ГФ №11, том 2. Общие методы анализа лекарственное растительное сырье редакционная коллегия
 Скачать 1.25 Mb.
|
|
природы мази и растворов лекарственных средств в маслах. Наиболее часто применяют твин-80 в концентрации до 2,5%, не оказывающей антимикробного действия. 2. При испытании мазей, легко эмульгируемых в воде, эмульгатор не вносят в буферный раствор. 3. При испытании мазей и растворов в маслах предпочтительнее использовать метод мембранной фильтрации. Метод мембранной фильтрации. При определении стерильности лекарственных средств, обладающих выраженным антимикробным действием, и лекарственных средств, разлитых в емкости более 100 мл, используют метод мембранной фильтрации. При испытании лекарственных средств с антимикробным действием от каждой серии независимо от ее объема отбирают 30 емкостей (ампул, флаконов и др.), которые делят на 3 группы по 10 емкостей. Емкости двух групп (20 штук) используют для испытания на стерильность, третьей группы (10 штук) - для контроля полноты отмывания мембраны от лекарственного средства. Испытание лекарственного средства на стерильность проводят с использованием фильтрационной установки, включающей фильтродержатель, соединенный с колбой - приемником. Фильтродержатель состоит из воронки с крышкой и основания из пористой пластины, на которую помещают мембрану. Используют мембраны с размером пор 0,45 +/-0,02 мкм, диаметром около 47 мм. Испытания проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 см рт. ст.) при скорости вытекания воды 55-75 мл в 1 мин. Допускается использование аппарата, представляющего собой стерильную замкнутую систему и работающего также по принципу фильтрации растворов. Для фильтрации водных, масляных и спиртовых растворов рекомендуют использовать фильтры из эфиров целлюлозы или смесей эфиров целлюлозы. Фильтровальную установку в собранном виде стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении 0,11 +/- 0,02 МПа [(1,1 +/- 0,2) кгс/кв. см] и температуре (121 +/-1) град. С в течение 20 мин (температура и время критические). Стерилизацию можно осуществлять любым другим способом, обеспечивающим сохранность рабочих характеристик мембраны, а также стерильность мембраны и всей установки (ионизирующее излучение, окись этилена и т.п.). Испытуемое лекарственное средство растворяют или суспендируют (если в этом есть необходимость) в соответствующей стерильной жидкости и полученный раствор или суспензию пропускают через стерильную мембрану. Для растворения лекарственных средств с антимикробным действием и отмывания мембраны от них можно использовать любой растворитель, не подавляющий роста микроорганизмов, например, раствор натрия хлорида изотонического 0,9% для инъекций. Используемый растворитель перед стерилизацией необходимо профильтровать через мембраны с порами размером 0,45 +/-0,02 мкм для освобождения от механических примесей. Фильтрование отобранных образцов проводят в асептических условиях. Испытуемый раствор пропускают с помощью вакуума через одну или несколько мембран. При испытании лекарственных средств с антимикробным действием или содержащих консервант после окончания фильтрации мембрану необходимо промыть 3-5 порциями по 100 мл соответствующего растворителя, например растворам натрия хлорида изотонического 0,9% для инъекций или жидкости N 1 (см. с. 193), при испытании мазей - жидкости N 2 (см. с. 193). После отмывания мембраны ее извлекают, разрезают стерильными ножницами пополам и одну половину помещают в колбу со 100 мл тиогликолевой среды, вторую - в колбу со 100 мл среды Сабуро. Питательные среды с помещенными в них фильтрами выдерживают при температуре от 30 до 35 град. С (тиогликолевая среда) и от 20 до 25 град. С (среда Сабуро) в течение 7 суток при ежедневном просмотре. Для контроля стерильности растворов лекарственных средств, выпускаемых в виде порошков, лиофилизированных препаратов и пр., содержимое каждой емкости предварительно растворяют в стерильном растворителе. Затем из каждых 10 емкостей одной группы отбирают полученный раствор в количестве, соответствующем 200 мг лекарственного средства, и переносят в колбу, содержащую 100 мл аналогичного растворителя. Приготовленный раствор немедленно фильтруют. После отмывания фильтра, как указано выше, одну половину его помещают в колбу с тиогликолевой средой, вторую - в колбу со средой Сабуро. При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах от каждой из 10 емкостей отбирают по 100 мг препарата в колбу со 100 мл растворителя (изопропилмиристат и др.), который предварительно подогревают до температуры не выше 45 град. С и стерилизуют фильтрованием через мембраны с размером пор (0,22 +/- 0,02) мкм. После фильтрации образца мембрану промывают двумя - тремя порциями по 200 мл жидкости N 2 и затем одной - двумя порциями жидкости N 1. Половину мембраны помещают в тиогликолевую среду, другую - в среду Сабуро, в которые предварительно вносят стерильный твин-80 из расчета 1 г на 1000 мл среды. При испытании лекарственных средств, разлитых в емкости большого объема, через фильтры пропускают содержимое 5-10 емкостей, если объем каждой емкости составляет от 100 до 500 мл. При наличии в емкости более 500 мл раствора на стерильность испытывают по 500 мл содержимого каждой из 5- 10 емкостей на 2-3 мембранах. При испытании лекарственных средств, представляющих собой вязкую жидкость или медленно фильтрующиеся суспензии, необходимо предварительно добавить растворитель, указанный в частной статье, для увеличения скорости фильтрации. Контроль полноты отмывания фильтра (третья группа емкостей) проводят следующим образом: при испытании антибактериального лекарственного средства в колбу с тиогликолевой средой и погруженной в нее половиной фильтра вносят суточную культуру Staphylococcus aureus ATCC 6538 Р, при испытании противогрибкового лекарственного средства - в колбу со средой Сабуро и фильтром вносят 48-часовую культуру Candida albicans ATCC 885-653 из расчета 100 микробных клеток на весь объем среды. Инкубацию проводят при соответствующих температурах. Наличие роста тест - микроорганизмов в контрольных колбах через 48-72 ч свидетельствует о достаточной полноте отмывания мембран от антимикробного лекарственного средства. Для контроля стерильности условий, в которых проводят испытания, необходимо фильтровать растворитель без испытуемого лекарственного средства с последующим воспроизведением всех вышеописанных операций. Учет и интерпретация результатов испытания на стерильность. Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов в питательных средах оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и других макроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов необходимо подтвердить микроскопированием мазков, окрашенных по Граму. Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям испытания на стерильность при отсутствии роста микроорганизмов. При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке (колбе, флаконе) его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на таком же количестве образцов, как и в первый раз. При отсутствии роста микроорганизмов при повторном посеве испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованию испытания на стерильность. В случае роста микроорганизмов при повторном посеве, морфологически сходных с микроорганизмами, выявленными в первичном посеве, испытуемый препарат считают нестерильным. Если при повторном посеве наблюдается рост микроорганизмов, отличающихся по морфологии от первоначально выделенных, испытание повторяют в третий раз на удвоенном количестве образцов. При отсутствии роста микроорганизмов после инкубации посевов в третьем испытании испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям на стерильность. При наличии роста хотя бы в одной пробирке испытуемый препарат считают нестерильным. Питательные среды Для контроля стерильности применяют "Сухую питательную среду для контроля стерильности" (тиогликолевую) отечественного производства (ТУ 42.14 N 161-79) и среду Сабуро (жидкую). Вместо коммерческой тиогликолевой среды может быть использована тиогликолевая среда индивидуального приготовления. Состав и приготовление питательных сред. Тиогликолевая среда индивидуального приготовления: панкреатического гидролизата казеина 15,0 г дрожжевого экстракта (10%) 5,0 >> натрия хлорида 2,5 >> глюкозы 5,0 >> цистина (цистеина) 0,75 >> тиогликолевой кислоты или 0,3 мл тиогликолята натрия 0,5 г раствора резазурина натрия 1:1000 (свежеприготовленного) <*> 1,0 мл агара 0,75 г воды дистиллированной до 1000 мл рН после стерилизации 7,0 +/- 0,2 -------------------------------- <*> Допускается приготовление среды без резазурина натрия. Тиогликолевую среду можно хранить в течение 14 сут со дня приготовления при температуре от 10 до 25 град. С в защищенном от света месте. В случае, если при хранении среды, содержащей резазурин, верхний слой среды (более 1/3 объема) окрасится в розовый цвет, среду можно регенерировать нагреванием на кипящей водяной бане в течение 10-15 мин до исчезновения розовой окраски с последующим быстрым охлаждением. В случае, если окраска не исчезает после нагревания, среду считают непригодной к употреблению. Регенерацию среды можно проводить только один раз. Среда Сабуро: пептона ферментативного 10 г глюкозы 40 >> воды дистиллированной до 1000 мл рН после стерилизации 5,6 +/- 0,2 Обе среды стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении 0,11 +/-0,02 МПа (1,1 +/-0,2 кгс/кв. см) и при температуре (121 +/-1) град. С в течение 15 мин. Жидкость N 1: пептона ферментативного 1 г воды дистиллированной до 1000 мл рН после стерилизации 7,1 +/-0,2 Жидкость N 2: пептона ферментативного 5 г твина-80 10 г воды дистиллированной до 1000 мл рН после стерилизации 7,1 +/-0,2 Жидкости разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют так же, как и питательные среды. Требования к ростовым свойствам питательных сред. Тиогликолевая среда и среда Сабуро должны обеспечивать визуально обнаруживаемый рост соответствующих тест - штаммов аэробных и анаэробных бактерий и грибов (предусмотренных НТД). Используемые питательные среды должны обеспечивать рост микроорганизмов при посеве их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток: для тиогликолевой среды - не позднее 48 ч инкубации при температуре от 30 до 35 град. С и для среды Сабуро - не позднее 72 ч инкубации при температуре от 20 до 25 град. С. ИСПЫТАНИЕ НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ ЧИСТОТУ Лекарственные средства (таблетки, капсулы, гранулы, растворы, экстракты, сиропы, мази и др.), не стерилизуемые в процессе производства, могут быть контаминированы микроорганизмами и поэтому должны быть испытаны на микробиологическую чистоту. Таблица 13 Тест - микроорганизмы, используемые для определения антимикробного действия лекарственных средств и ростовых свойств питательных сред ------------------------------------------------------------------ | N по Каталогу | | | | штаммов | |Питательная | | Всесоюзного | Тест - штаммы | среда | |музея патогенных | | N | |бактерий ГИСК им.| | | | Л.А.Тарасевича | | | |-----------------+---------------------------------+------------| | 010011 |Bacillus subtilis ATCC 6633 | 1 | | 010014 |Bacillus cereus ATCC 10702 | 1 | | 240533 |Escherichia coli ATCC 25922 | 3 | | | | 6 | | | | 7 | | 190155 |Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 | 9 | | 201108 |Staphylococcus aureus ATCC 6538-P| 10 | | | | 8 | |-----------------+---------------------------------+------------| |N в коллекции | | | |патогенных | | | |грибов НИО | | | |глубоких микозов | | | |Ленинградского | | | |ГИДУВ | | | |-----------------+---------------------------------+------------| | 259 |Candida albicans ATCC 885-653 | 2 | ------------------------------------------------------------------ Испытание на микробиологическую чистоту включает количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а также выявление определенных видов микроорганизмов, наличие которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах. Испытание проводят в асептических условиях, применяя приведенные методы и питательные среды для контроля всех видов нестерильных лекарственных средств, а также сырья, используемого в их производстве. Лекарственные средства, обладающие антимикробным действием, и консерванты, входящие в состав некоторых нестерильных лекарственных средств, могут подавлять рост отдельных видов микроорганизмов в условиях проведения испытания. Во избежание неправильной оценки результатов испытания определяют действие лекарственного средства в отношении следующих тест - микроорганизмов: Bacillus subtilis (Bacillus cereus), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, указанных в табл. 13. Определение антимикробного действия лекарственного средства. Пять образцов лекарственного средства по 1 г (мл) каждый разводят в соотношении 1:10 фосфатным буферным раствором рН 7,0 (два образца), средой N 3 (один образец) и средой N 8 (два образца). Культуры Bacillus subtilis (Bacillus cereus), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus выращивают на жидкой среде N 1 при температуре от 30 до 35 град. С в течение 18-20 ч, культуру Candida albicans - на жидкой среде N 2 при температуре от 20 до 25 град. С в течение 48 ч. Культуры разводят 1:1000 стерильным 0,9% раствором натрия хлорида изотоническим, вносят по 1 мл взвеси каждого тест - штамма (в отдельности) в приготовленные образцы лекарственного средства в буферном растворе (Bacillus subtilis, Candida albicans), в среде N 3 (Escherichia coli) и в среде N 8 (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus). Для выявления микроорганизмов используют методы, приведенные в данной статье. В случае отсутствия роста тест - штаммов на соответствующих питательных средах отмечают антимикробное действие лекарственного средства. Для устранения антимикробного действия лекарственного средства используют различные методы: 1) увеличивают разведение лекарственного средства, взяв больший объем растворителя; 2) добавляют необходимое количество соответствующего специфического инактиватора, нейтрализующего антимикробное действие лекарственного средства, но не угнетающего рост микроорганизмов (например, пенициллиназу - для пенициллинов и цефалоспоринов, пара - аминобензойную кислоту - для сульфаниламидов); 3) комбинируют методы 1 и 2; 4) вводят неспецифические инактиваторы в питательные среды, нейтрализующие антимикробное действие лекарственного средства (например, 4% твина-80, 0,5% соевого лецитина); 5) если все вышеперечисленные методы неэффективны, а лекарственное средство растворимо, используют метод мембранной фильтрации; 6) если в связи с природой лекарственного средства нельзя использовать метод мембранной фильтрации, а все вышеперечисленные методы устранения его антимикробного действия в отношении данного тест - штамма неэффективны, этот вид испытания не проводят. Отбор и приготовление проб лекарственных средств для испытаний. От каждой серии лекарственного средства (независимо от ее объема) отбирают среднюю пробу не менее 50 г (мл), состоящую из равных разовых проб, взятых из минимум 10 разных упаковок. Для одного анализа лекарственного средства используют отдельные образцы по 10 г (мл) для каждого из описанных далее разделов исследования. Всего для проведения одного анализа используют 30 г (мл) лекарственного средства. В том случае, когда возникает необходимость подтвердить несомненность результатов, проводят повторное испытание только по данному разделу исследования, используя образец в количестве 10 г (мл). |