ГФ №11, том 2. Общие методы анализа лекарственное растительное сырье редакционная коллегия
 Скачать 1.25 Mb.
|
|
воды дистиллированной до 100 мл Навеску красителя переносят в стеклянный флакон, прибавляют стерильную горячую воду, помещают на сутки в термостат, периодически встряхивая. Реактив Грисса. Раствор N 1: 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты, прибавляют 100 мл воды, фильтруют. Раствор годен в течение месяца. Раствор N 2: 0,1 г 1-нафтиламина растворяют в 100 мл кипящей воды, охлаждают, прибавляют 30 мл ледяной уксусной кислоты, фильтруют. Раствор годен в течение 7 сут. Перед употреблением смешивают равные объемы растворов N 1 и N 2. Реактив на цитохромоксидазу. Раствор N 1: 1% спиртовой раствор нафтола-1. Раствор N 2: 1% раствор N, N - диметил - р - фенилендиамина дигидрохлорида. Перед употреблением смешивают растворы N 1 и N 2 в соотношении 2:3. Растворы годны в течение 14 сут при хранении при температуре от 4 до 10 град. С во флаконах нейтрального светозащитного стекла. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР Определение антимикробной активности антибиотиков основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест - микробов, образующихся при испытании растворов определенных концентраций Государственного стандартного образца <*> и испытуемого препарата. -------------------------------- <*> Далее "стандартный образец" следует читать "Государственный стандартный образец". Антимикробная активность антибиотиков выражается в единицах действия - ЕД или "мгк". Для большинства антибиотиков 1 ЕД или "мкг" соответствуют 1 мкг активного вещества (кислоты или основания); для антибиотиков, имеющих иное количественное выражение единицы, соответствующие указания даются в частных статьях. При определении антимикробной активности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило, устанавливают в соответствии с Международными биологическими стандартами. При отсутствии последних для указанных целей могут быть использованы международные химические стандарты, антимикробную активность которых рассчитывают на основании показателей качества, установленных физико - химическими методами. Антимикробную активность стандартных образцов антибиотиков, не имеющих аналогов в международной коллекции стандартов, рассчитывают также на основании показателей качества, установленных физико - химическими методами. Стандартные образцы антибиотиков утверждаются и рассылаются Государственным научно - исследовательским институтом по стандартизации и контролю лекарственных средств Минздрава СССР, хранятся и используются в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке стандартного образца. Метод определения. Тест - микробы, растворители, буферные растворы, питательные среды и прочие условия проведения испытания указаны в табл. 18. В чашки Петри (стеклянные или пластмассовые), установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью, разливают расплавленные питательные среды определенного состава в один или два слоя. Для нижнего слоя используют незасеянные среды, для верхнего или одного слоя - агаровую среду, предварительно засеянную соответствующим тест - микробом. Если культура представляет собой суспензию вегетативных клеток, то температура расплавленной среды, в которую вносят тест - микроб, должна быть (49 +/-1) град. С, при использовании суспензии спор - 65-70 град. С. К среде следует добавить такое количество суспензии вегетативных клеток или спор, которое обеспечивает оптимальный рост тест - микроба и четкость зон угнетения его роста. Таблица 18 Характеристика культуральных свойств тест - микроба ----------------------------------------------------------------------------------------------------- | | При росте на плотной | При росте на жидкой | | | Название | питательной среде | питательной среде | При микроскопическом | | тест - микроба |------------------------------+----------------------------| изучении мазка | | | условия |описание культуры | условия |описание культуры| агаровой культуры, | | |выращивания| |выращива- | | окрашенной по Граму | | | | | ния | | | |----------------+-----------+------------------+----------+-----------------+----------------------| |Staphylococcus |Среда N 1,|Гладкие с ровными|Мясо - |Равномерное по-|Однородные по величине| |aureus 209 Р |Т град.|краями колонии, с|пептонный |мутнение бульона|и расположению в виде | | |(36 +/-1)|равномерной золо-|бульон, |без пленки и сли-|гроздьев кокки с хоро-| | |град. С,|тистой пигмента-|рН 7,2-7,4|зистого осадка на|шо выраженной грампо-| | |18 - 20 ч |цией |18-20 ч |дне |ложительной окраской | | |затем при| | | | | | |комнатной | | | | | | |температуре| | | | | |Candida utilis |Среда N 3,|Круглые, кремового|МПБ, |Рост в виде рав-|Овальные, иногда с от-| |ЛИА-01 |Т град.|цвета с матовой|рН 7,2-7,4|номерной мути и|ростками клетки; рас-| | |(30 +/-1)|поверхностью коло-|с 1% |осадка на дне |положены отдельно, це-| | |град. С,|нии с ровными|глюкозой, | |почками или группами | | |48 ч, |краями |18-20 ч | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Bacillus subti -|Среда N 1,|Колонии желтовато-|МПБ, |Рост в виде плен-|Палочки с закругленны-| |lis, var. Л2 |Т град.|го цвета, круглой|рН 7,2-7,4|ки с осадком на|ми краями, располагаю-| | |(36 +/-1)|формы, влажно бле-|18-20 ч |дне |щиеся отдельно и це-| | |град. С,|стящие с шагрене-| | |почками с хорошо выра-| | |18 - 20 ч,|вой поверхностью,| | |женной грамположитель-| | | |слегка зазубренны-| | |ной окраской | | | |ми краями и при-| | | | | | |поднятым центром | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Bacillus subti -|Среда N 1,|Мелкие сероватые|МПБ, |Рост в виде плен-|Тонкие палочки, распо-| |lis ATCC 6633 |Т град.|колонии с зубчатым|рН 6,8-7,0|ки с осадком на|лагающиеся отдельно | | |(36 +/-1)|краем |18-20 ч |дне |или цепочками, с хоро-| | |град. С,| | | |шо выраженной грампо- | | |18 - 20 ч | | | |ложительной окраской | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Bacillus cereus,|Среда N 2,|Шероховатые коло-|МПБ, рН |Морщинистая плен-|Палочки с закругленны-| |var. mycoides |Т град.|нии с краем, сфор-| 7,8-8,0, |ка; вся среда|ми концами, распола-| |537 |(36 +/-1)|мированным из пе-|18-20 ч |прозрачная без|гающиеся отдельно или | | |град. С,|реплетающихся во- | |осадков |цепочками, с хорошо | | |18 - 20 ч |локон | | |выраженной грамположи-| | | | | | |тельной окраской | | | | | | | | |Bacillus cereus,|Среда N 1,|Гладкие колонии с|МПБ, рН |Равномерное пому-|Тонкие с закругленными| |var. mycoides |Т град.|ровными краями и|6,8-7,0, |тнение бульона|концами палочки, рас-| |HB |(36 +/-1)|сферической по-|18-20 ч |без образования |полагающиеся отдельно| | |град. С,|верхностью | |пленки и осадка |или короткими цепочка-| | |18 - 20 ч | | | |ми, с хорошо выражен-| | | | | | |ной грамположительной| | | | | | |окраской | |Bacillus pumi- |Среда N 1,|Мелкие серовато -|МПБ, рН |Равномерное пому-|Тонкие, мелкие палочки| |lus NCTC 8241 |Т град.|голубого цвета ко-| 7,2-7,4, |тнение бульона|с закругленными конца-| | |(36 +/-1)|лонии с зазубрен-|18-20 ч |без образования |ми, располагающиеся| | |град. С,|ными краями и при-| |пленки и осадка |отдельно или короткими| | |18 - 20 ч |поднятым центром | | |цепочками, с хорошо| | | | | | |выраженной грамотрица-| | | | | | |тельной окраской | |Bordetella |МПА, |Мелкие, мутные,|МПБ, |Заметное помутне-|Одиночные, короткие,| |bronchiseptica |рН 7,2-7,4|белые, слегка вы-|рН 7,2-7,4|ние, серая плен-|тонкие палочки с хоро-| |ATCC 4617 |Т град.|пуклые, фарфоро-| |ка, тягучий оса- |шо выраженной грам-| | |(36 +/-1)|видные колонии | |док |отрицательной окраской| | |град. С,| | | | | | |18 - 20 ч,| | | | | | | | | | | | |Pseudomonas |МПБ, |Широкие, расплыв-|МПБ, |Заметное помутне-|Одиночные палочки либо| |aeruginosa |рН 7,2-7,4|чатые, прозрачные|рН 7,2-7,4|ние, толстая|короткие цепочки с хо-| |NCTC 2134 |Т град.|с неровным краем| |пленка, среда мо-|рошо выраженной грам-| | |(36 +/-1)|колонии | |жет приобретать|отрицательной окраской| | |град. С,| | |желтовато - зеле-| | | |18 - 20 ч,| | |ную окраску | | ----------------------------------------------------------------------------------------------------- Шесть стерильных цилиндров единого размера и массы, высотой (10,0 +/-0,1) мм и внутренним диаметром (6,0 +/-0,1) мм, из нержавеющей стали или алюминия расставляют на поверхности засеянной среды на равном расстоянии друг от друга и от края чашки. Вместо цилиндров могут быть использованы лунки диаметром от 6 до 8 мм, сделанные в толще агара с помощью стерильного сверла либо другого соответствующего приспособления. В цилиндры или лунки каждой чашки вносят равные объемы рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов. Основные растворы стандартных и испытуемых образцов готовят в стерильных растворителях с концентрацией 1 мг/мл. Затем из основных растворов в зависимости от применяемого варианта метода диффузии в агар (трехдозного или с построением стандартной кривой) готовят рабочие растворы трех или одной концентраций испытуемого образца и растворы трех или пяти концентраций стандартного образца. Рабочие растворы испытуемых образцов готовят из основных растворов таким образом, чтобы их концентрации не имели существенных отличий от концентраций раствора стандартного образца. Для уменьшения влияния колебаний во времени между закапыванием растворов, используемых в опыте, рекомендуется после их внесения выдерживать чашки при комнатной температуре в течение 1-2 ч. Затем чашки инкубируют при температуре (36 +/-1) град. С в течение 16-18 ч. Диаметры зон угнетения роста тест - микроба при помощи соответствующих приборов измеряют с точностью до 0,1 мм. Определение антимикробной активности антибиотиков с использованием трехдозного варианта метода диффузии в агар. Для проведения испытания готовят три раствора стандартного образца (C1, С2, С3) и три раствора испытуемого образца (И1, И2, И3). Концентрации растворов, содержащих малую, среднюю и большую дозы, должны находиться между собой в кратном соотношении (1:2:4). При необходимости это соотношение может быть изменено. Концентрация раствора С2 должна быть близка контрольной концентрации раствора стандартного образца, указанной в табл. 17. Все растворы стандартного и испытуемого образцов вносят в цилиндры или лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы растворы с большими концентрациями не соприкасались между собой. Предлагаемый вариант закапывания С1И3С2И1С3И2. Число чашек, используемых в каждом опыте, должно быть достаточным для обеспечения статистической достоверности результатов, но не менее 6 чашек. Последовательность внесения растворов стандартного и испытуемого образцов в цилиндры или лунки каждой чашки должна быть следующей: первым вносят раствор с малой концентрацией стандартного образца (C1) и соответствующий раствор испытуемого образца (И1). Затем растворы со средней концентрацией (С2 и И2), последними вносят растворы с большими концентрациями (С3 и И3). Расчет активности и дисперсионный анализ при использовании трехдозного варианта метода диффузии в агар осуществляется в соответствии со статьей "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний" (ГФ XI, вып. 1, с. 199). В разделе II.5 данной статьи растворы определенных концентраций стандартного (С) и испытуемого (И) образцов S U обозначены D и D соответственно. Определение антимикробной активности антибиотиков с использованием стандартной кривой. Постановка опыта. В день постановки анализа из основного раствора готовят пять рабочих растворов стандартного образца C1, С2, С3, С4, C5 с концентрациями, увеличивающимися в геометрической прогрессии (Z), обычно в соотношении 1:1,25. Средняя концентрация (С3) является контрольной и должна быть близка к концентрации, указанной в табл. 17: концентрация C1 - наименьшая, C5 - наибольшая. Для исследования растворов каждой концентрации (кроме контрольной) используют по три чашки. Раствор контрольной концентрации С3 закапывают в три цилиндра (или лунки) каждой из взятых в опыт чашек, в три другие цилиндра (лунки) закапывают раствор одной из концентраций стандартного образца, чередуя его с раствором контрольной концентрации. Таким образом, для построения стандартной кривой используют 12 чашек. После инкубации в термостате измеряют диаметры зон угнетения роста тест - микробов. Далее вычисляют среднюю величину диаметров зон для раствора контрольной концентрации стандартного образца в каждой группе из трех чашек, затем среднюю величину диаметров зон для раствора контрольной концентрации стандартного образца из всех 12 чашек (общую среднюю из 36 зон). По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, установленной из 12 чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации, установленной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней величине диаметра зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если она отрицательная. Пример. Общая средняя величина зоны для раствора контрольной концентрации стандартного образца 1 мкг/мл, рассчитанная из 36 зон, равна 19,2 мм. Средняя величина зоны для раствора той же концентрации, установленная из 3 чашек, на которых испытывался раствор с концентрацией 0,83 мкг/мл стандартного образца, равна 19 мм. Следовательно, величина поправки будет +0,2 мм. Средняя величина зоны для концентрации 0,83 мкг/мл равна 17,9 мм; прибавляя поправку +0,2 мм, получаем величину 18,1 мм. Таким образом исправляют значение величины зон для растворов всех концентраций стандартного образца и получают величины d1, d2, d4, d5. Для исследования активности испытуемого образца проводят несколько определений, используя для каждого по 3 чашки, в которые закапывают раствор контрольной концентрации стандартного образца и раствор испытуемого образца с концентрацией, близкой к контрольной. Внесение растворов контрольной концентрации стандартного и испытуемого образцов в каждой группе из трех чашек должно проводиться одномоментно. После инкубации измеряют зоны угнетения роста тест - микроба, образуемые растворами контрольной концентрации стандартного и испытуемого образцов. Находят среднее значение величин зон из 3 чашек. Расчет антимикробной активности испытуемых образцов по стандартной кривой может быть проведен двумя способами: графическим методом или путем непосредственного расчета с использованием соответствующих формул. Расчет активности испытуемого образца графическим методом. По исправленным значениям диаметров зон d1, d2, d4, d5 для всех концентраций растворов стандартного образца C1, C2, С4, C5 и общей средней величине диаметров зон для контрольной концентрации d3 вычисляют с использованием метода наименьших квадратов размеры зон Dmin и Dmax для низкой и высокой концентраций растворов стандартного образца: Dmin = (3d1 + 2d2 + d3 - d5) / 5; Dmax = (3d5 + 2d4 + d3 - dl) / 5, по которым затем строят стандартную кривую на полулогарифмической сетке расчета биологической активности антибиотиков, откладывая на оси абсцисс величины зон, на оси ординат - соответствующие им концентрации растворов стандартного образца. Разность между найденными средними величинами зон угнетения роста тест - микроба раствором испытуемого образца и раствором контрольной концентрации стандартного образца из тех же чашек прибавляют к значению величины зоны, соответствующей контрольной концентрации на кривой (D3). Затем по кривой находят концентрацию, соответствующую |