уколом в столбик 10-12%-ной мясо-пептонной желатины (10 - 12%) через 2-3 дня отмечается протеолитическая активность сибиреязвенного микроба, в результате чего наблюдается рост культуры в виде уменьшающихся книзу белых поперечных тяжей (вид “перевернутой или опрокинутой елочки”). Через 3-5 дней наблюдается разжижение желатина в виде воронки. В МПБ возбудитель сибирской язвы через 24 часа выращивания образует нежный осадок в виде комочка ваты, среда остается прозрачной. При встряхивании бульон не мутнеет, осадок разбивается на мелкие хлопья, что является одним из характерных признаков сибиреязвенного микроба. При выращивании в течение 3 часов на агаре или в бульоне с пенициллином (0,05-0,5 ЕД/мл) сибиреязвенный микроб образует цепочки, состоящие из шарообразных клеток. Этот феномен называется “жемчужным ожерельем” (напоминает жемчужное ожерелье как по форме, так и окраске клеток) и широко используется при дифференциации возбудителя сибирской язвы от близкородственных бацилл. Подобное явление объясняется тем, что пенициллин вызывает нарушение процесса синтеза элементов клеточной стенки, в результате чего клетки преобразуются в сферопласты, лишенные части клеточных оболочек. Сибиреязвенный микроб обладает выраженной биохимической активностью. Он ферментирует до кислоты лактозу, глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу и другие сахара. Образует сероводород и аммиак. Гидролизует крахмал. Пептонизирует и медленно свертывает молоко. Антигенная структура. У возбудителя сибирской язвы различают клеточные антигены и антигены – продукты метаболизма: 1. Капсульный белковый антиген – К-антиген представлен полипептидами, соединенными с молекулами Д-глутаминовой кислоты. 2.Соматический полисахаридный ST-антиген клеточной стенки. Этот антиген содержит N-ацетил-D-глюкозамин с Д-галактозой. На обнаружении этого антигена основана реакция термопреципитации по Асколи. 3.Белковый экзотоксин, состоящий из трех компонентов: протективного антигена (ПА), летального фактора (ЛФ) и фактора отека или эдематогенного фактора (ФО). Основными факторами патогенности сибиреязвенного микроба являются капсула и трехкомпонентный экзотоксин. Капсула сибиреязвенного микроба синтезируется при прорастании спор в восприимчивом организме (или на специальных питательных средах) и защищает образующиеся вегетативные клетки от фагоцитоза. Синтез капсулы определяется генами (capA, capB, capC), расположенными на плазмиде рХО2. Экзотоксин сибиреязвенного микроба имеет белковую природу. Он состоит из трех компонентов: фактора отека или эдематогенного фактора (ФО), летального фактора (ЛФ) и протективного антигена (ПА). Экзотоксин синтезируют как капсульные, так и бескапсульные клетки сибиреязвенного микроба. По-отдельности компоненты токсина не оказывают токсического действия. Фактор отека и летальный фактор проникают в чувствительные клетки только с помощью протективного антигена. Эдематогенный (отечный) фактор вызывает при совместном введении с протективным антигеном у лабораторных животных местную воспалительную реакцию – отек и разрушение тканей. Летальный фактор сам по себе тоже нетоксичен, но в смеси с протективным антигеном вызывает гибель белых крыс, белых мышей и морских свинок. Протективный антиген является носителем защитных свойств, обладает выраженным иммуногенным действием. В чистом виде ПА нетоксичен. В настоящее время он используется в качестве основного компонента химической вакцины. Все три компонента токсина составляют смесь, оказывающую одновременное отечное и летальное действие на организм. Именно совместное воздействие ПА, ФО и ЛФ обусловливают характерные симптомы патологического процесса при сибирской язве. Синтез сибиреязвенного токсина определяется генами (cya, pag, lef), локализованными на плазмиде рХО1. Эпидемиология. Сибирская язва – антропозоонозное заболевание. Среди животных наиболее восприимчивы травоядные. Заболеваемость человека носит выраженный профессиональный характер (сельскохозяйственные рабочие, работники перерабатывающих предприятий, скотобоен). Ежегодно в мире регистрируют около 1 млн. случаев сибирской язвы у животных и 25-100 тыс. случаев заболевания у людей. Сибирская язва распространена повсеместно, особенно в районах с развитым животноводством. Резервуаром для сибиреязвенного микроба является инфицированная почва, в которой сибиреязвенный микроб сохраняется в споровой форме. На территории России учтено более 30 тыс. неблагополучных населенных пунктов. Животные заражаются при заглатывании спор с частичками почвы во время выпаса или при поедании загрязнённых спорами кормов. У животных преобладают кишечная и септическая формы заболевания. Сибирской язвой болеют козы, овцы, коровы, лошади, олени и другие виды животных. Домашние свиньи менее восприимчивы к сибирской язве. К тому же у свиней сибирская язва протекает в виде локальной формы, поражая в основном заглоточные лимфатические узлы. Как правило, животные заболевают сибирской язвой при пастбищном содержании. Источником инфекции для человека являются больные животные (крупный рогатый скот, лошади, свиньи, олени, овцы и др.), инфицированные продукты питания и сырье, полученное от больных животных. Возможно также заражение человека через инфицированную почву или загрязненные инфицированной почвой предметы. Больные животные выделяют бациллы с фекалиями, мочой, слюной, кровянистым отделяемым. Особенно много микробов в кровянистой пенистой жидкости, вытекающей из естественных отверстий агонизирующих животных в последние минуты жизни и в первые часы после смерти. Возбудитель выделяется от животных как с явно выраженной клиникой болезни, так и со стертыми клиническими формами (скрыто больные животные и бациллоносители). Например, у овец-бациллоносителей установлено бацилловыделение с молоком, мочой, слюной, фекалиями в течение 1 месяца, а у коров – в течение 9-11 месяцев. Возбудитель попадает на объекты внешней среды также во время прирезки больных животных, при снятии шкур, разделке туши. Факторами передачи возбудителя кроме больных и погибших животных могут быть источники водоснабжения, загрязненные сточными водами кожевенных заводов, забойных пунктов, предприятий, перерабатывающих животное сырье, корма животного происхождения (мясокостная мука, кровяная и мясная мука), инфицированные предметы ухода за животными, бытовые вещи. Например, в литературе описаны случаи заражения ребенка от куклы, изготовленной из контаминированной овечьей шерсти, заражение мужчины после пользования кисточкой для бритья. Самым опасным фактором передачи возбудителя является труп погибшего животного. Все его органы и ткани содержат очень большое количество бацилл (существует выражение “органы нафаршированы бациллами”). Вскрытие таких трупов недопустимо. Доступ атмосферного воздуха, происходящий даже при нарушении кожного покрова, обусловливает массовое образование спор возбудителя и обсеменение ими почвы и других объектов внешней среды. |