ГФ №11, том 2. Общие методы анализа лекарственное растительное сырье редакционная коллегия
 Скачать 1.25 Mb.
|
|
|Мочевина | | | | | | | |Аммония цитрат | | | | | | | |двузамещенный | | | | | | | |Аммония хлорид | | | | | | | |Вода | | | | | | | |дистиллированная| | | |1000 мл|1000 мл|1000 мл | |рН после | | | | | | | |стеризации |7,0-7,2|7,8-8,0|7,0-7,2|6,0-6,2|7,8-8,0|6,8-7,0 | ------------------------------------------------------------------- Продолжение ------------------------------------------------------------------- | | Номера сред | | Ингредиенты |------------------------------------------------| | | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |-----------------------------------------------------------------| | Содержание каждого ингредиента | |-----------------------------------------------------------------| |Мясо - пептонный| | | | | | | |бульон 1:2 | | | | | | | |Ферментативный | 5 г | 5 г | 5 г | 5 г | | | |гидролизат био-| | | | | | | |массы микроорга-| | | | | | | |низмов без обо-| | | | | | | |лочек | | | | | | | |Агар - агар |10-12г |10-12г | 15 г |10-15г |15-20 г|15-20 г | |Глюкоза | | | | | | | |Натрия фосфат | 3 г | 3 г | 3 г | | 3 г | 3 г | |двузамещенный | | | | | | | |Калия фосфат | | | | 25 г | | | |однозамещенный | | | | | | | |Натрия хлорид | | | | | | | |Калия хлорид | | | | | | | |Мочевина | | | | | | | |Аммония цитрат | | | | | | | |двузамещенный | | | | | | | |Аммония хлорид | | | | | | | |Вода |1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл | |дистиллированная| | | | | | | |рН после |6,8-7,0|7,8-8,0|7,8-8,0|6,0-6,2|6,8-7,0|7,8-8,0 | |стерилизации | | | | | | | ------------------------------------------------------------------- Продолжение ------------------------------------------------------------------- | | Номера сред | | Ингредиенты |------------------------------------------------| | | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | |-----------------------------------------------------------------| | Содержание каждого ингредиента | |-----------------------------------------------------------------| |Мясо - пептонный| | | | | | | |бульон 1:2 | | | | | | | |Ферментативный | 5 г | 5 г | 5 г | | | 5 г | |гидролизат био-| | | | | | | |массы микроорга-| | | | | | | |низмов без обо-| | | | | | | |лочек | | | | | | | |Агар - агар | 20 г | 15 г | 15 г |18-20 г| 18 г | 15-20 г| |Глюкоза | | | | | 5 г | 5 г | |Натрия фосфат | | | | 5 г | 15 г | | |двузамещенный | | | | | | | |Калия фосфат | | | 25 г | | | | |однозамещенный | | | | | | | |Натрия хлорид | | | | 20 г | | 30 г | |Калия хлорид | 20 г | | | 20 г | | | |Мочевина | | | | | 2 г | | |Аммония цитрат | | | | 5 г | | | |двузамещенный | | | | | | | |Аммония хлорид | | | | | 2г | | |Вода |1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл | |дистиллированная| | | | | | | |рН после |7,0-7,2|7,8-8,0|7,0-7,2|5,8-6,0|7,8-8,0|6,8-7,0 | |стерилизации | | | | | | | ------------------------------------------------------------------- Мясо - пептонный бульон (среда N 1) готовят на водопроводной воде обычным способом, изложенным в руководствах по микробиологии. Примечания: 1. Количество агар - агара в средах указано для цилиндро - чашечной модификации. В случае применения лунок количество агар - агара увеличивают до 20-25 г на 1000 мл среды. 2. Допускается уменьшение или увеличение содержания агар - агара в средах в зависимости от его качества. 3. Допускается использование взамен сред с ферментативным гидролизатом биомассы микроорганизмов (без оболочек) сред с другими источниками аминного азота: а) сухих сред на основе сухого рыбного бульона. При использовании данной среды в отдельных случаях необходимо изменение посевной дозы тест - микроба и увеличение концентрации растворов стандартных и испытуемых образцов; б) сред на основе панкреатического гидролизата мяса (по Хоттингеру) глубокого расщепления. Среды N 6, 7, 8, 10 должны содержать 130-140 мг% аминного азота, а среды N 4, 5, 9, 13 - 30 - 35 мг% аминного азота. Для приготовления сред с гидролизатом мяса применяют дистиллированную воду. Панкреатический гидролизат мяса и среды на его основе готовят обычным способом, изложенным в руководствах по микробиологии. Условия проведения анализа на средах с панкреатическим гидролизатом не отличаются от условий проведения анализа на средах с ферментативным гидролизатом биомассы микроорганизмов без оболочек. При контроле активности антибиотиков применяются буферные растворы, состав которых приводится в табл. 20. Таблица 20 Состав буферных растворов -------------------------------------------------------------------- | Ингредиенты буферов | Содержание ингредиентов | | |---------------------------------------| | | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |--------------------------+-------+-------+-------+-------+-------| |Калия фосфат однозамещен- | | | | | | |ный, г | 3,63 | - | 7,72 | 0,68 | 32 | |Калия фосфат двузамещен- | | | | | | |ный, г | - | - | | | 8 | |Натрия фосфат двузамещен- | | | | | | |ный, г | 7,13 | - | 1,78 |10,99 | - | |Натрия цитрат трехзамещен-| | | | | | |ный, г | - | 20,6 | - | - | | |Кислота хлористоводородная| | | | | | |концентрированная, г | - | 1,81 | - | - | | |Вода дистиллированная, до| | | | | | |1000 мл | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | |рН буфера |6,8-7,0|5,8-6,0|6,0-6,2|7,8-8,0|6,0-6,2| -------------------------------------------------------------------- Приложение 1 Вычисление ошибки логарифма активности испытуемого S lg C U проводится согласно разделу I.6 фармакопейной статьи "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний". 2 Сначала вычисляют величину дисперсии S , характеризующую 0 разброс значений d1, d2, d3, d4, d5 относительно прямой D = a + b x lg C: 2 5 2 S = [ SUM (di - (а + b x lg Ci)) ] / 3 0 i=1 Тогда: -------------------------------------------------- / 2 _ _2 / S 5 (d - d ) / 0 1 U S S = / ----- (0,2 + -- + ------------------------------), lg C / 2 n 2 5 2 5 2 U \/ b b (5 SUM lg Ci - SUM lg Ci) i=1 i=1 где n - число параллельных испытаний величины С , приведенных в U опыте с одной стандартной кривой; d - среднее значение диаметра U зон задержки роста для испытуемого, полученное по n испытаниям; d S - среднее значение диаметра зон задержки роста для контрольной концентрации, полученное по тем же n испытаниям. Число степеней свободы величины S равно 3. lg C U Пример. Вычислим S c использованием данных примера, lg C U приведенного в основном тексте статьи для иллюстрации вычисления параметров стандартной кривой. 2 Расчеты S удобно проводить с помощью следующей таблицы. 0 ------------------------------------------------------------------ | Ci | lg Ci | di | a + b x | 2| 2 | | | | | x lg Ci |[di - (a + b x lg Ci)] |lg Ci | |--------+--------+-----+---------+-----------------------+------| | 3,2 | 0,5051 |17,64| 17,63 | 0,0001 |0,2551| | 4,00 | 0,6021 |18,15| 18,26 | 0,0121 |0,3625| | 5,00 | 0,6990 |19,03| 18,90 | 0,0169 |0,4886| | 6,25 | 0,7959 |19,58| 19,53 | 0,0025 |0,6334| | 7,8 | 0,8921 |20,09| 20,16 | 0,0049 |0,7958| |--------+--------+-----+---------+-----------------------+------| |Суммы по| | | | | | |столбцам| 3,4942 | | | 0,0365 |2,5354| ------------------------------------------------------------------ При вычислении значений а + b x lg Ci необходимо брать достаточное число знаков для а и Ь. Пусть число испытаний образца в опыте n = 1, d = 18,61 и d = S U 18,44 _ Тогда d = d = 18,61; d = d = 18,44. Найдем S : S S U U lg C U 2 S = 0,0365 / 3 = 0,01217; 0 --------------------------------------------------- / 2 /0,01217 5 x (18,44 - 18,61) S = / ------- x (0,2 + 1+ x ------------------------------ = lg C / 2 2 2 U \/ 6,532 6,532 x (5 х 2,5355 - 3,4943) = 0,0185. Приложение 2 Объединение результатов n опытов, выполненных с одним и тем же разведением образца гамма , проводится усреднением значений U логарифмов активностей испытуемого с учетом ошибок их определения в каждом опыте по формуле: _ N N lg C = (SUM gj x lg C ) / SUM gj, U j=1 Uj j=1 2 где gj = 1 / S x lg C . Uj _ Ошибка определения величины lg С при этом будет равна: U ------ / N S _ = 1 / / SUM gj . lg C \/ j=1 U Доверительный интервал для величины логарифма истинной активности записывается с учетом значения критерия Стьюдента, взятого из таблиц для доверительной вероятности Р = 0,95 и числа N степеней свободы f = SUM fj, где fj - число степеней свободы j=1 величины S : lg С Uj _ lg C +/- t(P, f) S _ U lg C . U Пример. Проведены два опыта по определению активности препарата. Разведение испытуемого гамма = 200. В первом опыте два U испытания дали следующие результаты: lg С1 = 0,6221; S = 0,0170 при f1 = 3. lg С1 Во втором опыте по четырем испытаниям имели: lg C2 = 0,6305; S = 0,0099 при f2 = 3. lg C2 Для объединения результатов проводят следующие вычисления: 2 g1 = 1 / 0,017 = 3460; 2 g2 = 1 - 0,0099 = 10203; g1 + g2 = 13663; _ lg С = (3460 х 0,6221 + 10203 х 0,6305) / 13663 = 0,6284; U ------ S _ = 1 / \/ 13663 = 0,0086. lg С U Границы доверительного интервала для логарифма истинной активности образца получают с использованием величины t(0,95; 6) = 2,45: 0,6284 +/- 2,45 х 0,0086 = 0,6284 +/- 0,0211. Таким образом, нижняя граница 0,6073, верхняя граница 0,6495. Потенцируя, найдем среднее значение и границы доверительного интервала для истинной активности основного рабочего раствора испытуемого: 4,250; 4,049; 4,462. Учет степени разведения при получении основного рабочего раствора позволяет получить среднее значение, а также нижнюю и верхнюю границу несимметричного доверительного интервала для истинной активности испытуемого: 850; 810; 892. Точность определения должна быть такова, чтобы доверительные границы при Р = 95% отклонялись от среднего значения не более чем на +/- 5%. В данном случае, используя верхнюю границу доверительного интервала, имеем: 892 - 850 42 --------- х 100% = ----- х 100% = 4,94% < 5%. 850 850 ЛЕКАРСТВЕННОЕ РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ 1. CORMUS LEDI PALUSTRIS ПОБЕГИ БАГУЛЬНИКА БОЛОТНОГО Собранные в августе - сентябре в фазу созревания плодов и высушенные олиственные побеги текущего года дикорастущего вечнозеленого кустарника багульника болотного - Ledum palustre L., сем. вересковых - Ericaceae. Внешние признаки. Цельное сырье. Смесь олиственных побегов, листьев и небольшого количества плодов. Листья очередные, на коротких черешках, кожистые, линейно - продолговатые или продолговато - эллиптические, цельнокрайние, длиной 15-45 мм, шириной 1-5 мм, с завернутыми вниз краями; с верхней стороны темно - зеленые, блестящие; с нижней стороны покрыты густым оранжево - коричневым войлочным опушением. Стебли цилиндрические с оранжево - коричневым войлочным опушением. Плод - многосемянная продолговатая коробочка 3-8 мм длиной, железисто - опушенная, раскрывающаяся при созревании снизу вверх пятью створками. Запах резкий, специфический. Вкус не определяется. Измельченное сырье. Кусочки стеблей, листьев и плодов, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм. Цвет зеленый, темно - зеленый, оранжево - коричневый, серовато - коричневый. Запах резкий, специфический. Вкус не определяется. Примечание. Сырье, предназначенное для получения ледина, не измельчают. Микроскопия. При рассмотрении листа с поверхности видны клетки эпидермиса с обеих сторон листа - мелкие с тонкими или четковидно - утолщенными извилистыми стенками, над жилками - с прямыми. Устьица только на нижней стороне, крупные, приподнятые, с 4-8 околоустьичными клетками (аномоцитный тип). Верхняя сторона листа покрыта толстой кутикулой; волоски встречаются редко. Нижняя сторона густо опушена волосками трех типов: длинные, многоклеточные, лентовидные, извилистые и перекрученные волоски, состоящие из двух рядов клеток, с красно - коричневым содержимым; мелкие одноклеточные волоски с толстой оболочкой, покрытой бородавчатой кутикулой; головчатые волоски на одно- или многоклеточной ножке с многоклеточной круглой головкой, содержащей маслянистые капли. Эфиромасличные железки встречаются на обеих сторонах листа, но больше на нижней; они состоят из крупной округлоприплюснутой головки, образованной клетками двух типов: 6-10 мелких округлых клеток, расположенных у основания железки, и 10- 12 крупных почти плоских клеток, образующих купол над первыми; ножка железки короткая двухрядная, из нескольких мелких клеток. Мезофилл листа характеризуется ярко выраженной аэренхимой и содержит друзы оксалата кальция, реже одиночные призматические кристаллы и их сростки. Числовые показатели. Цельное сырье. Эфирного масла не менее 0,1%; влажность не более 14%; золы общей не более 4%; золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 1%; серовато - коричневых стеблей не более 10%; органической примеси не более 1%; минеральной примеси не более 0,5%. Примечание. Содержание эфирного масла в сырье, предназначенном для получения ледина, должно быть не менее 0,7% и ледола в нем не менее 17%. Определение содержания ледола в эфирном масле проводит завод - изготовитель препарата ледина. Измельченное сырье. Эфирного масла не менее 0,1%; влажность не более 14%; золы общей не более 4%; золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 1%; кусочков серовато - коричневых стеблей не более 10%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм, не более 5%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм, не более 10%; органической примеси не более 1%; минеральной примеси не более 0,5%. Количественное определение. Определение содержания эфирного масла. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц 1-3 см. Для определения содержания эфирного масла берут 30 г измельченного сырья, помещают в колбу вместимостью 1000 мл и прибавляют 400 мл воды. Определение содержания эфирного масла проводят методом 2 (ГФ XI, вып. 1, с. 290). Время перегонки - 4 ч, после чего охлаждение холодильника прекращают с тем, чтобы закристаллизовавшаяся часть эфирного масла на стенках холодильника расплавилась и опустилась в приемник. Определение содержания ледола в эфирном масле. Эфирное масло нагревают на водяной бане при температуре 60 град. С до полного расплавления кристаллов ледола и осторожно перемешивают тонкой стеклянной палочкой или стеклянным капилляром с запаянным концом. Пробу эфирного масла отбирают (не допуская попадания водной фазы) пипеткой, подогретой до той же температуры на той же бане в отдельной пробирке. Затем немедленно во взвешенную (с погрешностью +/-0,01 г) колбу вместимостью 50 мл с притертой или плотно закрывающейся полиэтиленовой пробкой помещают около 0,2 г (точная навеска) эфирного масла и около 0,06 г (точная навеска) метилового эфира миристиновой кислоты, пипеткой прибавляют 20 мл 95% спирта и перемешивают до полного растворения компонентов; 1-2 мкл полученного раствора с помощью микрошприца вводят в испаритель |