ГФ №11, том 2. Общие методы анализа лекарственное растительное сырье редакционная коллегия
 Скачать 1.25 Mb.
|
|
Для ряда лекарственных средств (антибиотиков, мягких лекарственных форм и др.) отбирают от каждой серии среднюю пробу не менее 15 г, состоящую из равных разовых проб, взятых из не менее чем 10 разных упаковок. Для одного анализа используют образцы по 3 г (мл) для каждого раздела исследования. Всего для проведения одного анализа используют по 9 г (мл) лекарственного средства. При повторении испытания по одному из разделов исследования используют образец в количестве 3 г (мл). Для лекарственных средств в аэрозольной упаковке, пленок полимерных лекарственных и др. отбор и приготовление проб проводят согласно указанию в частных статьях. В зависимости от физических свойств лекарственной формы образец для анализа готовят в виде раствора, суспензии или эмульсии: - твердые лекарственные формы, которые трудно растворяются, измельчают с помощью соответствующего оборудования и суспендируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 или соответствующей жидкой питательной среде, рекомендованной для определенного вида испытания; - жидкие лекарственные формы, а также твердые формы, которые быстро и практически полностью растворяются в фосфатном буферном растворе рН 7,0 или соответствующей питательной среде в разведении 1:10, готовят в виде растворов или суспензий; - мягкие лекарственные формы, нерастворимые в воде, эмульгируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 с помощью стеклянных бус и минимального количества подходящего стерильного эмульгатора, указанного в соответствующей статье (например, твин-80), применяя механическое встряхивание и нагревание до температуры не более 45 град. С в случае необходимости. Приготовленные разведения образцов используют для определения общего числа бактерий и грибов в 1 г (мл) лекарственного средства и установления отсутствия бактерий семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Количественное определение микроорганизмов Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри диаметром 90-100 мм. Образец лекарственного средства в количестве 10 г (мл) растворяют, суспендируют или эмульгируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 так, чтобы конечный объем раствора (суспензии, эмульсии) был 100 мл. Посевы просматривают ежедневно. Определение общего числа бактерий. Приготовленный раствор (суспензию, эмульсию) образца вносят по 1 мл в каждую из двух пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до температуры от 45 до 50 град. С среды N 1. Быстро перемешивают содержимое пробирки и переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды N 1. Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно распределяют верхний слой агара. После застывания среды чашки переворачивают и инкубируют в течение 5 сут при температуре от 30 до 35 град. С. Через 48 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках, находят среднее значение и, умножая его на показатель разведения, вычисляют число бактерий в 1 г (мл) образца. Для получения достоверных результатов учитывают только те чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний. Если при разведении образца 1:10 нет роста, результаты отмечают следующим образом: "В 1 г (мл) лекарственного средства (сырья) менее 10 бактерий". Если число колоний на чашке превышает 300, делают ряд дальнейших последовательных разведений образца (1:100, 1:1000 и т.д.), выбирая для посева разведение, наиболее соответствующее указанному выше уровню. Определение общего числа грибов. Испытание проводят двухслойным агаровым методом, описанным выше, используя среду N 2. Посевы инкубируют в течение 5 сут при температуре от 20 до 25 град. С. Через 72 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают общее число колоний дрожжевых и плесневых грибов на двух чашках, находят среднее значение и, умножая его на показатель разведения, т.е. на 10, вычисляют число грибов в 1 г (мл) образца. В случае, если число колоний грибов на чашке превышает 300, делают ряд дальнейших разведений образца. На чашке учитывают все колонии грибов, даже если их число менее 30. ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной среды N 3, перемешивают и инкубируют при температуре от 30 до 35 град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей на среды N 4 и N 5, разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при температуре от 30 до 35 град. С в течение 24-48 ч. Если после инкубации на средах N 4 и N 5 не будет колоний, соответствующих морфологической характеристике, данной в табл. 14, считают, что в образце нет бактерий семейства Enterobacteriaceae. Колонии, подозрительные по морфологии на принадлежность к семейству Enterobacteriaceae, пересевают каждую отдельно со сред N 4 и N 5 на скошенную в пробирках среду N 1 и выращивают при температуре от 30 до 35 град. С в течение 18-20 ч. Из каждой пробирки с чистой культурой через сутки делают пересевы на среды N 6 и N 7. После посева в половину пробирок со средой N 6 вносят по 0,5 мл стерильного вазелинового масла. Все посевы инкубируют при температуре от 30 до 35 град. С в течение 18-20 ч. При наличии роста ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды N 6 из красного в желтый в пробирках с маслом и без него. О наличии нитритов в среде N 7 судят по появлению красного окрашивания при внесении в среду реактива Грисса. Параллельно исследуют чистые культуры на наличие фермента цитохромоксидазы. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты (или кислоты и газа) и восстанавливают нитраты в нитриты, лекарственное средство контаминировано бактериями семейства Enterobacteriaceae. Таблица 14 Морфологическая характеристика бактерий семейства Enterobacteriaceae на диагностических средах ------------------------------------------------------------------ | Диагностическая | N 4 | N 5 | | среда | агар Эндо |висмутсульфит агар| |------------------+--------------------------+------------------| |Характерная |Колонии круглые, малиновые|Черные колонии с| |морфология колоний|с металлическим блеском|характерным метал-| | |или без него; розовые,|лическим блеском,| | |бесцветные, блестящие,|участки среды под| | |выпуклые диаметром 2-4 мм |колониями окрашены| | | |в черный цвет; | | | |зеленовато - бурые| | | |колонии, светло -| | | |зеленые, бурые | |Окраска по Граму |Грамотрицательные неспорообразующие палочки | ------------------------------------------------------------------ ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ PSEUDOMONAS AERUGINOSA И STAPHYLOCOCCUS AUREUS Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной среды N 8, перемешивают и инкубируют при температуре от 30 до 35 град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей на среды N 9 и N 10, разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при температуре от 30 до 35 град. С в течение 24-48 ч. Если после инкубации на средах N 9 и N 10 не обнаружены колонии микроорганизмов, соответствующих морфологической характеристике, данной в табл. 15 и 16, считают, что в лекарственном средстве нет Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. При наличии на среде N 9 характерных для Pseudomonas aeruginosa колоний грамотрицательных неспорообразующих палочек, обладающих специфическим запахом и выделяющих сине - зеленый пигмент пиоцианин в питательный агар, культуру исследуют на наличие фермента цитохромоксидазы. Таблица 15 Морфологическая характеристика Pseudomonas aeruginosa на диагностической среде N 9 ------------------------------------------------------------------ | Характерная морфология | Окраска по Граму | | колоний | | |--------------------------+-------------------------------------| |Зеленоватые, как правило,|Грамотрицательные неспорообразующие| |флюоресцирующие колонии,|палочки | |голубые в ультрафиолетовом| | |свете | | ------------------------------------------------------------------ Таблица 16 Морфологическая характеристика Staphylococcus aureus на диагностической среде N 10 ------------------------------------------------------------------ |Характерная морфология| Окраска по Граму | | колоний | | |----------------------+-----------------------------------------| |Золотисто - желтые ко-|Грамположительные кокки, расположенные| |лонии, окруженные жел-|гроздьями | |тыми зонами | | ------------------------------------------------------------------ Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают положительную оксидазную реакцию и образуют сине - зеленый пигмент, лекарственное средство контаминировано Pseudomonas aeruginosa. Наличие на среде N 10 золотисто - желтых колоний грамположительных кокков, окруженных желтыми зонами, свидетельствует о ферментации маннита. Чистую культуру стафилококка исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы. Если в образце обнаружены грамположительные кокки, которые ферментируют маннит и дают положительную реакцию плазмокоагуляции, лекарственное средство контаминировано Staphylococcus aureus. В нестерильных лекарственных средствах не допускается наличие бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. В 1 г (мл) лекарственного средства для приема внутрь допускается наличие не более 1000 бактерий и 100 дрожжевых и плесневых грибов (суммарно). В 1 г (мл) лекарственного средства для применения в полости уха, носа, для интравагинального использования и для местного употребления допускается наличие не более 100 микроорганизмов, в том числе и грибов. Тест на наличие нитритов. К суточной исследуемой культуре бактерий на среде N 7 приливают 0,2-0,3 мл реактива Грисса, погружая пипетку до дна пробирки. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов. Тест на наличие цитохромоксидазы. Полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом и наносят платиновой петлей или стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий со скошенной среды N 1. Синее окрашивание, появляющееся через 2-5 мин, свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Тест на наличие плазмокоагулазы (реакция плазмокоагуляции). Кровь, взятую стерильным шприцем из сердца кролика, помещают в 5% стерильный раствор натрия цитрата, отсасывают плазму, разводят 1:5 0,9% стерильным раствором натрия хлорида изотоническим и разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. В каждую пробирку помещают 1 петлю суточной культуры стафилококка и инкубируют при температуре от 30 до 35 град. С в течение 4-6 ч. Если в течение этого времени не наблюдают свертывание плазмы, реакцию плазмокоагуляции считают отрицательной. Обязательно наличие двух контролей: 1) контроль раствора плазмы, 2) контроль культуры стафилококка, обладающего ферментом коагулазой. Для удобства постановки реакции плазмокоагуляции можно использовать сухую кроличью цитратную плазму промышленного производства, которую разводят согласно наставлению по применению. Питательные среды Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие определенных микроорганизмов. Готовить питательные среды следует, строго придерживаясь приведенной рецептуры. Компоненты питательных сред должны соответствовать ГОСТ и ТУ. Состав и приготовление питательных сред. Среда N 1 - для выращивания бактерий: пептона ферментативного сухого 10 г натрия хлорида 5 >> глюкозы 1 >> агара микробиологического <*> 13 >> мясной воды (1:2) 1000 мл рН после стерилизации 7,3 +/-0,2. К мясной воде прибавляют пептон и натрия хлорид, растворяют при нагревании, вносят глюкозу, устанавливают рН, кипятят в течение 1 мин, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно - марлевый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин. Среда N 2 - для выращивания грибов (Сабуро): пептона ферментативного сухого 10 г глюкозы 40 >> агара микробиологического <*> 13 >> воды дистиллированной 1000 мл рН после стерилизации 5,6 +/-0,2. Все ингредиенты растворяют в воде, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно - марлевый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин. Для подавления роста бактерий после стерилизации насыщенным паром под давлением прибавляют 100 мг бензилпенициллина и 100 мг тетрациклина (либо перед стерилизацией насыщенным паром под давлением - 50 мг левомицетина) на 1000 мл среды. -------------------------------- <*> Жидкие среды N 1 и N 2 не содержат агара. Среда N 3 - среда обогащения для бактерий семейства Enterobacteriaceae: пептона ферментативного сухого 10,0 г натрия фосфата двузамещенного 7,5 >> калия фосфата однозамещенного 2,5 >> глюкозы 10,0 >> фенолового красного 0,08 >> малахитового зеленого 0,015 >> мясной воды (1:2) 1000 мл рН после стерилизации 7,3 +/-0,2. Пептон и соли растворяют в мясной воде при нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8 мл 1% раствора фенолового красного и 3 мл 0,5% раствора малахитового зеленого, устанавливают рН, кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют насыщенным паром под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин в паровом стерилизаторе. Среда N 4 (агар Эндо сухой) -для выделения прописи семейства Enterobacteriaceae - готовят согласно бактерий на этикетке. Среда N 5 (висмутсульфит агар сухой) - для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae - готовят согласно прописи на этикетке. Среда N 6 - для определения ферментации глюкозы: пептона ферментативного сухого 10,0 г натрия хлорида 5,0 >> глюкозы 40,0 >> фенолового красного 0,08 >> мясной воды (1:2) 1000 мл рН после стерилизации 7,2 +/-0,2. Пептон и натрия хлорид растворяют в мясной воде при нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8 мл 1% раствора фенолового красного, устанавливают рН, кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр и разливают в пробирки с поплавками по 4-5 мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин. По окончании стерилизации следует как можно быстрее охладить среду. Среда N 7 - для определения восстановления нитратов в нитриты: пептона ферментативного сухого 5,0 г натрия хлорида 5,0 >> калия нитрата 1,5 >> воды дистиллированной 1000 мл рН после стерилизации 7,2 +/-0,2. Все компоненты растворяют в воде при нагревании, устанавливают рН, кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 4-5 мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин. Таблица 17 Тест - микроорганизмы и условия для биологического определения активности антибиотиков ------------------------------------------------------------------------------ | | | Среда для |Количество| | | | | определения | среды на | | | | | активности | каждую | | |Антибиотик <1>|Тест - микро- | <3, 4> | чашку, | Посевная | | |организмы <2> | | мл <5> | доза <6> | | | |----------------+----------| | | | |ниж-| верхний |ниж-|верх-| | | | |ний | лой |ний | ний | | | | |слой| |слой|слой | | |--------------+---------------+----+-----------+----+-----+-----------------| |Ампициллин |Staphylococcus |N 11|N 7 + 0,1% | 10 | 5 |40 млн микробных| | |aureus 209 Р | |глюкозы | | |клеток на 1 мл| | | | | | | |среды | |