ГФ №11, том 2. Общие методы анализа лекарственное растительное сырье редакционная коллегия
 Скачать 1.25 Mb.
|
|
часть морды и в суставы передних и задних конечностей. Пинцетом захватывают кожу на груди и вырезают в ней прямоугольное отверстие. Вырезанный лоскут кожи откидывают в сторону. При этом становится отчетливо видимой грудина, просвечивающая через мышцы в виде белой пластины, напоминающей по форме песочные часы. Приподняв пинцетом грудину в узкой части, тонкими ножницами перерезают ее поперек выше и ниже места наложения пинцета, так что образуется узкое поперечное оконце, через которое видны дуги аорты и предсердия. Тонким (глазным) пинцетом проникают в разрез (осторожно, чтобы не поранить предсердия и крупные сосуды), слегка вытягивают сердечную сорочку и рассекают ее ножницами. Затем легкими надавливаниями на брюшко лягушки выводят сердце наружу. При препарировании следят за тем, чтобы через образованное отверстие не выступали наружу печень и легкие и чтобы сердце свободно помещалось на лишенном кожи участке, не прикасаясь к наружной поверхности кожи. В течение опыта обнаженное сердце каждые 15-20 мин смачивают 0,6% раствором натрия хлорида (наносят пипеткой 2-3 капли). Испытания на травяных лягушках следует проводить, вводя растворы в лимфатические бедренные мешки (под кожу), в сердце (в полость желудочка), на водяных - в сердце (в полость желудочка) или в вену; под кожу - только растворы, содержащие гликозиды ландыша. Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят одинаковые дозы испытуемого раствора. Препараты, подлежащие испытанию, предварительно разводят водой с таким расчетом, чтобы 0,3 или 0,4 мл испытуемого раствора соответствовали 1 ЛЕД. Для этого среднее количество единиц действия препарата умножают на количество миллилитров, соответствующее 1 ЛЕД. Например, в 1 мл раствора коргликона 0,06% для инъекций содержится в среднем 13,3 ЛЕД (13,3 х 0,3 = 3,99, т. е. разведение препарата 1:4). а) Метод испытания при введении под кожу. Растворы вводят шприцем с тонкой иглой в бедренные лимфатические мешки лягушек. Дозы, не превышающие 0,35 мл, вводят в одну конечность, большие дозы (но не более 0,7 мл) вводят равными частями в обе конечности. После введения раствора наблюдают за лягушками и определяют наименьшую дозу, вызывающую систолическую остановку сердца у большинства (3-4) из 5 лягушек данной группы в течение 1 ч, если испытывают сырье и препараты наперстянки, ландыша, горицвета, или в течение 2 ч, если испытывают сырье и препараты строфанта, желтушника. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, продолжают наблюдение еще 10 мин (при длительности наблюдения 1 ч) и учитывают также количество лягушек, у которых остановка сердца наступила в дополнительное время. Длительность систолической остановки сердца должна быть не менее 15 мин. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться ранее чем через 15 мин после остановки, в расчет не принимают. В протоколах опытов отмечают время введения препарата и результаты опытов для каждой лягушки в отдельности. Каждое отдельное испытание начинают с определения чувствительности данной партии лягушек к стандартному образцу. С этой целью нескольким группам лягушек по 5 животных в каждой вводят разные дозы стандартного образца: одной группе - дозу, соответствующую 1 ЛЕД (по 0,3 или 0,4 мл в зависимости от того, какой применяется стандарт), другим - на 0,05-0,1 мл больше. Находят наименьшую дозу стандартного образца, вызывающую остановку сердца у большинства (3-4) из 5 лягушек, и устанавливают таким образом чувствительность опытной партии лягушек по сравнению со стандартными лягушками. Затем в тех же условиях опыта группе из 5 лягушек той же партии вводят раствор испытуемого препарата в дозе, соответствующей найденной наименьшей дозе стандартного образца, и наблюдают за животными в течение 1 или 2 ч (в зависимости от того, какой препарат испытывается). Если в результате наблюдений будет установлено, что введенная доза недостаточна или слишком велика, дозу увеличивают или уменьшают, причем разница между дозами должна быть не более 0,1 мл. Опыты проводят до тех пор, пока не будет найдена наименьшая доза испытуемого препарата, вызывающая систолическую остановку сердца у большинства (3-4) из 5 лягушек. Далее рассчитывают содержание единиц действия в 1 мл, 1 г или 1 таблетке испытуемого препарата. Для сырья и препаратов наперстянки, ландыша, горицвета расчет проводят по формуле: В х К ---------, 0,3 х А где А - наименьшая доза в миллилитрах, установленная для раствора испытуемого препарата; В - наименьшая доза в миллилитрах, установленная для раствора стандартного образца; 0,3 - доза в миллилитрах, соответствующая 1 ЛЕД; К - число, обозначающее разведение испытуемого препарата. Для сырья и препаратов строфанта, желтушника расчет проводят по формуле: В х К --------- 0,4 х А б) Метод испытания при введении в полость желудочка сердца. Испытуемые растворы, предварительно освобожденные от избытка спирта (не должен превышать 10%) и летучих веществ, в соответствующем разведении вводят лягушкам непосредственно в полость желудочка сердца со скоростью 0,1 мл в 5 с, проколов его в момент диастолы тонкой иглой, соединенной со шприцем вместимостью 1 мл с двойной шкалой (деления 0,01-0,02 мл). Иглу вынимают из полости желудочка во время систолы, чтобы избежать кровотечения в месте укола. Для определения наименьшей дозы раствора стандартного образца и испытуемого препарата травяным лягушкам вводят примерно 0,2 мл препарата наперстянки, ландыша, горицвета или 0,3 мл препарата строфанта, желтушника. Допустимое отклонение между вводимыми дозами - 0,02-0,03 мл. При определении на водяных лягушках рассчитывают вводимую дозу на 1 г массы тела. Для того чтобы не рассчитывать каждый раз дозу на введение, предлагается таблица расчетных доз (табл. 9). Допустимое отклонение между вводимыми дозами должно быть не более 0,0005 мл на 1 г массы лягушки. Наименьшими дозами обычно являются 0,004-0,006 мл раствора на 1 г массы лягушки. Длительность наблюдения за лягушками - 15 мин, если испытывают сырье и препараты наперстянки, ландыша, горицвета; для препаратов строфанта, желтушника - 20 мин. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают еще 5 мин. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться ранее чем через 5 мин после остановки, в расчет не принимают. Таблица 9 Дозы, рассчитанные для введения водяным лягушкам при оценке препаратов, содержащих сердечные гликозиды, внутрисердечным и внутривенным путем --------------------------------------------------------------------------- |Средняя | Дозы препарата на 1 г массы лягушки, мг | | масса |----------------------------------------------------------------| |лягушки,|0,003|0,0035|0,004|0,0045|0,005|0,0055|0,006|0,0065|0,007|0,0075| | г |----------------------------------------------------------------| | | Дозы препарата на массу лягушки, мг | |--------+----------------------------------------------------------------| | 30 |0,09 |0,10 |0,12 |0,14 |0,15 |0,17 |0,18 |0,20 |0,21 |0,23 | | 35 |0,10 |0,12 |0,14 |0,16 |0,18 |0,19 |0,21 |0,23 |0,25 |0,26 | | 40 |0,12 |0,14 |0,16 |0,18 |0,20 |0,22 |0,24 |0,26 |0,28 |0,30 | | 45 |0,14 |0,16 |0,18 |0,20 |0,22 |0,25 |0,27 |0,29 |0,32 |0,34 | | 50 |0,15 |0,18 |0,20 |0,22 |0,25 |0,28 |0,30 |0,33 |0,35 |0,38 | | 55 |0,17 |0,19 |0,22 |0,25 |0,28 |0,30 |0,33 |0,36 |0,39 |0,41 | | 60 |0,18 |0,21 |0,24 |0,27 |0,30 |0,33 |0,36 |0,39 |0,42 |0,45 | | 65 |0,20 |0,23 |0,26 |0,28 |0,33 |0,36 |0,39 |0,42 |0,45 |0,49 | | 70 |0,21 |0,25 |0,28 |0,32 |0,35 |0,39 |0,42 |0,46 |0,49 |0,52 | | 75 |0,23 |0,26 |0,30 |0,34 |0,38 |0,41 |0,45 |0,49 |0,52 |0,56 | --------------------------------------------------------------------------- Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г, в 1 таблетке испытуемого образца по формулам, приведенным для подкожного введения, но обозначения А и В зависят от принципа расчета доз, т. е. от вида применяемых лягушек: А - наименьшая доза (1 мл на массу травяной лягушки или 1 мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора испытуемого препарата; В - наименьшая доза (1 мл на массу травяной лягушки или 1 мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора стандартного образца. в) Метод испытания при введении в вену. У лягушек проводят поперечный разрез кожи на уровне ключиц, затем по средней линии живота до симфиза, где надсекают кожу вправо и влево. Образовавшиеся лоскуты кожи отводят в стороны. На внутренней поверхности отведенных в сторону лоскутов кожи с каждой стороны видна большая кожная вена в виде петли, идущей по поверхности прямой мышцы живота от кожи спины книзу, а затем снова вверх, где она впадает в верхнюю полую вену. Затем выводят наружу сердце аналогично методу испытания при введении под кожу. Доску с группой препарированных животных поворачивают так, чтобы головы лягушек были обращены к экспериментатору для удобства введения иглы в нисходящее колено петли вены лягушки. При введении лягушкам внутривенным способом растворов стандартных образцов и испытуемых препаратов в соответствующем разведении, освобожденных от избытка спирта и летучих веществ, рассчитывают вводимую дозу на 1 г массы тела(см. табл. 9). Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят в вену одинаковые дозы раствора стандартного образца или испытуемого препарата тонкой иглой, соединенной со шприцем вместимостью 1 мл с двойной шкалой, со скоростью 0,1 мл в 5 с. После каждого введения накладывают кровоостанавливающие зажимы, которые не снимают до конца опыта. Время наблюдения за остановкой сердца лягушки 15 мин, если испытывают сырье и препараты наперстянки, ландыша, горицвета; для препаратов строфанта, желтушника - 20 мин. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают еще 5 мин; о результатах судят по изменениям, наступающим в дополнительное время. Определение наименьшей дозы стандартного образца и испытуемого препарата, вызывающей систолическую остановку сердца у большинства лягушек (3-4) из 5, проводят так же, как при введении под кожу. Допустимое отклонение между вводимыми дозами должно быть не более 0,0005 мл на 1 г массы лягушки. Наименьшими дозами обычно являются 0,004-0,006 мл раствора на 1 г массы лягушки. Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г или 1 таблетке испытуемого препарата по формулам, приведенным для подкожного введения, но с другими обозначениями А и В: А - наименьшая доза (1 мл на 1 г массы лягушки), установленная для раствора испытуемого препарата; В - наименьшая доза (1 мл на 1 г массы лягушки), установленная для раствора стандартного образца. Б. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ СЕРДЕЧНЫХ СРЕДСТВ НА КОШКАХ Отбор кошек и их содержание Для опыта отбирают кошек обоего пола, здоровых, не беременных и не лактирующих, массой 2-3,5 кг, находившихся в условиях лабораторного содержания в течение 2-3 сут. За 16- 20 ч до начала опыта животных лишают пищи, но не воды. Техника испытания и принцип расчета Опыт проводят под легким эфирным или уретановым наркозом (1,5-1,7 г/кг внутримышечно в затылочную часть головы). В отпрепарированную бедренную вену животного вводят канюлю, соединенную тонкой каучуковой трубкой с градуированной бюреткой вместимостью 50-100 мл, откуда поступает раствор испытуемого препарата, приготовленный на 0,9% растворе натрия хлорида. На пути между бюреткой и канюлей включают стеклянный змеевик, помещенный в баню с подогреваемой водой (39 град. С) для поддержания постоянной температуры вводимого раствора. В резиновую трубку, соединяющую стеклянный змеевик с канюлей, вставляют с помощью стеклянного тройника термометр, показывающий температуру жидкости, поступающей к животному. Жидкость из бюретки вытекает под постоянным давлением, что достигается введением в бюретку стеклянного капилляра внешним диаметром не более 1 мм, укрепленного при помощи каучуковой пробки в верхнем отверстии бюретки (по принципу сосуда Мариотта). Длина капилляра должна быть такова, чтобы нижний его конец доходил до уровня нижнего деления бюретки. Скорость вытекания жидкости из бюретки регулируют при помощи зажима, наложенного на каучуковую трубку, или стеклянного крана таким образом, чтобы в вену животного в 1 мин поступал 1 мл испытуемого раствора. Введение раствора проводят до наступления остановки сердца. Длительность опыта должна составлять не менее 30 и не более 55 мин. Момент остановки сердца определяют по исчезновению сердечного толчка и контролируют последующим вскрытием грудной клетки. При наличии патологических изменений в органах опыт в расчет не принимают. Оценку активности испытуемых препаратов можно проводить 2 способами: 1) по сравнению со стандартным образцом; 2) в кошачьих единицах действия (КЕД). Оценка активности испытуемого препарата по сравнению со стандартным образцом В опыт берут не менее 12 кошек - по 6 кошек для испытуемого препарата и стандартного образца. Данные, полученные при биологическом испытании стандартного образца, могут быть использованы для расчетов в последующих опытах в течение 15 сут без повторного испытания. Из полученных в опыте данных вычисляют величину смертельной дозы препарата для каждого животного в миллилитрах на 1 кг массы. _ Находят величину средней смертельной дозы для стандартного (Yc) и _ испытуемого (Yи) препаратов, а также стандартную ошибку по формулам I.1.2 и I.1.9 статьи "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний" (ГФ XI, вып. 1, с. 199). Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если отношение стандартной ошибки к среднему значению не превышает 5,7%. В противном случае необходимо увеличить число опытов. Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям, если отношение средних смертельных доз испытуемого препарата и стандартного образца составляет 90-110%, а их разность не превышает величины s х t(P, f). d Стандартную ошибку разности s вычисляют по формуле I.4.4 (ГФ d XI, вып. 1, с 212). Критическое значение t(P, f) находят по таблице значений t(P, f) из той же статьи "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний" (с. 249) при уровне значимости 5%, что соответствует уровню достоверности 95%. Значение величины t(P, f) зависит от так называемого числа степеней свободы (f), которое равно общему _ _ числу опытов, использованных для вычисления Yс и Yи, уменьшенному на 2. Пример расчета: ------------------------------------------------------------------ | | Стандартный образец | Испытуемый препарат | | |-------------------------------+----------------------------| | N | мл/кг|отклонения| квадрат | мл/кг|отклонения|квадрат | |п/п| (Yс) |от средней| отклонений | (Yи) |от средней|отклонений| | | | _ | _ 2 | | _ | _ 2| | | |(Yс - Yс) | (Yс - Yс) | |(Yи - Yи) |(Yи - Yи) | |---+------+----------+-------------+------+----------+----------| |1 | 15,0 | 2,0 | 4,0 | 16,0 | 2,5 | 6,25 | |2 | 16,3 | 0,7 | 0,49 | 17,1 | 1,4 | 1,96 | |3 | 18,2 | 1,2 | 1,44 | 20,0 | 1,5 | 2,25 | |4 | 17,8 | 0,8 | 0,64 | 19,5 | 1,0 | 1,0 | |5 | 17,0 | 0 | 0 | 20,0 | 1,5 | 2,25 | |6 | 17,7 | 0,7 | 0,49 | 18,4 | 0,1 | 0,01 | ------------------------------------------------------------------ _ _ 2 Yс = 17,0 мл/кг; (Yс - Yс) = 7,06; _ _ _ 2 Yи = 18,5 мл/кг; (Yи - Yи) = 13,72; --------- _ / 7,06 ------ SYс = +/- /----------- = +/- \/ 0,235 = +/- 0,48 мл/кг; \/ 6 х (6 - 1) --------- _ / 13,72 ------ SYи = +/- /----------- = +/- \/ 0,457 = +/- 0,68 мл/кг. \/ 6 х (6 - 1) Далее находят отношение стандартной ошибки к среднему значению |