ГФ №11, том 2. Общие методы анализа лекарственное растительное сырье редакционная коллегия
 Скачать 1.25 Mb.
|
|
для стандартного и испытуемого препаратов соответственно. _ SYс х 100 0,48 х 100 --------- = +/- ----------- = +/- 2,8%; _ Yс 17,0 _ SYи х 100 0,68 х 100 --------- = +/- ----------- = +/- 3,68%. _ Yи 18,5 Из расчетных данных видно, что эти величины меньше 5,7%. Следовательно, число проведенных опытов является достаточным и можно вести расчет дальше. Активность испытуемого препарата по отношению к стандартному образцу: 17,0 х 100 ---------- = 91%. 18,5 Различие средних: 18,5 - 17,0 = 1,5 мл/кг. Стандартную ошибку разности находят по формуле I.4.4 (ГФ XI, вып. 1, с. 212). ------------- _ _ / 7,06 + 13,72 s = SYс - Yи = +/- / ------------- = +/- 0,8 мл/кг. d \/ 12 - 2 Величина t при 12 - 2 = 10 равна 2,23 [см. таблицу значений t(Р, f); ГФ XI, вып. 1, с. 249]. Отсюда s х t = +/- 2,23 х 0,8 = +/- 1,78 мл/кг. d Поскольку разность средних (1,5 мл/кг) меньше величины s х t(1,78 мл/кг), а активность испытуемого препарата отличается d от активности стандартного образца на 9%, испытуемый препарат следует считать удовлетворяющим по своей активности предъявляемым требованиям. Определение активности испытуемого препарата в КЕД Для выражения активности испытуемого препарата в кошачьих единицах действия (КЕД) расчет проводят для каждого животного по формуле: К х m А = ------- а где К - разведение испытуемого препарата; m - масса животного в килограммах; а - доза разведенного препарата в миллилитрах. Из данных, полученных в опытах, выводят среднее число КЕД и вычисляют (в КЕД и процентах) отклонения результатов отдельных опытов от среднего числа КЕД. Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если найденное среднее отклонение от среднего числа КЕД будет меньше максимально допустимого отклонения для данного числа опытов, указанного в табл. 10. Таблица 10 Максимально допустимое отклонение отдельных опытов от их средней ------------------------------------------------------------------ |Число | Отклонение, % | Число | Отклонение, % | |опытов| | опытов | | |------+----------------------+------------+---------------------| | 3 | 9,4 | 7 | 16,3 | | 4 | 11,5 | 8 | 17,6 | | 5 | 13,3 | 9 | 18,9 | | 6 | 14,9 | 10 | 20,0 | ------------------------------------------------------------------ Из табл. 10 следует, что испытания можно проводить на 3 кошках (минимальное число опытов), но только в том случае, если полученное в опытах отклонение будет меньше 9,4%. В противном случае число опытов надо увеличить. Пример расчета. Определение числа КЕД для раствора строфантина К 0,05% для инъекций. -------------------------------------------------------------------- | N | Масса | Разведение | Доза,|Число КЕД| Отклонение | |п/п|животного,|раствора для| мл | | от средней | | | кг | инъекций | | |---------------------| | | | | | | КЕД | % | |---+----------+------------+------+---------+----------+----------| |1 | 2,63 | 1:50 | 37 | 3,55 | + 0,22 | + 6,6 | |2 | 2,56 | 1:50 | 39 | 3,28 | - 0,05 | - 1,5 | |3 | 2,22 | 1:50 | 35 | 3,17 | - 0,16 | - 4,8 | -------------------------------------------------------------------- Среднее число КЕД = 3,33. В. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ СЕРДЕЧНЫХ СРЕДСТВ НА ГОЛУБЯХ Отбор голубей и их содержание Для опытов отбирают беспородных здоровых голубей массой 280-400 г, находившихся в условиях лабораторного содержания в течение 5-7 сут. За 18-24 ч до начала опыта птиц лишают пищи, но не воды. Техника испытания и принцип расчета Опыт проводят под легким тиопентал - натриевым наркозом (35 мг/кг внутримышечно в лапку). Наркотизированных голубей привязывают к станку для мелких животных в положении на спине таким образом, чтобы голова голубя находилась ниже туловища (во избежание попадания в дыхательные пути слизи и рвотных масс). С внутренней стороны крыла удаляют перья, находят и отсепаровывают вену крыла. В вену вводят металлическую канюлю (затупленная инъекционная игла N 19-22), соединенную тонкой каучуковой трубкой с градуированной бюреткой вместимостью 5 мл, имеющей деления 0,05 мл. Бюретку предварительно наполняют раствором испытуемого препарата, приготовленным на 0,9% растворе натрия хлорида. Испытуемый раствор вводят отдельными дозами по 0,3 мл через каждые 5 мин до наступления остановки сердца голубя. Остановку сердца определяют по характерному изменению положения головы и шеи голубя и контролируют последующим вскрытием грудной клетки. Длительность опыта должна составлять не менее 65 и не более 95 мин. Голуби, смерть которых наступает в другие сроки, в расчет не принимаются. В течение опыта голубю вводят не менее 13 и не более 19 доз (0,3 мл) испытуемого раствора. Испытание обычно проводят на 6 голубях. Результаты опытов могут быть использованы для расчета биологической активности лишь в том случае, если в одной и той же серии опытов расхождение между максимальными и минимальными числами введенных доз не превышает 4, а общее число доз не выходит за установленные пределы (13-19). В противном случае увеличивают количество подопытных голубей или повторяют опыт с новой концентрацией испытуемого раствора. Оценку активности испытуемых препаратов можно проводить 2 способами: 1) по сравнению со стандартным образцом; 2) в голубиных единицах действия. Оценка активности испытуемого препарата по сравнению со стандартным образцом В опыт берут не менее 12 голубей - по 6 голубей для стандартного образца и испытуемого препарата. Данные, полученные при биологическом испытании стандартного образца, могут быть использованы для расчета и последующих опытов в течение 30 сут без повторного испытания. Из полученных в опыте со стандартным или испытуемым препаратом данных вычисляют величину смертельной дозы препарата для каждого голубя в миллилитрах на 1 кг массы. Результаты опытов подвергают статистической обработке аналогично результатам опытов на кошках. Пример расчета при обработке данных - по общей статье "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний" (ГФ XI, вып. 1, с. 199). ------------------------------------------------------------------ | | Стандартный образец | Испытуемый препарат | | |------------------------------+-----------------------------| | N | число | число | квадрат | число | число | квадрат | |п/п| доз | мл/кг | отклонений | доз | мл/кг |отклонений | | | | (Yc) | _ 2 | | (Yи) | _ 2 | | | | | (Yc - Yс) | | | (Yи - Yи) | |---+--------+--------+------------+-------+---------+-----------| |1 | 16 | 14,9 | 0,81 | 15 | 13,4 | 1,44 | |2 | 17 | 17,4 | 2,56 | 15 | 15,0 | 0,16 | |3 | 16 | 15,4 | 0,00 | 18 | 16,1 | 2,25 | |4 | 18 | 14,4 | 1,96 | 17 | 15,3 | 0,49 | |5 | 15 | 14,7 | 1,21 | 16 | 14,3 | 0,09 | |6 | 14 | 18,0 | 4,84 | 18 | 13,5 | 1,21 | ------------------------------------------------------------------ Активность испытуемого препарата по отношению к стандартному образцу: _ _ 2 _ 2 Y = 15,8; (Yс - Yс) = 11,38; Yи = 14,6; (Yи - Yи) = 5,64; ----------- _ / 11,38 ------ SYс = +/- /----------- = +/- / 0,379 = +/- 0,61 мл/кг; \/ 6 x (6 - 1) \/ ---------- _ / 5,64 ------ SYи = +/- /----------- = +/- / 0,188 = +/- 0,43 мл/кг; \/ 6 x (6 - 1) \/ SYс х 100 0,61 х 100 --------- = +/- ------------ = +/- 3,8%; _ Yс 15,8 _ SYи х 100 0,43 х 100 --------- = +/- ------------ = - 2,9%. Yи 14,6 15,8 х 100 ------------ = 108%. 14,6 Различие средних: 15,8 - 14,6 = 1,2 мл/кг. --------------------- / 11,38 + 5,64 12 s = +/- /-------------- х ----- = +/- 0,75 мл/кг. d \/ 12 - 2 36 Величина t при 12 - 2 = 10 равна 2,23 [см. таблицу значений t(P, f); ГФ XI, вып. 1, с. 249]. Отсюда s х t = 0,75 х 2,23 = 1,67 мл/кг. d Как видно из полученных данных, разность средних (1,2 мл/кг) меньше величины s х t(1,67 мл/кг), а активность испытуемого d препарата отличается от активности стандартного лишь на 8%. Следовательно, испытуемый препарат по своей активности удовлетворяет требованиям. Определение активности испытуемого препарата в ГЕД Для выражения активности испытуемого препарата в голубиных единицах действия (ГЕД) расчет проводят для каждого голубя по формуле: К х m А = ----- а где К - разведение испытуемого препарата; m - масса голубя в килограммах; а - доза разведенного препарата в миллилитрах. Из данных, полученных в опытах, выводят среднее число ГЕД и вычисляют в процентах отклонение отдельных опытов от среднего числа. Пример расчета. Определение числа ГЕД для строфантина К. ------------------------------------------------------------------ | N | Масса | Разведение| Число | Доза, |Число| Отклонение | |опыта| голубя,| гликозида |введений| мл | ГЕД | от средней, | | | кг | | (доз) | | | % | |-----+---------+-----------+--------+-------+-----+-------------| |1 | 0,335 | 1:60000 | 15 | 4,5 |4467 | 8,9 | |2 | 0,301 | 1:60000 | 15 | 4,5 |4013 | 2,1 | |3 | 0,335 | 1:60000 | 18 | 5,4 |3722 | 9,2 | |4 | 0,325 | 1:60000 | 17 | 5,1 |3823 | 6,8 | |5 | 0,332 | 1:60000 | 16 | 4,8 |4150 | 1,1 | |6 | 0,400 | 1:60000 | 18 | 5,4 |4445 | 8,3 | ------------------------------------------------------------------ Среднее число ГЕД = 4103. Сведения о требуемом содержании ЛЕД, КЕД и ГЕД в отдельных препаратах и растительном сырье, а также методики их определения приведены в соответствующих фармакопейных статьях. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНСУЛИНА Активность испытуемого препарата инсулина определяют путем сопоставления его гипогликемического (сахаропонижающего) действия с гипогликемическим действием стандартного образца инсулина. Стандартный образец и единица действия инсулина Стандартный образец инсулина представляет собой препарат высокоочищенного инсулина, активность которого определена путем многократного сопоставления с активностью международного стандарта и составляет не менее 25 ЕД в 1 мг. За единицу действия (ЕД) принимают специфическую активность количества массы стандартного образца, эквивалентного по биологическому действию 1 международной единице инсулина. Примечание. Приготовление растворов стандартного образца и испытуемого препарата инсулина. Точную навеску стандартного образца инсулина растворяют в растворе хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) с рН 2,7-3,0, содержащем консервант в такой же концентрации, как испытуемый препарат. Срок годности основного раствора стандартного образца инсулина 4 мес при температуре 4 град. С. Перед опытом основной раствор стандартного образца инсулина разводят раствором хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) до концентрации 1 ЕД в 1 мл. Испытуемый препарат инсулина разводят этим же раствором хлористоводородной кислоты до концентрации 1 ЕД в 1 мл, исходя из его предполагаемой активности. Метод определения биологической активности Определение биологической активности инсулина проводят на здоровых кроликах массой 2,5-3,5 кг. Животных массой 1,8-2,3 кг предварительно не менее 14 сут содержат в условиях вивария, где они получают овес, сено или свежую траву, корнеплоды, комбинированный корм и воду. По истечении этого срока определяют чувствительность кроликов к инсулину. Для этого кроликам дважды с интервалом 7-8 сут после 18 ч голодания вводят подкожно раствор стандартного образца инсулина из расчета 0,5 ЕД на 1 кг массы тела животного и определяют величину снижения концентрации сахара в крови в процентах. Кровь для исследования берут из краевой вены уха животных до введения инсулина и через 1,5 и 2,5 ч после его введения (для расчета берут среднюю концентрацию сахара в крови из двух определений после введения инсулина). Кровь берут в условиях, не допускающих чрезмерного волнения кроликов. Из опытов исключают животных с исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше пределов, установленных для используемого метода определения содержания сахара в крови (ниже 75 мг % и выше 120 мг % для феррицианидного метода, ниже 52 мг % и выше 94 мг % для глюкозооксидазного метода), а также тех животных, которые реагируют на введение инсулина судорогами или у которых снижение концентрации сахара в крови составляет менее 15% по отношению к исходной концентрации. Определение биологической активности инсулина проводят не ранее чем через 7-8 сут после испытания на чувствительность. Отобранных для опытов кроликов лишают корма (но не воды) на 18 ч, предшествующих введению инсулина. Животных распределяют на две группы способом случайного выбора (в каждой группе должно быть не менее 9 кроликов). Непосредственно перед введением инсулина кроликов взвешивают, и определяют исходную концентрацию сахара в крови. Кроликам одной группы вводят подкожно по 0,5 ЕД стандартного образца инсулина (S) на 1 кг массы тела, кроликам другой группы - такую же дозу испытуемого препарата инсулина (Т). Через 1,5 и 2,5 ч после введения инсулина у животных снова определяют концентрацию сахара в крови. Для каждого кролика рассчитывают снижение концентрации сахара (X) в крови в процентах по формуле: а - b Х = ------- х 100, а где а - исходная концентрация сахара в крови в миллиграмм - процентах; b - средняя концентрация сахара в крови в миллиграмм - процентах из двух определений, проведенных через 1,5 и 2,5 ч после введения инсулина. Как и при испытании кроликов на чувствительность к инсулину, при расчетах не учитывают животных с исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше пределов, установленных для используемого метода, а также реагирующих на указанную дозу инсулина судорогами или дающих снижение концентрации сахара в крови менее 15% по отношению к исходной концентрации. Через 3-5 сут на этих же кроликах проводят повторное испытание с той разницей, что животным из группы, получавшей стандартный образец инсулина (S), вводят испытуемый препарат инсулина (Т), а животным группы, получавшей (Т), вводят (S). Рассчитывают среднюю величину снижения концентрации сахара в крови на стандартный образец (%S) и на испытуемый препарат (%Т) по данным всего опыта. Отношение %T / %S выражает относительную активность (R) испытуемого препарата (Т). Для выражения активности испытуемого препарата (Т) в ЕД его предполагаемую активность (А) умножают на R: Т = R х A. Пример: при определении биологической активности инсулина для инъекций с предполагаемой активностью 40 ЕД в 1 мл получили следующие величины снижения концентрации сахара в крови в процентах (Y). Первая часть испытания Вторая часть испытания Ys Yт Yт Ys 49 48 50 50 61 50 58 51 35 48,5 53 41 55 65 55 55 39 46 39 45 28 22,5 68 60 53 15 38 43 38 48 44 60 50 63 44 56 869 SUM Ys = 869; %S = ----- = 48,28. 18 %Т 45,83 R = ----- = ------ = 0,949. %S 48,28 825 SUM Yт = 825; %Т = ----- = 45,83. 18 Активность Т в ЕД, по данным этого опыта, равна: Т = 0,949 х 40 = 37,96 ЕД в 1 мл. Определение проводят не менее 2 раз с каждым испытуемым образцом (Т). Среднюю величину при этом получают, объединяя индивидуальные цифры снижения концентрации сахара в крови в процентах в обоих опытах. При расчете окончательного результата должны быть использованы данные, полученные не менее чем на 30 кроликах. Если средняя величина R, по данным двух или большего числа опытов, будет меньше 0,85 или больше 1,15, испытание |