ГФ №11, том 2. Общие методы анализа лекарственное растительное сырье редакционная коллегия
 Скачать 1.25 Mb.
|
|
найденной величине зоны. Умножением полученной концентрации на степень разведения получают активность в 1 мл основного раствора или в 1 мг испытуемого образца. Пример. Средний размер зон для раствора испытуемого образца при разведении 1:300 составляет 18,7 мм, средний размер зон для раствора стандартного образца, содержащего 2 мкг/мл (контрольная концентрация) из тех же чашек - 18,5 мм. Следовательно, разность составляет + 0,2 мм. Эту разность прибавляют к величине зоны для раствора в концентрации 2 мкг/мл по стандартной кривой, которая равна D3 = 18,6 мм, и получают величину 18,8 мм. Находят на кривой концентрацию, соответствующую данному размеру зоны - 2,36 мкг/мл. Эту величину умножают на степень разведения и получают содержание активного вещества в 1 мл основного раствора, т. е. 2,36 мкг/мл х 300 = 708 мкг/мл. Так как концентрация основного раствора составляла 1 мг/мл, то активность испытуемого образца равна 708 мкг/мл: 1 мг/мл = 708 мкг/мл. Определение активности испытуемого образца расчетным путем. Кривая, отражающая зависимость между активностью антибиотика и размером зоны угнетения роста тест - микроба, после перехода к координатам логарифм концентрации (lg C) - диаметр зоны (D) преобразуется в прямую, уравнение которой: D = a + b x lg C, где а - свободный член; b - угловой коэффициент. По исправленным значениям величин диаметров зон d1, d2, d4, d5 для растворов стандартного образца с концентрациями C1, С2, С4, С5 и общей средней величине диаметра зоны d3, соответствующей контрольной С3, рассчитывают величины а и b с применением метода наименьших квадратов. Так как концентрации C1, С2, С3, С4, C5 составляют геометрическую прогрессию, формулы для вычисления коэффициентов а и Ь могут быть записаны в виде: b = (-2 x d1 - d2 + d4 + 2 x d5) / 10 x lg Z; a - d - Ь x lg C3, где Z - знаменатель прогрессии разведения; _ d = (d1 + d2 + d3 + d4 + d5) / 5. Пример. Пусть знаменатель прогрессии разведения Z = 1,25, С3 = 5,0, а средние значения диаметров зон (в мм) равны: d1 = 17,64; d2 = 18,15; d3 = 19,03; d4 = 19,58; d5 = 20,09. Тогда: b = (-2 х 17,64 - 18,15 + 19,58 + 2 х 20,09) / (10 х lg 1,25) = = 6,33 / 0,969 = 6,532. _ d = (17,64 + 18,15 + 19,03 + 19,58 + 20,09) / 5 = 18,90; а = 18,90 - 6,532 х 0,6990 = 14,33. Если в опыте с одной стандартной кривой проведено n испытаний образца, то логарифм среднего значения концентрации испытуемого образца в опыте рассчитывают по формуле: _ _ lg = C = lg C3 + (d - d ) / b, U U S где С - среднее значение рабочей концентрации испытуемого U _ образца, полученное по n испытаниям; d - среднее значение U диаметра зон задержки роста, полученное по n параллельным испытаниям (3n чашкам); d - среднее значение соответствующего S диаметра для контрольной концентрации, полученное в тех же испытаниях (по 3n чашки). Величину концентрации С вычисляют как антилогарифм: U C = antilg (lg C ). U U Для получения активности испытуемого образца величину С U умножают на его разведение в опыте - гамма . U Пример 1. Пусть n = 1; С3 = 5,0; d = 18,61 и d = 18,44 при _ S _ U гамма = 160. Тогда: d = d = 18,44; d = d = 18,61 и lg С = U U U S S U 0,6990 + (18,44 - 18,61) / 6,532 = 0,6730; С = antilg (0,6730) = 4,710; А = 4,710 х 160 = 754. U U Пример 2. Пусть n = 3; С3 = 5,0; d = 18,61; d = 18,3; S1 S2 d = 18,12; d = 18,44; d = 18,1; d = 18,3 при гамма = 160. S3 U1 U2 U3 U Тогда: _ d = (18,61 + 18,3 + 18,12) / 3 = 18,34; S _ d = (18,44 + 18,1 + 18,3) / 3 = 18,28; U lg С = 0,6990 + (18,28 - 18,34) / 6,532 = 0,6990 - 0,0092 = 0,6898; U C = antilg (0,6898) = 4,896; U А = 4,896 х 160 = 783. U Поскольку микробиологическое исследование активности антибиотиков подвержено вариабельности, следует проводить не менее 6 повторных испытаний в разные дни (не менее 2 дней), так как средняя активность отдельных определений, проведенных в разные дни, - более надежная величина, чем средняя активность, полученная в результате такого же количества определений, проведенных одновременно. Расчет ошибки определения логарифма концентрации испытуемого образца в пределах одного опыта приведен в приложении 1 к настоящей статье. Объединение результатов отдельных опытов проводят в соответствии с формулами, приведенными в приложении 2 к настоящей статье. Во всех сомнительных случаях и при определении активности стандартных образцов должен использоваться только трехдозный вариант метода диффузии в агар. Для определения содержания активного вещества во флаконе активность, найденную в 1 мг, умножают на массу содержимого флакона, выраженную в миллиграммах. При исследовании раствора, приготовленного из всего содержимого флакона или ампулы, активность, найденную в 1 мл этого раствора, умножают на его объем. В случае необходимости определения содержания активного вещества в 1 мг испытуемого образца следует величину, характеризующую содержание активного вещества во флаконе, разделить на массу содержимого флакона, выраженную в миллиграммах. При определении содержания активного вещества в таблетках или капсулах их количество, а также подготовка для анализа должны соответствовать требованиям общих статей ГФ XI издания "Таблетки" (с. 154) и "Капсулы" (с. 143). В дальнейшем основной раствор испытуемого образца готовят из расчета 1 мг в 1 мл. После перемешивания раствору дают отстояться или центрифугируют. Рабочий раствор испытуемого образца готовят разведением надосадочной жидкости основного раствора. Для определения содержания активного вещества в 1 таблетке или капсуле активность 1 мг порошка растертых таблеток или содержимого капсул умножают на среднюю массу таблетки или содержимого капсулы, выраженную в миллиграммах. При исследовании таблеток, покрытых оболочкой, активность определяют в нескольких растворенных таблетках, количество которых и растворитель должны быть указаны в частных статьях. Активность, найденную в 1 мл основного раствора, умножают на его объем и делят на количество растворенных в этом объеме таблеток. Выращивание и хранение культур тест - микробов <*>. Все культуры тест - микробов сохраняют в запаянных пробирках на соответствующих плотных питательных средах в течение 15-30 сут при температуре от 4 до 10 град. С, после чего пересеивают на свежую питательную среду. Тест - микробы можно сохранять и в лиофилизированном состоянии. -------------------------------- <*> Штаммы тест - микробов, за исключением Candida utilis ЛИА-01, применяемые для определения антимикробной активности антибиотиков, хранятся в музее патогенных и условно патогенных культур при Государственном научно - исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Candida utilis ЛИА-01 хранится во Всесоюзном научно - исследовательском технологическом институте антибиотиков и ферментов медицинского назначения (ВНИТИАФ). Для характеристики культурных свойств микроорганизмов (см. табл. 18) производится их высев в пробирки с мясо - пептонным бульоном (МПБ), затем через 18-20 ч инкубации при температуре (36 +/-1) град. С культуры высеивают на чашки Петри с плотной средой для выделения типичных колоний, которые затем пересевают на соответствующие питательные среды для получения в дальнейшем взвесей вегетативных клеток или спор. Взвесь хранят в запаянных стеклянных пробирках при температуре от 4 до 10 град. С в течение определенного срока. В полученной взвеси определяют концентрацию клеток (спор) по оптическому стандарту мутности <*> или нефелометрически (основная взвесь). Из этой взвеси по мере надобности готовят рабочую взвесь в соответствии с посевной дозой, предусмотренной для каждого тест - микроба (см. табл. 17). -------------------------------- <*> Оптические стандарты мутности и инструкция по их использованию выпускаются и рассылаются Государственным научно - исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Культуру тест - микроба Staphylococcus aureus 209P высевают на чашки Петри со средой N 1 и после выращивания в течение 18-20 ч при (364 +/-1) град. С оставляют при комнатной температуре на 24 ч для наблюдения за образованием пигмента. Отбирают типичные колонии и пересевают их в пробирки со скошенным агаром того же состава. Для определения активности используют взвесь 18-20-часовой культуры стафилококка, выращенной в пробирке на скошенном агаре. Возможно также применение в течение длительного времени взвеси культуры, полученной следующим образом: культуру выращивают в течение 18-20 ч на скошенном агаре в пробирке, смывают ее 5-10 мл стерильного раствора хлорида натрия изотонического 0,9%. Полученной взвесью засевают матрац с 300 мл среды N 1 (со скошенной поверхностью), выращивают в течение 2 сут [сутки при (36 +/-1) град. С и сутки при комнатной температуре], смывают примерно 50 мл стерильного раствора хлорида натрия изотонического 0,9%. Взвесь культуры можно хранить в запаянных пробирках в течение 5-7 нед при температуре от 4 до 10 град. С. Культуру тест - микроба Bordetella bronchiseptica (ATCC 4617 гладкая форма) выращивают так же, как указано для Staphylococcus aureus 209P, за исключением времени инкубации, которое составляет для Bordetella bronchiseptica 30-36 ч. Посевным материалом служит культура, выращенная в пробирках со скошенным агаром и хранящаяся при температуре от 4 до 10 град. С не более 2 нед. Для длительного применения взвеси клеток культуру смывают с питательной среды 5-10 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического 0,9%, засевают матрац со средой N 1 (со скошенной поверхностью) и далее поступают так же, как при подготовке культуры Staphylococcus aureus 209P. Взвесь клеток Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 может храниться в течение 7 сут. Культуру тест - микроба Pseudomonas aeruginosa N CTC 2134 выращивают на чашках Петри со средой N 1 в течение 18-20 ч при температуре (36 +/-1) град. С, отбирают типичные колонии, пересевают их на мясо - пептонный бульон рН от 7,2 до 7,4 и выращивают в вышеуказанных условиях. Полученная культура служит посевным материалом для приготовления суточной культуры, используемой при определении активности в каждом конкретном опыте, и может храниться в течение 30 сут при температуре от 4 до 10 град. С. Культуру тест - микроба Candida utilis ЛИА-01 выращивают на чашках Петри со средой N 3 в течение 48 ч при температуре (30 +/-1) град. С, отбирают типичные колонии, пересевают их в пробирки со скошенным агаром того же состава и выращивают в указанных выше условиях. Полученная культура служит посевным материалом для приготовления взвеси клеток, применяемой в течение длительного времени. Для этого культуру с поверхности среды смывают 5-10 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического 0,9% и засевают матрац с 300 мл среды N 3 (со скошенной поверхностью). Через 2 сут культуру смывают 50 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического 0,9%. По мере надобности готовят рабочую взвесь, густота которой должна быть такой, чтобы при разведении ее в 30 раз 0,9% раствором натрия хлорида изотонического оптическая плотность составляла 0,22-0,23. Для определения густоты взвеси используют нефелометр с нейтральным светофильтром и кюветы с толщиной слоя 3 мм. Рабочая взвесь может храниться в течение 30 сут. При использовании спорообразующих культур тест - микробов процесс выращивания на чашках Петри, отбор типичных колоний, пересев на пробирки со скошенным агаром и на матрацы осуществляют так же, как указано для Staphylococcus aureus 209P. Для выращивания культур тест - микробов Вас. subtilis, var. Л2 и Вас. pumilus N CTC 8241 на чашках Петри и пробирках используют среду N 1, при выращивании на матрацах - среду N 4; для выращивания культур тест - микробов Вас. cereus, var. mycoides HB и Вас. subtilis ATCC 6633 на чашках Петри и пробирках используют среду N 1, при выращивании на матрацах - среду N 5; для выращивания культуры тест - микроба Вас. cereus, var. mycoides 537 на чашках Петри и на пробирках используют среду N 2, при выращивании на матрацах - среду N 4. Для получения взвеси спор культуру, выращенную в пробирках, смывают 5-10 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического 0,9%, засевают ею несколько матрацев с 300 мл питательной среды (со скошенной поверхностью) и выращивают в течение 5-7 сут. В процессе выращивания периодически производят микроскопический контроль культуры, и если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 80-90% спор, производят смыв стерильной дистиллированной водой. Полученную взвесь спор прогревают при температуре от 60 до 70 град. С в течение 30 мин. Затем промывают стерильной дистиллированной водой при центрифугировании до полной прозрачности надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор вновь прогревают в течение 30 мин при температуре от 60 до 70 град. С. Взвесь спор хранят в запаянных стеклянных пробирках при температуре от 4 до 10 град. С и используют до тех пор, пока интенсивность роста и четкость зон при определении антимикробной активности препаратов удовлетворяют предъявляемым требованиям. Для заражения питательных сред допускается использование лиофилизированных тест - культур с точно известным содержанием количества микробных клеток (спор) в ампуле, которые после суспендирования в соответствующем растворителе (растворе натрия хлорида изотонического 0,9% или дистиллированной воде) вносят в питательную среду без предварительного пересева. Питательные среды и буферные растворы. В табл. 19 представлен состав сред, используемых при определении активности антибиотиков. Для приготовления сред N 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16 применяют ферментативный гидролизат биомассы микроорганизмов без оболочек. Методика приготовления состоит в следующем: 5 г сухого ферментативного гидролизата размешивают в 1 л дистиллированной воды, прибавляют агар - агар, расплавленный в открытом котле или автоклаве текучим паром или под давлением 0,05 МПа и температуре (111 +/- 1) град. С в течение 30 мин. В случае необходимости в среду прибавляют соли в количестве, указанном в прописи сред; рН сред определяют потенциометрически со стеклянными электродами или колориметрически. Реакцию среды (рН) корригируют хлористоводородной кислотой или раствором едкого натрия. Готовые среды разливают в соответствующую посуду и стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа и температуре (120 +/- 1) град. С в течение 15 мин. Таблица 19 Состав питательных сред для выращивания тест - культур, получения спор и определения активности антибиотиков ------------------------------------------------------------------- | | Номера сред | | Ингредиенты |------------------------------------------------| | | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |-----------------------------------------------------------------| | Содержание каждого ингредиента | |-----------------------------------------------------------------| |Мясо - пептонный|1000 мл|1000 мл|1000 мл| 5 г | 5 г | 5 г | |бульон 1:2 | | | | | | | |Ферментативный | | | | | | | |гидролизат био-| | | | | | | |массы микроорга-| | | | | | | |низмов без обо-| | | | | | | |лочек | | | | | | | |Агар - агар | 20 г | 20 г | 17 г | 25 г | 25 г | 10-15 г| |Глюкоза | | | 10 г | | | | |Натрия фосфат | | | | | | | |двузамещенный | | | | | | | |Калия фосфат | | | | | | | |однозамещенный | | | | | | | |Натрия хлорид | | | 5 г | | | | |Калия хлорид | | | | | | | |