Общие свойства вирусов, влияющие на специфику диагностики вирусн. Общие свойства вирусов, влияющие на специфику диагностики вирусных инфекций
 Скачать 304.84 Kb.
|
|
Общие свойства вирусов, влияющие на специфику диагностики вирусных инфекций Вирусы – это облигатные внутриклеточные паразиты, не имеющие клеточного строения, собственного аппарата синтеза биополимеров. Проникая в клетку, вирус эксплуатирует её. Зараженная клетка начинает функционировать не по программе собственного, а по программе вирусного генома, т.е. отличается паразитизмом на генетическом уровне. Размножаются вирусы путем репродукции – дисъюнктивный (разобщенный) способ, когда в разное время и в разных участках клетки синтезируются компоненты вирусов, а затем происходит их сборка. Вирусы находятся на грани живого и неживого: внутри клетки это существо, вне клетки - вещество. Находящийся вне клетки вирус называется вирионом. Вирусы относятся к царству Virae. Строение вирусов. По тому, как устроены вирусы, они подразделяются на простые и сложные. Простые вирусы состоят из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) окруженной капсидом (лат. сapsa – футляр). Капсид представляет собой белковую оболочку, включающую в себя повторяющиеся морфологические субъединицы – капсомеры, видимые в электронном микроскопе. Количество капсомеров постоянная величина для определенных вирусов и учитывается при идентификации вируса. Ассоциация вирусных протеинов капсида вируса с нуклеиновой кислотой называется нуклеокапсидом. Сложные вирусы, кроме нуклеиновой кислоты и капсида, имеют еще одну липопротеиновую оболочку – суперкапсид или пеплос. На ней расположены гликопротеиновые шипы или шипики (пепломеры). Капсид и суперкапсид защищают вирусы от неблагоприятных факторов окружающей среды, обеспечивают избирательное взаимодействие своими рецепторными белками с определенными клетками, а также антигенные и иммуногенные свойства вирусов. Генетический материал вируса представлен либо ДНК, либо РНК. У многих РНК-содержащих вирусов и некоторых ДНК-содержащих геном часто представлен несколькими молекулами (частями), в связи с чем он называется сегментированным. Вирусные геномы независимо от типа нуклеиновой кислоты бывают либо одноцепочечными, либо двухцепочечными. Двухцепочечный геном включает пару комплементарных цепей нуклеиновой кислоты, а одноцепочечный – только одну цепь. Для большинства РНК-содержащих вирусов и некоторых вирусов с одноцепочечной ДНК определяют полярность нуклеиновой кислоты в зависимости от того, комплементарна ли она вирусной матричной или информационной РНК (мРНК или иРНК). Молекула РНК с положительной полярностью (плюс – цепь) имеет ту же последовательность нуклеотидов, что и мРНК, поэтому какая – то её часть может незамедлительно начать транслироваться клеткой – хозяином на рибосомах. РНК с отрицательной полярностью (минус - цепь) комплементарна мРНК, но не содержит необходимой для трансляции на рибосомах последовательности нуклеотидов и генов. Поэтому до начала трансляции на ней должна быть синтезирована положительная РНК при помощи фермента РНК-зависимой РНК-полимеразы. Названия цепей ДНК для вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК, сходны с таковыми для РНК: кодирующая цепь комплементарна мРНК (минус – ДНК-нить), а некодирующая является её копией (плюс - ДНК – нить). В вирусах имеются структурные и неструктурные белки. Структурные белки обусловливают строение вирусов, а неструктурные белки принимают участие в репродукции вирусов. В состав суперкапсида входят липиды и полисахариды. Размеры вирусов исчисляются в нм (1 нм = 1/1000мкм). Определить размеры вирусов можно с помощью электронного микроскопа, путем фильтрации через фильтры с известным диаметром пор, а также путем ультрацентрифугирования. Различают мелкие вирусы (до 70 нм), средние (до 150 нм), крупные (до 350 -400 нм). Форма вирусов. Вирусы отличаются формой вириона. Это также учитывается при идентификации обнаруженных в исследуемом материале вирусов. Они могут быть сферической формы (вирусы полиомиелита, вирусы иммунодефицита человека, ротавирусы), палочковидной (вирус мозаичной болезни табака), пулевидной (вирус бешенства), сперматозоидной (бактериофаги) и неправильной формы (коронавирус). Культивирование вирусов. Поскольку вирусы не растут на питательных средах и для их репродукции нужна живая клетка, культивирование можно проводить в организме чувствительных лабораторных животных, курином эмбрионе и в культурах клеток или культурах тканей. Культивирование вирусов необходимо для вирусологической диагностики инфекций, изучения вопросов патогенеза, иммунитета при вирусных заболеваниях, получения вакцин и диагностических препаратов. Лабораторные животные использовались на первых этапах развития вирусологии, но и теперь возникает необходимость их применения наряду с другими методами культивирования. Преимущество отдается новорожденным животным, которые более чувствительны к вирусной инфекции. В каждом конкретном случае выбирают наиболее чувствительных к предполагаемому вирусу животных, у которых отмечаются четкие клинические проявления, патоморфологические изменения или их гибель. Существуют различные способы введения исследуемого материала лабораторным животным. Выбор способа зависит от тропизма вируса. Если предполагается, что в исследуемом материале присутствуют нейротропные вирусы (вирусы бешенства, полиомиелита, арбовирусы) следует выбрать способ заражения в мозг. Интраназальный способ больше подходит для обнаружения вирусов, вызывающих респираторные инфекции. Возбудители оспы и простого герпеса могут быть обнаружены в исследуемом материале от больного при нанесении этого материала на скарифицированную роговицу или кожу. Куриные эмбрионы. В вирусологическую практику куриные эмбрионы были внедрены в 1931 году и широко используются для культивирования вирусов гриппа, оспы, герпеса и др. В курином эмбрионе есть следующие образования: аллантоисная полость, хорионаллантоисная оболочка, желточный мешок, амниотическая полость. Введение материала в аллантоисную полость проводится для культивирования вирусов гриппа, вируса везикулярного стоматита, вируса Ньюкасл. Используют при этом 10-11-дневные куриные эмбрионы. На хорионаллантоисную оболочку вносят материал, содержащий, например, вирус натуральной оспы. Заражение в амниотическую полость используют для культивирования вирусов гриппа и вируса Ньюкасл. В желточном мешке культивируются хламидии, риккетсии, некоторые вирусы. Выбор того или иного образования куриного эмбриона для введения исследуемого материала определяется тропизмом вируса и целью заражения. При заражении вводят 0,1-0,2 мл инфекционного материала. Независимо от способа введения материала скорлупу яиц перед заражением обрабатывают этиловым спиртом и 2% спиртовым раствором йода. Заражение в полость аллантоиса проводят следующим образом: в скорлупе над воздушным мешком прокалывают отверстие, через которое туберкулиновым шприцем вводят иголку на 2-3 мм ниже границы воздушного мешка и впрыскивают исследуемый материал в объёме 0,1-0,2 мл. Прокол в скорлупе заливают расплавленным стерильным парафином или заклеивают лейкопластырем. Заражение в полость амниона проводят под контролем овоскопа в затемненном боксе. Материал вводят через прокол в скорлупе с тупого конца вертикально размещенного эмбриона. При заражении в желточный мешок яйцо кладут на подставку горизонтально так, чтобы тело эмбриона было направлено вниз, а желток находился над ним. Иглой для внутримышечных инъекций (глубина проникновения 2/3 длины иглы) по центру большой оси яйца в скорлупе делают прокол в области воздушного мешка и шприцем вводят исследуемый материал. Заражение в хорионаллантоисную оболочку заключается в том, что над воздушным мешком вертикально расположенного яйца, ножницами вырезают кусочек скорлупы, создавая оконце, потом отслаивают оболочку под скорлупою, освобождая участок хорионаллантоисной оболочки, на которую наносят исследуемый материал. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем. После заражения эмбрионы инкубируют в термостате, размещая их тупым концом кверху. Длительность инкубации и температура зависят от биологических свойств исследуемого вируса. Перед вскрытием эмбрионы охлаждают, достигая максимального сужения кровеносных сосудов. Вскрытие куриных эмбрионов проводят в стерильных условиях. После обработки яйца спиртом и 2% раствором йода, выкраивают в скорлупе над воздушным мешком отверстие. Отрезанную скорлупу убирают, пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают аллантоисную, а потом амниотическую жидкость и вносят их в пробирки. Если необходимо исследовать хорионаллантоисную оболочку, то её разрезают, содержимое яйца выливают в чашку Петри, сохраняя хорионаллантоисную оболочку на скорлупе. После ополаскивания физиологическим раствором её отделяют от скорлупы, помещают в стерильную чашку Петри и рассматривают на темном фоне, отмечая специфические поражения. Если необходимо исследовать амнион, содержимое яйца выливают в чашку Петри и выделяют амнион. Желточную оболочку разрезают и освобождают от желтка, промывают физиологическим раствором и исследуют. Культивирование вирусов в культурах клеток. Важным в истории развития вирусологии было открытие в 1949 году Дж. Эндерсом с соавторами способности вируса полиомиелита размножаться в клетках ткани эмбриона человека. За разработку техники культивирования клеток им была присуждена Нобелевская премия. В последние годы культура клеток широко используется в диагностической работе лабораторий, что в значительной степени связано с усовершенствованием техники культивирования, разработкой новых составов питательных сред и аппаратуры для различных режимов инкубирования культур клеток. Этому обстоятельству способствовали также более ранние сроки получения необходимой информации о возбудителе, возможность стандартизации исследований, а также относительная дешевизна работы с культурами клеток. Изолированные клетки получают из различных органов и тканей человека, животных, птиц, других биологических объектов и жизнедеятельность их поддерживают в специальной лабораторной посуде, прибавляя туда питательных для них среды. Культуры клеток подразделяют на культуру переживающих тканей, в которых клетки не размножаются, а какое-то время сохраняют свою жизнеспособность, и культуры растущих клеток, в которых клетки растут, делятся. Среди последних чаще используют в вирусологической практике однослойные культуры клеток: первично-трипсинизированные, перевиваемые и полуперевиваемые или диплоидные. Первично-трипсинизированные культуры клеток получают из тканей человека, животных, птиц (чаще используют эмбриональную ткань, т.к. эмбриональные клетки быстрее растут и размножаются). Ткань отмывают от крови сбалансированным солевым раствором Хенкса с антибиотиками, измельчают ножницами на кусочки размером 2-3 мм и погружают в 0,25% раствор трипсина, инкубируют при t 37˚С, постоянно перемешивая с помощью магнитной мешалки. Под действием фермента трипсина клетки разъединяются. Путем центрифугирования освобождаются от трипсина, к осадку разъединившихся клеток прибавляют питательную среду для культивирования клеток. Клеточную суспензию разводят питательной средой до концентрации 400-800 тыс. клеток в 1 мл, разливают в специальную посуду для культивирования и помещают в термостат при t 37˚С на 48-96 часов. Делясь, клетки образуют монослой на стенках пробирок или флаконов, который обрабатывают затем исследуемым материалом. Перевиваемые культуры клеток. Называют их так потому, что можно переносить (перевивать) из одной пробирки в другую. Как правило, готовят такие культуры клеток из опухолевой ткани: HeLa -из карциномы шейки матки; Hep -1, Hep -2 – из опухоли языка, гортани; Detroit -6 – из костного мозга больного раком легких. Такие культуры способны размножаться десятилетиями, выдерживают многочисленные пассажи. Преимущества перед первично-трипсинизированными культурами клеток состоят в следующем: продолжительность их культивирования, высокая скорость размножения, меньшая трудоёмкость, способность культур сохранять свои свойства в замороженном состоянии в течение многих лет. Полуперевиваемые или диплоидные культуры клеток. Получают из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, характерный для соматических клеток исходной ткани, имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40-50 пассажей. Используют и культуры суспензированных клеток. В такой культуре клетки находятся во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде. Емкость размещается в специальном устройстве – вращающемся барабане. Питательные среды для культивирования клеток. Такие среды имеют сложный состав и содержат все аминокислоты, витамины, микроэлементы, факторы роста, т.е. все то, что необходимо для жизнедеятельности клетки. Промышленность выпускает готовые жидкие среды, например, среду 199, Игла, гидролизат лактальбумина и др., а также сухие концентрированные, которые перед использованием растворяют в дистиллированной воде. К таким питательным средам для выращивания культур клеток добавляют сыворотку человека и животных (эмбриональную телячью сыворотку). Перед использованием среды в неё вносят антибиотики для исключения роста случайно попавших микробов. РН питательных сред поддерживают с помощью буферных систем в пределах 7,2-7,6. В среды добавляют индикатор феноловый красный, который становится оранжево-желтым при закислении и малиновым при защелачивании. Культивирование клеток осуществляют в ёмкостях разной формы и размеров, выполненных из стекла или нетоксичного пластика. Строго придерживаются правил стерильности на всех этапах. Для обнаружения вируса в исследуемом материале отбирают пробирки с хорошим монослоем. Из пробирок, в которых культивируются клетки, выливают среду, монослой промывают раствором Хенкса. В пробирку вносят 0,2 мл исследуемого материала и выдерживают в термостате 1 час. После контакта материал сливают, монослой промывают раствором Хенкса, заливают питательную среду и помещают в термостат при t 37˚С на 7-14 дней для изучения результатов. Состояние монослоя просматривают каждый день до развития изменений в клетках. Морфологические изменения, возникающие во время взаимодействия вируса и клеток, называют цитопатическим действием (ЦПД). Характер цитопатических изменений в инфицированных культурах клеток определяется: 1) свойствами вируса; 2) дозой вируса; 3) свойствами клеток и условиями их культивирования. Для некоторых вирусов характерным является формирование внутриядерных и цитоплазматических включений. Их форма, размер, организация, наличие в них вирусоспецифических нуклеиновых кислот и белков имеют важное диагностическое значение, поскольку отличаются в разных таксономических группах. Включения можно выявить в окрашенных или обработанных флюорохромами препаратах. Для этого культуры клеток выращивают на стеклянных пластинках в пробирках. Потом культуры клеток заражают вирусом и через определенное время инкубации в зависимости от предполагаемого вируса готовят препараты, фиксируют жидкими фиксаторами и окрашивают их красителями (по Романовскому, Павловскому и др.) или флюорохромами (акридином-оранжевым). Для выявления включений можно приготовить мазки-отпечатки из органов и тканей, гистологические срезы (определяют чаще наличие телец Бабеша-Негри для диагностики бешенства). В зараженных культурах клеток присутствие вируса возможно выявить по ЦПД, ЦП, бляшкообразованию, внутриклеточным включениям, в реакции гемадсорбции и гемагглютинации. Взаимодействие вируса с чувствительной клеткой. Осуществляется поэтапно. Условно выделяют ранние этапы (адсорбция, проникновение, освобождение генома вируса от оболочек) и поздние, сопровождающиеся экспрессией вирусного генома и синтезом биомолекул специфичных для вируса, сборкой вирусных компонентов и выходом из клетки. Адсорбция. Прикрепление вирусных частиц к поверхности клетки происходит только при наличии у клеток соответствующих рецепторов, а у вирусов – структурных субстанций, которые узнают эти рецепторы. Распознавание осуществляют капсидные или суперкапсидные белки вирусов (прикрепительные белки). Процесс адсорбции можно нарушить путем прибавления синтетических пептидов, которые конкурируют с прикрепительными белками и рецепторами клеток, путем нейтрализации рецепторов моноклональными антителами и др. Проникновение вируса в клетку. Наиболее распространенный способ проникновения вирусов – рецепторный эндоцитоз. После прикрепления к специфическим рецепторам вирус втягивается в клетку и оказывается в эндоцитарной вакуоли, которая затем сливается с другой внутриклеточной вакуолью. Здесь под действием ферментов вирус освобождается от рецепторов клетки, а один из его поверхностных белков взаимодействует с липидами стенки вакуоли, сливая с ней суперкапсид. Результатом такого слияния есть выход внутреннего субвирионного компонента в цитоплазму, т.е. наряду с процессом проникновения происходит и раздевание – удаление липопротеиновой оболочки вируса. Раздевание. Для того, чтобы проникшая в клетку вирусная частица приобрела инфекционную активность, она должна утратить липопротеиновую оболочку и часть капсидных белков. Раздевание обеспечивает освобождение генома вируса для последующей репродукции. Последующее взаимодействие вируса с клеткой направлено на синтез вирусных макромолекул (нуклеиновых кислот, ранних и поздних вирусных белков и ферментов). При этом вирус полностью использует синтетические механизмы клетки-хозяина. Синтез вирусных белков и нуклеиновых кислот. Этот процесс разобщен во времени и пространстве. Существует 2 варианта синтеза вирусных белков внутри клеток: 1) синтез очень крупных полипептидных молекул – предшественниц, которые после разрезания клеточными или вирусными протеазами формируют полипептидные фрагменты, являющиеся вирусными белками; 2) непосредственный синтез «зрелых» полипептидных молекул на рибосомах, в результате которого сразу образуются вирусные белки, не требующие дополнительной ферментации перед включением в репродуктивный цикл вируса. Синтез вирусных белков происходит в инфицированной клетке с образованием 2 групп белков: неструктурных белков, обслуживающих разные этапы репродукции вируса и структурных белков, которые входят в состав вириона (нуклеопротеины, связанные с геномом вируса, капсидные и оболочечные белки). К неструктурным белкам относятся: ферменты синтеза нуклеиновых кислот (РНК- или ДНК-полимеразы), обеспечивающие транскрипцию и репликацию вирусного генома; белки-регуляторы; предшественники вирусных белков, отличающиеся своей нестабильностью в результате быстрого нарезания на структурные белки; ферменты, модифицирующие вирусные белки (протеиназы, протеинкиназы и т.п.) и др. Синтез белков в клетке осуществляется в соответствии с хорошо известными процессами транскрипции путем «переписывания» генетической информации с нуклеиновой кислоты в нуклеотидную последовательность иРНК или мРНК (ДНК → РНК- прямая транскрипция, РНК→ДНК – обратная транскрипция) и трансляции – считывания иРНК на рибосомах с образованием белков (иРНК→ рибосомы → синтез полипептидной цепи). Наряду с синтезом вирусных белков после освобождения от оболочек вирусной нуклеиновой кислоты начинается процесс репликации, т.е. накопление копий вирусных геномов. Следующий этап – сборка или морфогенез вириона. Формирование вирионов возможно только при условии строгого упорядоченного соединения вирусных структурных полипептидов и их нуклеиновых кислот. В одних вирусах этот процесс происходит в цитоплазме, в других – в ядре клетки хозяина. У сложноорганизованных вирусов, которые имеют внешнюю оболочку, дальнейший сбор осуществляется в цитоплазме во время их выхода из клетки. Так образуется липополисахаридная внешняя оболочка у ортомиксовирусов, поксвирусов, а у герпесвирусов – при выходе из ядра. Выход вирусов из клетки является завершающим этапом её инфицирования. Продолжительность цикла вирусной репродукции колеблется от 6-8 часов (вирус гриппа,пикорнавирусы и пр.) до 40 часов и более (герпесвирусы и др.). Ряд сложных вирусов (миксовирусы и др.) выходят из клетки хозяина «просачиваясь» сквозь её оболочку. В это время нуклеокапсид покрывается суперкапсидом, в состав которого включаются химические компоненты клетки хозяина (липиды, полисахариды). Простые вирусы (полиомиелит) выходят из клетки через образованные отверстия, при этом клетки погибают. Выход вирусных частиц из инфицированной клетки может осуществляться 2 путями: · взрывной путь, когда из погибшей клетки одновременно выходит большое количество вирионов и клетка разрушается; · почкование или экзоцитоз. В некоторых случаях репродукция вирионов (герпеса) в клетках может осуществляться в течение многих месяцев. Вирусы «просачиваются» через клеточную оболочку, а жизнедеятельность клетки сохраняется. При делении таких клеток инфекция передается дочерним клеткам. Так происходит формирование персистирующей инфекции. Инфицирование клетки может иметь следующие последствия. 1. Разрушение клетки (некроз). В культуре клеток наблюдается цитопатический эффект – клетки округляются, отделяются от соседних клеток, образуются многоядерные гигантские клетки, вакуоли и включения. 2. Разрушение клетки (апоптоз) в результате инициации вирусом запрограммированной клеточной гибели. 3. Разрушение клетки в итоге не самим вирусом, а иммунными реакциями организма. 4. Вирус находится внутри клетки, но не разрушает её (латентная инфекция). 5. Вирус трансформирует клетку организма в раковую. Хорошо изучены 3 основные типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный тип, при котором взаимодействие завершается воспроизводством вирусного потомства и часто гибелью зараженных клеток; абортивный тип взаимодействия не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов; интегративный тип взаимодействия (вирогения) характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместной репликацией. Устройство вирусологической лаборатории. Вирусологическая лаборатория должна иметь несколько помещений: собственно лабораторию и подсобные помещения для выращивания культур клеток, обработки и стерилизации посуды, приготовления жидких питательных сред для культур клеток, инкубатора, вивария. Собственно вирусологическая лаборатория строится по типу бактериологической лаборатории с учетом специфики работы с вирусами – выращивания клеточных и тканевых культур, куриных эмбрионов, ультрацентрифугирования, хранения вирусов при низких температурах и др. Она оборудуется для диагностической работы, для изучения свойств вирусов, их структуры, проведения генетических исследований. К помещению вирусологической лаборатории предъявляются определенные требования. Оно должно быть светлым и достаточно просторным, легко мыться с применением дезинфицирующих растворов. С этой целью стены красят масляной краской или облицовывают плиткой. Пол не должен иметь щелей. Помещение оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией. Должна быть подводка холодной и горячей воды. Необходимо предусмотреть установку душевых кабин для сотрудников. В вирусологической лаборатории обязательно наличие отдельного помещения для стерильной работы, состоящего из двух отделений, разделенных стеклянной перегородкой. Внутреннее помещение (бокс) должно быть не большим (6-8 м2), с низким потолком. Дверь должна открываться в предбоксник. Предбоксник отделяется второй перегородкой от остального помещения и служит для одевания стерильной одежды. Для стерилизации бокса и предбоксника используют бактерицидные лампы. Для этой цели можно использовать лампы БУВ, которые устанавливают из расчета 2-2,5 Вт на 1 м2 помещения. В боксе должны находиться лишь необходимые инструменты и посуда, стерилизатор для инструментов, банки с дезинфицирующим раствором, бак с крышкой для зараженного материала. При работе с возбудителями особо-опасных инфекций в боксе устанавливают дополнительно настольный бокс, в котором стерилизуют путем фильтрации как поступающий, так и оттекающий воздух. Основные правила работы с особо-опасными возбудителями регламентируются специальной инструкцией. Помимо обычной бактериологической посуды, в вирусологической лаборатории должны быть гомогенизатор для измельчения тканей, магнитные мешалки, микроскопы, центрифуги различной мощности. Необходимы термостаты, одновременно работающие при различной температуре (от 25 до 40˚С), в том числе с подачей углекислого газа. Вирусологическая лаборатория оборудуется холодильными камерами с температурой +4, -20 и -40˚С. В отделениях по приготовлению сред необходимо иметь установки для обработки воды, которая дважды дистиллируется в стеклянных аппаратах или деионизируется на колонках с ионообменными смолами. Для стерилизации растворов, которые нельзя автоклавировать, используют асбесто-бумажные стерилизующие пластины Зейтца. Рабочий стол вирусолога покрывают линолеумом или стеклом. На столе помещают газовую горелку, банку для пипеток с дезинфицирующим раствором, набор штативов для пробирок, эмалированные кюветы, пинцеты, ножницы, скальпель, чистые предметные стекла с лунками и без них, покровные стекла. Микроскопы хранят под стеклянным колпаком. В лаборатории должна быть раковина с подводкой воды, над которой на полке размещают бутыль с раствором для дезинфекции рук. Правила забора и транспортировки материала. Пробы необходимо забирать асептически, не допуская их загрязнения. Каждую пробу необходимо брать в отдельный стерильный флакон. Масса каждой пробы должна быть не менее 5-10 мл или грамм. Все флаконы должны герметически закрываться пробками, продезинфицированы снаружи, высушены и промаркированы. Надписи необходимо делать с указанием Ф.И.О. пациента, названия органа и даты забора материала. Принципы методов вирусологической диагностики вирусных инфекций Диагностика вирусных инфекций основана на обнаружении возбудителя в острой стадии болезни и на выявлении прироста антител у реконвалесцентов. Для некоторых инфекций разработаны экспресс-методы, которые позволяют обнаружить возбудителя непосредственно в пробах от больного. Используют: 1. Микроскопический 2. Вирусологический 3. Серологический 4. Экспресс-метод 5. Молекулярно-генетический. Выбор метода определяется характером заболевания, предполагаемым возбудителем и решается в каждом случае в зависимости от периода болезни и возможности лаборатории. Микроскопический метод. Вирус можно непосредственно увидеть с помощью электронного микроскопа, но это доступно только крупным лабораториям, специализированным центрам, так как приобретение электронного микроскопа и его обслуживание требует больших материальных затрат. Недостатком является также то, что при небольшой концентрации возбудителя в изучаемом препарате его можно не увидеть. Этот недостаток отчасти устраняется применением иммунно-электронной микроскопии, которая базируется на том, что специфические антитела адсорбируются на вирионах, образуя микропреципитаты. Иммунно-электронная микроскопия дает возможность не только обнаружить вирусы, а и идентифицировать их с помощью специфической сыворотки. Можно использовать иммерсионный микроскоп. Проводится патогистологическое исследование тканей при некоторых вирусных инфекциях. Диагноз может быть установлен при обнаружении телец Гварниери при натуральной оспе, Бабеша-Негри при бешенстве и пр. Однако подобные примеры малочисленны. Патогистологические исследования необходимо дополнять другими методами. Исследование в световом микроскопе применяется для оценки состояния культуры клеток, зараженных вирусами. Возможно использование люминесцентных микроскопов. При обработке нативных и фиксированных препаратов клеток, предположительно содержащих вирусы или их нуклеиновые кислоты, флюорохромами, например, акридин оранжевым – культуры, содержащие ДНК светятся ярко-зелёным цветом, РНК – кирпично- красным под воздействием ультрафиолетовых лучей. Вирусологический метод. При проведении этого метода выявляют вирус в исследуемом материале (индикация) с последующей идентификацией. Является одним из наиболее достоверных доказательств в этиологической диагностике вирусных инфекций. Важным моментом в проведении вирусологического метода является своевременный и качественный забор материала для исследования. Его необходимо брать как можно раньше, в период максимального накопления возбудителя в организме и выделения его во внешнюю среду. Во время доставки в вирусологическую лабораторию исследуемый материал следует помещать в термос или переносной холодильник с минусовой температурой. Транспортировка должна быть проведена в сжатые сроки. В лаборатории исследуемый материал подвергается соответствующей обработке, в том числе и антибиотиками для подавления микробной флоры. ИНДИКАЦИЯ. Обнаружить вирус в исследуемом материале можно по: 1. цитопатическому действию (ЦПД); 2. цветной пробе (ЦП); 3. бляшкообразованию (БО); 4. в реакции гемагглютинации (РГА); 5. в реакции гемадсорбции (РГад); 6. путём заражения животного; 7. путём заражения куриного эмбриона. Суть ЦПД. Здоровую культуру клеток обрабатывают исследуемым материалом. Если вирус есть в материале, он оказывает цитопатическое действие на клетки, которые погибают, открепляются от стекла, меняют свою форму. Таким образом, нарушается монослой культуры клеток. Суть ЦП. Если культура клеток развивается нормально, клетки выделяют кислые продукты и цвет среды (изначально красный) постепенно в процессе инкубации меняется в сторону желтого. Если культуру клеток обработать исследуемым материалом, в котором будут находиться вирусы, они погубят клетки, не будут выделяться кислые продукты и цвет среды не изменится. Суть БО. Монослой культуры клеток обрабатывают исследуемым материалом, покрывают тонким слоем питательной среды с 1,5% агара и красителем нейтральным красным. Через несколько дней культивирования в термостате среди прижизненно окрашенных клеток обнаруживаются бесцветные бляшки, состоящие из дегенерированных клеток. Их количество соответствует числу внесенных вирусных частиц. Эти три теста основаны на повреждающем культуру клеток действии вирусов. Если же вирусы не повреждают клетки, тогда их обнаруживают по другим биологическим свойствам. Используют знания других биологических свойств вирусов. Так, некоторые вирусы, а точнее их гемагглютинины связываются с рецепторами чувствительных эритроцитов, вызывая их агглютинацию. На этом основана реакция гемагглютинации (РГА). К исследуемому материалу, налитому в лунку планшетки, прибавляют эритроциты. Если образуется гемагглютинат («зонтик») - вирус есть в материале, если гемагглютинат не образуется («пуговка») – вируса нет. Реакция гемадсорбции (РГад) основана на прикреплении эритроцитов к участкам поверхности инфицированных клеток, где локализованы гемагглютинины. Культуру клеток обрабатывают исследуемым материалом, а затем прибавляют взвесь эритроцитов. Если вирус есть в клетках, на них адсорбируются эритроциты. Одной из распространенных моделей для вирусологических исследований являются лабораторные животные (белые мыши, крысы, кролики, сирийские хомячки и др.). Исследуемый материал вводят животному. О наличии вируса в исследуемом материале судят по клиническим проявлениям. Выбор вида животного, его возраста, пола, способа заражения определяется выделяемым вирусом. Для обнаружения вирусов применяют и куриный эмбрион. Исследуемый материал вводят в то или иное образование куриного эмбриона (аллантоисную полость, амниотическую полость, хорион-аллантоисную оболочку и пр.) и о присутствии вирусов в материале судят по изменениям в нём. ИДЕНТИФИКАЦИЯ. Проводится с использованием специфических антител (известных диагностических сывороток) в реакциях нейтрализации (РН). Она заключается в нейтрализации инфекционных свойств возбудителя антителами, что основано на специфическом взаимодействии антител с антигеном. Используются те тест-системы, которые брали для индикации. Идентификация осуществляется: 1. В реакции нейтрализации цитопатического действия (РН ЦПД) 2. В реакции нейтрализации цветной пробы (РН ЦП) 3. В реакции нейтрализации бляшкообразования (РН БО) 4. В реакции торможения гемагглютинации (РТГА) 5. В реакции торможения гемадсорбции (РТГад) 6. В реакции нейтрализации на животном 7. В реакции нейтрализации на курином эмбрионе 8. В реакции связывания комплемента (РСК) 9. В реакции преципитации 10. В реакции обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА) Серологический метод. Предусматривает обнаружение антител к тем или иным вирусам в сыворотке крови больных и переболевших. Часто диагноз выставляется ретроспективно. Антитела определяются в парных сыворотках. Первый раз сыворотку крови получают от больного через несколько дней заболевания и определяют в ней количество антител, разводя сыворотку физ. раствором 1:10, 1:20, 1:40, 1:80,1:160. Второй раз (у этого же больного) получают сыворотку через 1-2 недели и также определяют количество антител. Лишь четырехкратное нарастание титров антител позволяет поставить диагноз. Антитела определяют в тех же реакциях (по названию), что используют для идентификации вирусов (см. выше), а также в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), иммуноферментным анализом и др. Экспресс-метод. Для быстрого обнаружения вируса в исследуемом материале используют реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Можно проводить в двух вариантах: прямая РИФ и непрямая РИФ. При прямой РИФ используют антитела, меченые флюорохромом (изотиоционат флюоресцеина), которые содержатся в специфической диагностической сыворотке. Таким образом, поиск определенного антигена осуществляется с помощью конкретных меченых антител – люминесцентных сывороток. При наличии возбудителя (АГ) в исследуемом материале образуется комплекс антиген+антитело с меткой, которая в ультрафиолетовых лучах дает зеленовато-желтое свечение. При непрямой РИФ с исследуемым антигеном вначале взаимодействуют специфичные в отношении его антитела, а уже с ними (первыми антителами) взаимодействуют антивидовые антитела (антитела против иммуноглобулинов диагностической сыворотки) меченые флюорохромом. Преимущества непрямой РИФ состоят в том, что отпадает необходимость иметь большой набор разных специфических флюоресцирующих антител, так как она базируется на использовании антиглобулиновых антител. Непрямую РИФ можно использовать не только для быстрого выявления антигенов (возбудителя), но и для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Радиоиммунный анализ (РИА). В основе радиоиммунного анализа лежит использование известных антител, меченых радионуклеидом, которые вступают в реакцию с искомым антигеном. Иммунные комплексы, образующиеся при этом взаимодействии, выявляют с помощью счетчиков импульсов радиоактивного распада. В РИА можно выявлять и антитела в сыворотке крови обследуемого с помощью известных антигенов меченых радионуклеидом. Широкое использование этого исследования ограничивает создание условий, обеспечивающих безопасность работы с радионуклеидами. Иммуноферментный анализ (ИФА). Включает использование коммерческих реактивов – антител или антигенов меченых ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляющий фермент. Расщепление субстрата вызывает окрашивание среды в желто-коричневый (с использованием пероксидазы) или в желто-зеленый (с использованием фосфатазы) цвет. Существуют многочисленные модификации базовой методики ИФА. Наибольшее распространение получил ИФА на твердой фазе. Для этого коммерческие моноклональные антитела или антигены фиксируют на поверхности лунок пластиковых планшет, в которые потом вносят исследуемый материал, содержащий антигены или антитела. Молекулярно-генетический метод. Основан на идентификации ДНК и РНК, специфичных для того или иного вируса и включает реакцию молекулярной гибридизации (МГ) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В основе ПЦР лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная амплификация ДНК). Этот процесс катализирует фермент ДНК-полимераза. Использование термостабильной ДНК-полимеразы создает возможности для автоматизации синтеза нуклеиновой кислоты in vitro. Реакция высокоспецифична, высокочувствительна. Высокий уровень чувствительности достигается за счет того, что в результате многократного копирования уровень специфической олигонуклеотидной последовательности в пробе возрастает в 106-108 раз. С помощью этой реакции можно быстро получить конечный результат. Реакция молекулярной гибридизации (МГ). Реакция базируется на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90°С) в щелочной среде денатурироваться, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10°С снова восстанавливать начальную двухцепочечную структуру. В реакции молекулярной гибридизации используют молекулярный зонд (одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты с радиоактивной меткой). Зонд запускают в исследуемый материал. При комплементарности между зондом и исследуемой ДНК образуется двойная спираль, что можно выявить с помощью подсчета степени радиации. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и 2 специфических затравок – праймеров. Каждый цикл состоит из 3 стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25-35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для её определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле. Реакция высокоспецифична, очень чувствительна и позволяет обнаружить несколько копий вирусных ДНК в исследуемом материале. В последние годы ПЦР находит всё более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций (вирусы гепатитов, герпеса, цитомегалии, паппиломы и др.). Разработан вариант количественной ПЦР, позволяющий определять число копий амплифицированного сайта ДНК. Методика проведения сложна и недостаточно унифицирована для широкого применения. |