Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Почва является не только фактором передачи сибиреязвенного микроба, но и резервуаром возбудителя сибирской язвы. С длительным сохранением спор в почве связано наличие многочисленных неблагополучных пунктов. Например, в районах Поволжья и Урала в настоящее время насчитывается свыше 6,5 тысяч почвенных сибиреязвенных очагов. Большую эпидемическую опасность представляют скотомогильники, особенно те, которые содержатся в неудовлетворительном состоянии. Пути заражения человека сибирской язвой – контактно-бытовой (уход за больными животными, переработка шерсти, шкур, кож, земляные работы), алиментарный (употребление в пищу мяса больных животных), воздушнопылевой (вдыхание спор). Человек заражается при уходе за больными животными, во время убоя больного животного, при переработке животного сырья, при употреблении инфицированного мяса или других продуктов животноводства. Входные ворота – поврежденная кожа, слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей. От человека к человеку возбудитель не передается, однако при уходе за больным человеком предпринимаются необходимые меры предосторожности. Патогенез. Входными воротами для возбудителя сибирской язвы в большинстве случаев служит поврежденная кожа, даже имеющая микроповреждения (порезы, ссадины). Значительно реже входными воротами являются слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей. Возбудитель сибирской язвы является высокоинвазивным микробом, который быстро размножается в организме человека и распространяется лимфогенно и гематогенно. После попадания в организм человека споры сибиреязвенного микроба фагоцитируются и с макрофагами проникают в глубокие слои дермы или в регионарные лимфатические узлы, где прорастают и превращаются в вегетативные клетки. Выживание прорастающих спор в макрофагах обеспечивается присутствием плазмиды рХО1. В процессе дальнейшего размножения вегетативных клеток синтезируются токсин и капсула. Синтез токсина способствует переходу прорастающих клеток из фагосомы в цитоплазму. Синтез капсулы вегетативными клетками начинается в макрофаге, что способствует быстрому выходу вегетативных клеток из макрофагов. Капсула защищает вышедшие из макрофагов вегетативные клетки от последующего фагоцитоза. Вначале протективный антиген связывается на поверхности эукариотической клетки. Затем протеаза клетки-мишени (фурин) расщепляет протективный антиген на 2 фрагмента: один фрагмент с молекулярной массой 20 кД (ПА20) и другой фрагмент с молекулярной массой 63 кД (ПА63). После этого фрагмент с молекулярной массой 63 кД формирует гептамер и связывается с другими компонентами токсина (ЛФ или ФО), образуя летальный (ПА+ЛФ) или отечный (ПА+ФО) токсины. Поэтому в настоящее время принято говорить о двух сибиреязвенных токсина – отечном (ФО + ПА) и летальном (ЛФ + ПА), в которых эффекторную функцию выполняют ФО и ЛФ, а акцепторная и интернализирующая функция принадлежит ПА. Эти токсины эндоцитозом проникают внутрь клетки. Летальный токсин (ПА+ЛФ) вызывает внутри клетки продуцирование активных форм кислорода, что приводит к деструкции и гибели клетки. В свою очередь смесь ПА с ФО (отечный токсин, зависимая от кальмодулина аденилатциклаза), проникая внутрь клетки, активируется внутриклеточным белком – кальмодулином, в результате чего в клетках значительно повышается уровень циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Это повышение цАМФ приводит к увеличению проницаемости клеток, образованию отеков и подавлению функции нейтрофилов. На месте внедрения возбудителя через поврежденную кожу возникает сибиреязвенный карбункул в виде очага серозно-геморрагического воспаления с некрозом, отеком прилегающих тканей и регионарным лимфаденитом. При гистологическом исследовании обнаруживаются некроз, полнокровие, кровоизлияния и студенистый отек. При ингаляционном попадании возбудителя в организм споры проникают непосредственно в альвеолы вместе с частицами пыли диаметром менее 5 мкм. Затем споры поглощаются альвеолярными макрофагами и переносятся ими в лимфатические узлы средостения, где прорастают. В результате этого возникают геморрагический некроз лимфатических узлов и геморрагический медиастинит. Выход возбудителя в кровь (бактериемия) приводит к генерализации процесса и развитию сепсиса. В случае алиментарного инфицирования споры частично разрушаются в желудке, а частично попадают в кишечник, где прорастают в лимфатических образованиях тонкой кишки. В дальнейшем возбудитель проникает в кровь и наступает генерализация процесса. Морфологически сибиреязвенный сепсис проявляется серозно-геморрагическим воспалением. При аутопсии в крови, лимфатических узлах и во внутренних органах обнаруживается большое количество B. anthracis. Клиника сибирской язвы. Инкубационный период при сибирской язве в зависимости от формы заболевания продолжается от нескольких часов до 6-8 дней (чаще – 2-3 дня). Различают следующие формы заболевания: -кожная (наружная) форма (геморрагически-некротическое воспаление глубоких слоев дермы - карбункул) – до 95-98% случаев, летальность не превышает 10%; -висцеральная (внутренняя) форма (легочная, кишечная и септическая разновидности) – 2-5% случаев, летальность до 100%. При кожной форме в месте входных ворот инфекции сначала появляется красноватое пятно, быстро трансформирующееся в папулу медно-красного цвета. Через несколько часов на месте папулы образуется везикула (пузырек) диаметром 2-3 мм; её содержимое сначала имеет серозный характер, затем становится тёмным, кровянистым. Из-за сильного зуда больные часто срывают эпидермис, либо он лопается сам, и на месте везикулы образуется струп черного цвета. Струп окружает инфильтрат в виде багрового вала и студневидный отек, охватывающий большие участки. По характерной клинической картине этого периода болезнь имела название “углевик”. В последующем под струпом формируется гранулирующая поверхность и рубцевание. Стадии развития карбункула: пятно – папула – везикула – пустула – язва. Кожная форма сибирской язвы может протекать в виде множественных карбункулов, которые часто сопровождаются сильным отеком прилегающих тканей. При этом вокруг зудящей папулы возникают дочерние везикулы. Наиболее часто кожная форма сибирской язвы развивается на открытых участках тела – руках, лице, шее. Однако карбункулы могут возникать и на других участках тела - на нижних конечностях, туловище. Развитие карбункула в области глаз иногда называют глазной формой сибирской язвы. Легочная форма сибирской язвы развивается при ингаляции спор и часто носит профессиональный характер (“болезнь сортировщиков шерсти”, “болезнь тряпичников”). Она имеет короткий инкубационный период (около суток), острое начало: резкий подъем температуры, пневмония, отек легких, сердечная недостаточность. Смерть больного наступает на 2-3 сутки. Диагноз ставится чаще всего на вскрытии. При вскрытии находят увеличенную дряблую селезенку. На разрезе селезенка темно-вишневого, почти черного цвета. Особенно характерно для легочной формы развитие геморрагического менингоэнцефалита. Мягкие мозговые оболочки отечны, пропитаны кровью, имеют темно-красный цвет (“красный чепец” или “шапочка кардинала”). Микроскопически обнаруживают серозногеморрагическое воспаление оболочек и ткани мозга с разрушением стенок мелких сосудов и скоплением в просвете сосудов клеток возбудителя. В связи с отсутствием специфических патологоанатомических изменений со стороны легких во многих странах выделяют не легочную форму сибирской язвы, а ингаляционную сибирскую язву, подчеркивая путь заражения человека. Кишечная форма сибирской язвы также имеет острое начало: повышение температуры тела, рвота с примесью крови, диарея с примесью крови, боли в эпигастральной области. Затем отмечается прогрессирующая сердечная недостаточность. Смерть больного наступает через 3-4 суток. Иммунитет. Формируется гуморальный антитоксический иммунитет по реакции гиперчувствительности замедленного типа (4 тип). Диагностика сибирской язвы. Материал для исследования: - от больных людей - содержимое карбункула или язвы, струп, кровь, моча, мокрота, спинномозговая жидкость, испражнения, рвотные массы. При патологоанатомическом исследовании забирают кровь, экссудаты, кусочки органов или целые органы. По эпидемиологическим показаниям исследуют материал от животных, почву, фураж, воду, продовольственное сырье и продукты животного происхождения, кожевенное сырье (шерсть, щетину, волос, шкуры). Исследования проводят в лаборатории особо опасных инфекций. Забор материала у больных производится до начала лечения с соблюдением правил асептики. От животных в лабораторию направляют ухо или кровь из уха. Взятие материала из сырья животного происхождения и из объектов внешней среды проводится в тех случаях, когда необходимо установить источник инфекции или фактор передачи возбудителя человеку; для выяснения обсемененности возбудителем сибирской язвы отдельных мест и объектов; в целях выяснения наличия возбудителя сибирской язвы в местах старых скотомогильников при проведении мелиоративных и гидротехнических работ. Пробы из объектов внешней среды для освобождения от посторонней микрофлоры подвергают прогреванию при температуре 80ОС в течение 20 минут. Пробы, содержащие вегетативные клетки возбудителя (материал от больного человека или животных), прогреванию не подвергают. Бактериоскопическое исследование проводится для выявления в исследуемом материале возбудителя. При этом используются разные методы окраски: окраска по Граму – для выявления вегетативных клеток, окраска по БурриГинсу, Ребигеру, Михину, Ольту, Гинсу, Романовскому-Гимзе, синькой Лёффлера – для обнаружения капсулы, окраска по Ожешке – для обнаружения спор, сибиреязвенной люминесцирующей сывороткой (антисоматической или антиспоровой, в зависимости от вида пробы) – для выявления возбудителя. Исследование на подвижность проводят микроскопическим методом раздавленной (подвешенной) капли или макроскопическим методом на агаре (0,2- 0,3%-ного). Посев ставят на 24 часа в термостат. Возбудитель сибирской язвы неподвижен. РИФ с сибиреязвенной люминесцирующей сывороткой является дополнительным методом экспресс-диагностики сибирской язвы. Для люминесцентной микроскопии мазки готовят из патологического материала, непосредственно из подозрительных колоний, из материала, взятого от биопробных животных. На высохшие и фиксированные мазки наносят сибиреязвенные люминесцирующие адсорбированные иммуноглобулины (люминесцентная споровая сыворотка, соматическая, капсульно-соматическая). Этим методом можно выявить в пробах сибиреязвенные микробы в споровой или вегетативной форме. При наличии в пробе вегетативных клеток выявляются палочки с ободком, светящимся зеленоватым светом. Обнаружение в мазке из материала от больного (трупа) крупных грамположительных палочек, окруженных капсулой, позволяет поставить предварительный диагноз сибирской язвы. Бактериологическое исследование направлено на выделение чистой культуры и ее идентификацию для окончательного подтверждения диагноза. Для посева исследуемого материала используют МПА и МПБ. Пробы, контаминированные посторонней микрофлорой, высевают на питательные среды с полимиксином В, лизоцимом, ЭДТА и ацетатом таллия. Посевы инкубируют при 36-37ОС в течение 18-24 часов. Для выделения чистой культуры, особенно из загрязненного материала, используют также лабораторных животных (морских свинок, белых мышей). Исследуемый материал вводится подкожно (морским свинкам – в паховую область, белым мышам – в корень хвоста). Мышам вводят по 0,2-0,5 мл, свинкам – по 0,5-1,0 мл. Морские свинки обычно погибают через 2-4 суток, а белые мыши – через 1-2 суток. При наличии сибиреязвенного микроба у лабораторных животных отмечается характерная патологоанатомическая картина: отек в месте введения материала, темная не свернувшаяся кровь, кровоизлияния в клетчатке, рыхлая селезенка. В мазках-отпечатках из внутренних органов и в препаратах, приготовленных из крови, обнаруживаются грамположительные палочки, окруженные капсулой. Чистую культуру пересевают на скошенный МПА и инкубируют при температуре 37ОС в течение 4 суток для получения споровой культуры. Идентификацию выделенной культуры проводят на основании изучения характера роста микроба на питательных средах, подвижности, капсулообразующей способности, теста жемчужного ожерелья, чувствительности к бактериофагу. Дополнительно определяют лецитиназную, фосфатазную и гемолитическую активность культуры. Капсулообразующую способность изучают на МПА с 0,7% бикарбоната натрия, на МПА с сывороткой крови крупного рогатого скота. Посевы инкубируют в течение 24-48 часов при 37ОС в атмосфере 5-10% углекислого газа (в микроанаэростате или эксикаторе). Посевы культуры для выявления капсулы можно производить в жидкую среду ГКИ (инактивированная сыворотка крови в растворе Хенкса). В сомнительных случаях капсулообразование выявляют путем заражения лабораторных животных. Через 1-2 часа животных забивают, из перитонеальной жидкости и крови готовят мазки, а из селезенки и печени – мазки-отпечатки. Препараты окрашивают для выявления капсулы и микроскопируют. Лецитиназную активность проверяют на агаре с добавлением куриного желтка или в жидкой желточной среде. Сибиреязвенный микроб не свертывает желток в жидкой среде в течение нескольких суток. При росте на плотной среде вокруг колоний сибиреязвенного микроба мутная белая зона не образуется, так как возбудитель сибирской язвы не обладает лецитиназной активностью. Фосфатазную активность проверяют на питательном агаре, содержащем фенолфталеинфосфат натрия. Посевы на этой среде инкубируют при 37ОС в течение 18-24 часов. Перед просмотром посевов в крышку чашки вносят раствор аммиака и через 1 минуту учитывают результаты. Под действием паров аммиака происходит окрашивание в розовый цвет колоний микроорганизмов, обладающих фосфатазной активностью. Сибиреязвенный микроб фосфатазной активностью не обладает, поэтому его колонии остаются бесцветными. Гемолитическую активность проверяют при посеве исследуемой культуры на кровяной агар (3-5%) или в бульон с кровью. Результаты учитывают через 16-20 часов инкубирования посевов в термостате при 37ОС. Возбудитель сибирской язвы гемолитической активностью не обладает, поэтому вокруг колоний зоны гемолиза не образуется. Сибиреязвенный микроб лизируется специфическими бактериофагами (Гамма-фаг, К-ВИЭВ, Саратов, ВА-9 и другие). Проба с бактериофагами проводится на плотной питательной среде путем нанесения капли суспензии бактериофага на предварительно высеянную культуру. Можно использовать также метод стекающей капли, при котором после нанесения капли суспензии бактериофага чашку наклоняют. Капля суспензии бактериофага при этом стекает по поверхности агара. Результат исследования в виде стерильного пятна или фаговой дорожки (отсутствие роста культуры) обнаруживается через 18-24 часа инкубирования при температуре 36ОС. Серодиагностика проводится в тех случаях, когда возбудитель сибирской язвы не обнаруживается в исследуемом материале. Для определения антител в сыворотке крови больного применяют реакцию латексной агглютинации или РПГА с протективным сибиреязвенным антигеном. Сибиреязвенные антигены можно выявлять в РИФ, ИФА, РСК, РНГА, РП в геле и в реакции термопреципитации по Асколи. Реакция термопреципитации по Асколи чаще всего используется для выявления сибиреязвенного возбудителя или соматического полисахаридного антигена в различных субстратах (кожевенном сырье, изделиях из кожи и шерсти, мясе, почве, испражнениях). Эта реакция позволяет определять наличие сибиреязвенного антигена как в свежем, так и в разложившемся сырье или мумифицированных трупах животного. Эту реакцию разработал в 1902 г. итальянский врач и иммунолог Альберто Асколи для выявления возбудителя в кожевенном сырье. Она позволяет обнаружить антигены возбудителя при отрицательных результатах бактериологического исследования. Компонентами этой реакции являются экстракт исследуемого материала и преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Перед постановкой реакции свежий материал предварительно выдерживают в термостате в течение 18-20 часов. Несвежий материал экстрагируют без выдерживания в термостате. Для приготовления экстракта материал заливают физиологическим раствором, кипятят в течение 10-45 минут и фильтруют. Иммунную преципитирующую сыворотку (0,2-0,3 мл) вносят в специальную узкую преципитационную пробирку и на нее осторожно наслаивают равное количество исследуемого экстракта. На границе соприкосновения компонентов в течение 1-5 минут образуется мутное кольцо преципитации белого цвета, что расценивается как положительный результат. Биологическая проба. Для постановки биологической пробы используют белых мышей, морских свинок, кроликов. Заражение лабораторных животных исходным материалом является обязательным этапом диагностики. Исследуемый материал вводится подкожно. Гибель зараженных животных наступает через 1-3 суток. Павших животных вскрывают, делают мазки-отпечатки их тканей и органов и посевы на МПА. При вскрытии животных отмечается характерный для сибиреязвенной инфекции студенистый геморрагический отек подкожной клетчатки в месте введения материала, гиперемия внутренних органов, увеличение селезенки и несвернувшаяся кровь. В мазках обнаруживаются сибиреязвенные бациллы в виде коротких цепочек, окруженных капсулой. В посевах вырастают типичные для сибиреязвенного микроба шероховатые колонии. Аллергологическое исследование. Для ретроспективной диагностики сибирской язвы используется кожная аллергическая проба с антраксином. Реакцию разработал Эль Наумович Шляхов (1920 – 2005 гг.). Антраксин вводят внутрикожно в ладонную поверхность предплечья в объеме 0,1 мл. Результат учитывают через 24-48 часов. Пробу считают положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм. Положительная проба с антраксином сохраняется длительное время после переболевания, что позволяет использовать эту реакцию для ретроспективной диагностики заболевания. Сроки исследования: -микроскопического – в день поступления материала; -бактериологического – до 3 суток; -биологического – до 10 суток. В настоящее время разработаны новые методы диагностики сибирской язвы: -люминесцентно-серологический метод при помощи системы фагфлуоресцентный антифаг (основан на использовании явления специфической адсорбции частиц сибиреязвенного индикаторного бактериофага на клетках чувствительного гомологичного микроба, специфической реакции их с антифаговой флуоресцирующей сывороткой и на последующем выявлении возбудителя путем люминесцентной микроскопии); -твердофазный иммуноферментный метод (позволяет обнаружить возбудителя сибирской язвы даже при наличии одной бациллы в 1 мл воды и 50 бацилл в 1 г зерна или сена); -серологическая реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) для выявления сибиреязвенных антител; -ПЦР – диагностика; -ПДАФ - метод (метод AFLP) - полиморфизм длины амплифицированного фрагмента, основанный на обнаружении локуса, специфичного для каждого штамма. |