Экзамен перечень 77. Основные исторические этапы развития микробиологии, вклад отечественных и зарубежных ученых. Разделы микробиологии
 Скачать 1.87 Mb.
|
|
Источники антибиотиков. Основными продуцентами природных ан¬тибиотиков являются микроорганизмы, которые, находясь в своей естественной среде (в основном, в почве), синтезируют антибиотики в качестве средства выживания в борьбе за существование. Животные и растительные клетки также могут вырабатывать некоторые вещества с селективным антимикробным действием (например, фитонциды), однако широкого применения в медицине в качестве продуцентов антибиотиков они не получили. Таким образом, основными источниками получения природных и полусинтетических антибиотиков стали: • Актиномицеты (особенно стрептомицеты) — ветвящиеся бактерии. Они синтезиру¬ют большинство природных антибиотиков (80 %). • Плесневые грибы — синтезируют природ¬ные бета-лактамы (грибы рода Cephalosporium и Penicillium)H фузидиевую кислоту. • Типичные бактерии — например, эубактерии, бациллы, псевдомонады — продуцируют бацитрацин, полимиксины и другие вещества, обладающие антибактериальным действием. Способы получения.Существует три основных способа получения антибиотиков: • биологический синтез (так получают при¬родные антибиотики — натуральные продукты ферментации, когда в оптимальных условиях культивируют микробы-продуценты, которые выделяют антибиотики в процессе своей жизнедеятельности); • биосинтез с последующими химическими модификациями (так создают полусинтетические антибиотики). Сначала путем биосинтеза получают природный антибиотик, а затем его первоначальную молекулу видоизменяют путем химических модификаций, например присоединяют определенные радикалы, в результате чего улучшаются противомикробные и фармакологические характеристики препарата; • химический синтез (так получают синтетические аналоги природных антибиотиков, например хлорамфеникол/левомицетин). Морфология и основные структурные элементы бактерий, методы выявления, функциональное значение. Среди основных морфологических форм бактерий различают: • шаровидные {кокковые); • палочковидные. Кокковые бактерии по характеру взаиморасположенияделятся: • на микрококки - отдельное изолированное расположение; • диплококки - сцепленные попарно; • тетракокки - сцепленные по четыре; • стрептококки — сцепленные в цепочку; • сарцины — сцепленные в пакеты по 8, 12, 16 и т. д.; • стафилококки — сцепленные беспорядочно в виде виноградной грозди. Палочковидные бактерии различаются: • по форме: • правильная — энтеробактерии, псевдомонады; • неправильная — коринебактерии; • размеру. • мелкие - бруцеллы, бордетеллы; . средние - бактероиды, кишечная палочка; . крупные — бациллы, клостридии; • форме концов: • обрубленные — бациллы; • закругленные — сальмонеллы, псевдомонады; • заостренные — фузобактерии; утолщенные — коринебактерии; расположенные поодиночке; диплобактерии и диплобациллы — сцепленные попарно; • стрептобактерии и стрептобациллы — сцепленные в цепочку; • извитые формы. Извитые формы — по характеру и количеству завитков: • вибрионы — слегка изогнутые палочки или неполные завитки; • спириллы — один или несколько завитков; • спирохеты, которые, в свою очередь, делятся: • на лептоспиры (завитки с загнутыми крючкообразными концами — S-образная форма); • боррелии (4—12 неправильных завитков); • трепонемы (14—17 равномерных мелких завитков). 2. Структуру бактерий изучают в основном с помощью следующих методов: • электронная микроскопия (техника ультратонких срезов); • дифференциальное ультрацентрифугирование; • цитохимия. Структурные компоненты бактериальной клетки делятся на обязательные и необязательные. Обязательные структурные компоненты: • клеточная стенка; • цитоплазматическая мембрана; • цитоплазма с локализованными в ней рибосомами и ядерным аппаратом. Необязательные структурные компоненты: • капсула; • микрокапсула; • внеклеточная слизь; • включения; • жгутики; • пили; • споры. 3. Основу клеточной стенки у бактерий составляет пептидогликан муреин. Функции клеточной стенки состоят в том, что она: • является осмотическим барьером; • определяет форму бактериальной клетки; • защищает клетку от воздействий окружающей среды; • несет разнообразные рецепторы, способствующие прикреплению фагов, колицинов, а также различных химических соединений, • через клеточную стенку в клетку поступают питательные вещества и выделяются продукты обмена, • в клеточной стенке локализован О-антиген и с ней связан эндотоксин (липид А) бактерий. Существуют 2 типа строения клеточной стенки: %/ у бактерий первого типа пептидогликан муреин составляет до 90% массы клеточной стенки и образует многослойный (до 10 слоев) каркас, при этом он ковалентно связан с тейхоевыми кислотами. Такие бактерии при окраске по методу Грама прочно удерживают комплекс генцианового фиолетового и йода; они окрашиваются в сине-фиолетовый цвет и называются грамположителъными: • у бактерий со вторым типом строения клеточной стенки поверх 2—3 слоев пептидогликана муреина располагается слой липополисахаридов. Эти бактерии при окраске по методу Грама неспособны прочно удерживать комплекс генцианового фиолетового и йода и соответственно обесцвечиваются спиртом, прокрашиваясь дополнительным красителем — фуксином — в розово-красный цвет. Они называются грамотрицательными. В связи с различиями в строении клеточной стенки все бактерии делятся на 4 отдела: • грациликуты — бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамот-рицательные, к ним относятся различные извитые, палочковидные, кокковые формы бактерий, а также риккетсии и хла-мидии; • фирмикуты — бактерии с толстой клеточной стенкой, грампо-ложительные, к ним относятся палочковидные, кокковые формы бактерий, а также актиномицеты, коринебактерии и микобактерии; • тенерикуты — бактерии без ригидной клеточной стенки (микоплазмы); • мендозикуты — архебактерии, отличающиеся дефектной клеточной стенкой, особенностями строения рибосом, мембран и рибосомальных РНК. Эта группа бактерий медицинского значения не имеет. Из любой бактериальной клетки можно получить формы, полностью или частично лишенные клеточной стенки. Они называются соответственно протопластами и сферопластами и независимо от исходного морфологического типа бактерии из-за отсутствия клеточной стенки принимают шарообразную или грушевидную форму. Кроме того, существуют L-формы бактерий, которые, в отличие от протопластов и сферопластов, способны к размножению, являясь вполне полноценными микробными клетками данного вида бактерий. L-формы разных видов бактерий морфологически неразличимы. Независимо от формы исходной клетки (кокки, палочки, вибрионы) они представляют собой сферические образования разных размеров. Имеются L-формы: • стабильные — не реверсирующие в исходный морфотип; • нестабильные — реверсирующие в исходный при устранении причины, вызвавшей их образование. В процессе реверсии восстанавливается способность бактерий синтезировать пептидогликан муреин клеточной стенки. L-формы различных бактерий играют существенную роль в патогенезе многих хронических и рецидивирующих инфекционных заболеваний: бруцеллеза, туберкулеза, сифилиса, хронической гонореи и т. д. 4. К клеточной стенке бактерий примыкает цитоплазматическая мембрана, строение которой аналогично мембранам эукарио-тов — она состоит из двойного слоя липидов, главным образом фосфолипидов со встроенными поверхностными и интегральными белками). Цитоплазматическая мембрана обеспечивает: • селективную проницаемость и транспорт растворимых веществ в клетку; • транспорт электронов и окислительное фосфорилирование; • выделение гидролитических экзоферментов, биосинтез различных полимеров. Кроме того, она ограничивает цитоплазму бактерий, которая представляет собой гранулярную структуру. В цитоплазме локализованы рибосомы и бактериальный нуклеоид, в ней также могут находиться включения и плазмиды (вне-хромосомная ДНК). Необязательные структурные компоненты бактериальной клетки 1.Споры 2.Жгутики 3.Ворсинки 4.Капсула 1. Споры бактерий представляют собой бактериальные клетки в состоянии анабиозаи образуются при неблагоприятных условиях внешней среды. Располагаются внутри клетки терминально, субтерминально или центрально. Спорообразуюише палочкиназываются бациллами. В проиессе спорообразованияклетка почти полностью теряет воду, сморщивается, клеточная стенка уплотняется. Появляется новое вещество — дипиколинат кальция, которое образует комплексы с биополимерами клетки, устойчивые к действию температуры и ультрафиолетовых лучей. В окружающей среде споры бактерий могут сохраняться годами, но при попадании в благоприятные условия спора впитывает влагу, комплексы распадаются, дипиколинат разрушается, и спора превращается в вегетативную клетку. Таким образом, спору следует рассматривать не как способ размножения, а только как форму существования бактериальной клетки в неблагоприятных условиях. Преобразования идут по следующей схеме: 1 клетка — 1 спора — 1 клетка, т. е. увеличения количества бактериальных клеток не происходит. Спорообразование характерно в основном для грамположитель-ных бактерий. У грамотрицателъных бактерий эквивалентом спорообразования является переход в так называемое некультивируемое состояние. В такой форме они также длительно сохраняются в окружающей среде. При использовании окраски по Грамуспоры не воспринимают красителей, поэтому на окрашенном фоне они бесцветны. Окрашиваются споры с помощью специальных методов окраски, например по Ожешко или Клейну. 2. Многие бактерии имеют жгутики, количество и расппппжение которых у разных родов неодинаково: • монотрихии имеют только один жгутик (род Vibrio); • лофотрихии — пучок жгутиков на одном полюсе клетки (род Pseudomonas); • у амфитрихов жгутики (один или пучок) расположены на обоих полюсах клетки (род Spirillum); • у перитрихов — по всей поверхности (род Escherichia, Salmonella). По своему строениюжгутики представляют собой спирально закрученные нити, состоящие из специфического белка флагелли-на, который по своей структуре относится к сократительным белкам типа миозина. При окраске по Грамужгутики не видны. Изучать подвижность бактерии можно как с помощью микроскопических методов (фазово-контрастная микроскопия препаратов "висячая" или "раздавленная" капля), так и посевом — уколом в полужидкий агар или специальную среду (среду Пешкова). 3. На поверхности ряда бактерий обнаружены белковые образования — ворсинки (фимбрии, пили). Фимбрииотходят от поверхности клетки и состоят из белка, называемого пилином. Различают более 60 видов ворсинок, из которых наиболее изучены следующие: • F-pili — половые пили; • common pili — пили, ответственные за адгезию. 4. Капсула бактерий — это утолщенный наружный слой клеточной стенки. Капсулы могут быть построены из полисахаридов (пневмококк) или белков (возбудитель сибирской язвы). Большинство бактерий, особенно патогенных, образует капсулу только в организме человека или животных. Однако существует род истинно капсулъных бактерий (Klebsiella), представители которого образуют капсулу и при культивировании на искусственных питательных средах. Некоторые бактерии могут иметь микрокапсулу, выявляемую только при электронной микроскопии (эшерихии), или неявно выраженную способность к капсулообразованию — так называемую "нежную" капсулу (золотистые стафилококки, менингококки). Основное предназначение капсул — зашита бактерий от фагоцитоза. При окраске мазков по Граму истинно капсульные бактерии имеют характерное взаиморасположение (на расстоянии друг от друга). При световой микроскопии капсулы четко не видны, в связи с чем наличие капсул у бактерий выявляется с помощью специальных методов окраски, например по методу Гимзе. Для выявления капсул и бактерий, образующих их в организме, используют микроскопию мазков, приготовленных из патологического материала, или мазков-отпечатков из органов погибших животных. Временные структурные элементы бактериальной клетки (спора, капсула), их функциональное значение и обнаружение. Споры (эндоспоры) бактерий — особый тип покоящихся репродуктивных клеток, характеризующихся резко сниженным уровнем метаболизма и высокой резистентностью. Бактериальная спора формируется внутри материнской клетки и называется эндоспорой. Способностью к образованию спор обладают преимущественно палочковидные грамположительные бактерии родов Bacillus и Clostridium, из шаровидных бактерий — лишь единичные виды, например, Sporosarcina ureae. Как правило, внутри бактериальной клетки образуется только одна спора. Основная функция спор—сохранение бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды. Переход бактерий к спорообразованию наблюдается при истощении питательного субстрата, недостатке углерода, азота, фосфора, накоплении в среде катионов калия и марганца, изменении рН, повышении содержания кислорода и т. д. Процесс образования спор проходит ряд последовательных стадий: подготовительная. Изменяется метаболизм, завершаетется репликация ДНК и происходит ее конденсация. Клетка содержит два или более нуклеоида, один из них локализуется в спорогенной зоне, остальные — в цитоплазме спорангия. Одновременно синтезируется дипиколиновая кислота; стадия предспоры. Со стороны цитоплазматической мембраны вегетативной клетки происходит врастание двойной мембраны, или септы, отделяющей нуклеоид с участком уплотненной цитоплазмы (спорогенная зона). В результате чего образуется проспора, окруженная двумя мембранами; образование оболочек. Вначале между мембранами про-споры образуется зачаточный пептидогликановый слой, затем над ним откладывается толстый пептидогликановый слой кортекса и вокруг его наружной мембраны формируется споровая оболочка; созревание споры. Заканчивается образование всех структур споры, она становится термоустойчивой, приобретает ха¬рактерную форму и занимает определенное положение в клетке. Споры кислотоуст. и окраш. по методу Ауески или по мет. Циля-Нильсена в красн., а вегетативная кл.-в синий цв. Методом Ожешко (клетка голубая, спора-красная). Располож. спор в кл. может быть терминальным (на конце палочки), субтермин. (ближе к концу)и центральным. Капсула — слизистый слой, расположенный над клеточной стенкой бактерии. Вещество капсулы четко отграничено от окружающей среды. В зависимости от толщины слоя и прочности соединения с бактериальной клеткой различают макрокапсулу, толщиной более 0,2 мкм, хорошо различимую в световом микроскопе, и микрокапсулу, толщиной менее 0,2 мкм, обнаруживамую лишь при помощи электронного ми-кроскопа или выявляемую химическими и иммунологическими методами. Капсула — полифункциональный органоид, выполняющий важную биологическую роль. Она является местом локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенностъ бактерий. Утрата капсулы у патогенных бактерий резко снижает их вирулентность, например, у бескапсульных штаммов бациллы антракса. Капсулы обеспечивают выживание бактерий, защищая их от механических повреждений, высыхания, заражения фагами, токсических веществ, а у патогенных форм — от действия защитных сия макроорганизма: инкапсулированные клетки плохо фагоцитируются. .У некоторых видов бактерий, в том числе и патогенных, капсула способствует прикреплению клеток к субстрату. Она выявл. при спец. методах окраски мазка по Бурри-Гинсу (бакт. окраш. в красный цвет, а неокраш.капсулы контастно выдел. на черно-розовом фоне). Подвижность микроорганизмов, органеллы движения и методы определения (прямые, косвенные). Жгутики — органоиды движения бактерий, представленные тонкими, длинными, нитевидными структурами белковой природы. Их длина превышает бактериальную клетку в несколько раз и составляет 10—20 мкм, а у некоторых спирилл достигает 80—90 мкм. Нить жгутика (фибрилла)—полный спиральный цилиндр диаметром 12—20 нм. У вибрионов и протея нить окружена футляром толщиной 35 нм. В зависимости от места их расположение на клетке, бактерии разделяют на монотрихи (с одним жгутиком на конце), лофотрихи (с пучком жгутиков на конце), амфитрихи (по одному жгутику с каждого конца) и перитрихи (с многими жгутиками по всей поверхности). Много бактерий (например E.coli) имеют два разных режима работы жгутиков: движение вперед и «танец» (tumbling). «Танец» позволяет им внести в свое движение необходимую «случайность». Жгутик состоит из трех частей: спиральной нити, крюка и базального тельца. Крюк — изогнутый белковый цилиндр, выполняющий функцию гибкого связывающего звена между базальным тельцем и жесткой нитью жгутика. Базальног тельце — сложная структура, состоящая из центрального стержня (оси) и колец. Жгутики вяыявл. с помощью электр. микроскопии или в световом микроск. после обработки спец. методами, привоящими к увеличению толщ. жгут.(серебрение по Морозову). Пили (фимбрии, ворсинки) — прямые, тонкие, полые белковые цилиндры толщиной 3—25 нм и длиной-до 12 мкм, отходящие от поверхности бактериальной клетки. Образованы специфическим белком — пилином, берут начало от цитоплазматической мембраны, встречаются у подвижных и неподвижных форм бактерий и видимы только в электронном микроскопе. На поверхности клетки может быть от I—2, 50—400 пилей до нескольких тысяч. Существует два класса пилей: половые (секс-пили) и пили общего типа, которые чаще называют фвмбриями. У одной и той же бактерии могут быть пили разной природы. Половые лили возникают на поверхности бактерий в процессе конъюга¬ции и выполняют функцию оргаяелл, через которые дит передача генетического материала (ДНК) от донора к реципиенту. Пили общего типа располагаются лереитрихиально (кишечная палочка) или на полюсах (псевдомонады); одна бактерия их может содержать сотни. Они принимают участие в слипании бактерий в агломераты, прикреплении микробов к различным субстрата:м, в гам числе к клеткам (адгезивная функция), в транспорте метаболитов, а также способствуют образованию пленок на поверхности жидких сред; вызывают агглютинацию эритроцитов. Методы определения подвижности: 1) Функциональная оценка подвижности бакт.: а) метод раздавленной капли (на пердм. стекло – каплю культуры в МПБ, накрывают покровным стеклом, прижимая его к предметному, капля раздавливается. Наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют). б)Метод висячей капли (на покровное стекло наносят каплю культуры в МПБ, накрывают перевернутым предметным стеклом с луночкой так, чтобы капля оказалась в центре луночки. Края лунки смазывают вазелином для сцепления). 2)Определение подвижности методом посева: а) Метод Шукевича (рост по косячку вверх) б)Метод посева в столбик полужидкой среды по Пешкову (неподвижные бактерии растут точно по уколу, а подвижные как елочка). Размеры микробной клетки, их особенности у разных таксономических групп. Способы определения. Морфология микроорганизмов. У всех микробов (бактерии, грибы. простейшие, вирусы) размеры клеток варьируют. Различаю несколько основных форм бактерий: кокковидные, палочковидные, ветвящиеся и нитевидные. Их размеры колеблются от 0,1 до 10 мкм. Размеры простейших колеблются от 2 до 100 мкм. Размеры вирусов колеблются от 18 до 350 нм (1 мкм=1000нм), т.е. это мельчайшие микробы. Грибы: мицелий варьирует 2-9 мкм., имеются макро-, микроконнидии различной длины, различная толщина гифов. Для измерения микробных клеток применяют окуляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр служит для для непосредственного измерения объекта и предст. собой стеклянную пластинку в окуляре, в центральной части которой нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр предст. собой стекло, в середине кот. имеется эталонная шкала, разделенная на 100 частей (обычно каждое деление шкалы равно 10 мкм). Величину МКО измеряют окуляр-микрометром, предварительно определив цену его делений с помощью объект-микрометра. Для этого объект-микрометр устанавливают на предм. столик микроскопа и добиваются, чтоб одно из его делений совпадало с каким-либо делением окуляр-микрометра. Затем отмечают число делений объект-микрометра, в которые полностью укладывается число окуляр-микрометра. Зная величину деления объект-микрометра (10 мкм), устанавливают цену деления окуляр-микрометра. После этого объект-микрометр заменяют исследуемым препаратом и определяют размеры бакт. кл-ки линейкой окуляр-микрометра при той же степени увеличения, при которой была измерена величина его делений. Тинкториальные свойства микроорганизмов, их сущность, дифференциально-диагностическое значение, определение методами Грама и Циль-Нильсена. Тинкториальные св-ва - св-ва бактерий, грибов и простейших, характеризующие их способность вступать в реакцию с красителями и окрашиваться определенным образом. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем (Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.). При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков (серебрение по Морозову), клеточной стенки (по Грамму), нуклеоида(по Фельгену, Романовскому-Гимзе), капсулы (по мет. Бурри-Гинса), споры (По Ожешко, по Шефферу) и разных цитоплазматических включений, например, зерна волютина (по Нейссеру). Окраска по методу Грамма. На фиксированный мазок нанести карбол.-спиртовой р-р генцианового фиолетового через фильтрационную бумагу. Через 1-2 мин.ее снять, краситель слить. Нанести р-р люголя на 1-2 мин. Обесцветить этиловым спиртом в теч. 30-60с. до прекращения отхожд. фиолетовых струек красителя. Промыть водой. Докрасить водным раствором фуксина в теч. 1-2 мин., промыть водой, высушить. Грам+ в темно-фиолет., Грам- в красный. Окраска по Грамму имеет важное диагностич. значение. К Грам+ бакт. относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза. К Грам- гонококки, менингококки, кишечная палочка. Некоторые виды бакт. могут окраш. по Граму вариабельно в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов. Основная ошибка состоит в переобесцыечивании мазка этиловым спиртом, Грам+ при этом утрачивают первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретают красный цвет в рез. последующей окраске фуксином. А Грам- могут сохранять сине-фиолетовый цвет. Окраска на кислотоустойчивость по Циллю-Нильсену. На фиксир. мазок нанести карболовый р-р фуксина через фильтрационную бумагу и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин. Снять бумагу, промыть водой. Нанести 5% р-р серной к-ты или 3% р-р смеси спирта с хлороводородной к-той на 1-2 мин. для обесцвечивания. Промыть водой. Докрасить мазок водным р-ром метиленового синего в теч. 3-5 мин. Промыть водой, высушить. Кислотоустойчивость обусловлена наличием в клет. стенке и цитоплазме бакт. повышенного кол-ва липидов, воска и оксикислот. Р-р карболовой к-ты разрыхляет клет. стенку и повышает ее тинкториальные св-ва, а высокая концентрация красителя и нагревание в проц. окраски усиливают реакцию взаимод. красителя с бакт. кл-ми. При обработке препарата серной к-той некислотоустойчивые обесцвечиваются и окраш. метиленовым синим в голубой цв, а кислотоустойчивые остаются окашеными фуксином в красный цвет. Питание микробов, его виды, механизмы, пластический обмен. Различают несколько механизмов питания микробных клеток. Питательные вещества могут поступать из внешней среды в микробную клетку через клеточную стенку, капсулу, слизистые слои и цитоплазматическую мембрану. Проникновение питательных веществ в клетку может осуществляться с помощью диффузии и стереохимического специфического переноса питательных веществ. Особенности питания бактерий.: 1)поступление питат. веществ происходит через всю поверхность, 2)высокая скорость метаболич. реакций, 3)МКО быстро адаптируются к изменяющимся условиям окр. среды. Основной целью метаболизма бакт. явл-ся рост. Т.к. основными компонентами бакт. кл-ки явл-ся органич. соединения, белки, углеводы, нуклеин.к-ты и липиды, остов которых построен из атомов углерода, то для роста бакт. требуется постоянный их приток. Типы питания микробов. Различают углеродное и азотное питание микроорганизмов. По типу углеродного питания микробы принято делить на аутотрофы и гетеротрофы. Аутотрофы, или прототрофы, (греч. autos — сам, tro-phe — пища) — микроорганизмы, способные воспринимать углерод из угольной кислоты (С02) воздуха. Гетеротрофы (heteros— другой) в противоположность аутотрофным микробам получают углерод главным образом из готовых органических соединений. Гетеротрофы — возбудители различного рода брожений, гнилостные микробы, а также все болезнетворные микроорганизмы: возбудители туберкулёза, бруцеллеза, листериоза, сальмонеллеза, гноеродные микроорганизмы—стафилококки, стрептококки, диплококки и ряд других патогенных для животного организма возбудителей. Транспорт питательных в-в осуществляется: пассивной диффузией (по градиенту конц), облегченной диф. (с помощью перилаз без затрат энергии), акт. транспорт (с участием перилаз с затратой энергии), транслокация хим. градиентов (пернеос радикалов). Выход в-в из МКО осущ-ся пассивной и облегченной диффузией. Питательные среды, сущность их конструирования, виды, назначение, контроль. Питательные среды - среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Питат. среды бывают натуральные и синтетеич. (искусственные). Натуральные питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. Искусственные пит. среды должны отвечать следующим требованиям: 1) Должна содержать воду, т.к. все проц. жизнедеят. бакт. протекают в воде. 2)Для культивирования гетероорганотрофов в среде должен содержаться органический источник углерода и энергии. 3) Должна быть оптимальная рН среды. 4) Изотоничность 5) Стерильность 6) Определенная влажность. 7)Обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом. В зависимости от консистенции пит. среды могут быть жидкими(бульон), полужидкими (добавление агара), плотными (на агар-агаре) Агар – полисахарид, получаемый из водорослей, он добавляется в концентрации 0,5% для полужидк. и 1,5-2% для плотных. По составу пит. среды бывают простые и сложные. К простым относятся пептонная вода, питательный бульон, мясопептонный агар. На основе этих простых пит. сред готовят сложные (сахарный и сыворточный бульон, кровяной агар). В зависимости от назначения среды делят на элективные, обогащенные, дифференциально-диагностические. Элективные среды – на которых лучше растет какой-то определенный МКО (щелочной агар для холерного вибриона). Обогащенные среды – стимулируют рост какого-то определенного МКО, ингибирую рост других (среда, содержащая селенит натрия, стимул. рост сальмонелл, ингибируя рост киш. палочки). Дифференциально-диагностические среды– для изучения ферментативной акт. бакт. Они состоят из простой пит. среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цв. в результате ферментного превращения субстрата (среда Гисса, используемая для изуч. способности бакт. фермент. сахар). Комбинированные пит. среды – сочетают в себе элективную среду, подавляющую рост сопутствующей микрофлоры, и дифференциальную среду, диагностирующую фермент. акт. выделяемого микроба (среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар при выделении патогенной киш. бактерии). Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава. Стерилизация – обеззараживание, обеспложивание (уничтожение вегетат. и споровых форм) МКО в объектах внешней среды. Дыхание микробов, его варианты, сущность, механизмы аэробного и анаэробного дыхания, определение типа. Дыхание (или биологическое окисление) - это сложный процесс, который сопровождается выделением энергии, необходимой микроорганизмам для синтеза различных органических соединений. Бактерии для дыхания используют кислород. Однако Л. Пастером было доказано существование таких бактерий, для которых наличие свободного кислорода является губительным, энергия, необходимая для жизнедеятельности, получается ими в процессе брожения. Все бактерии по типу дыхания подразделяются на облигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы. Облигатные аэробы развиваются при наличии в атмосфере 20% кислорода (микобактерии туберкулеза), содержат ферменты, с помощью которых осуществляется перенос водорода от окисляемого субстрата к кислороду воздуха. Микроаэрофилы нуждаются в значительно меньшем количестве кислорода, и его высокая концентрация хотя и не убивает бактерии, но задерживает их рост (актиномицеты, бруцеллы, лептоспиры). Факультативные анаэробы могут размножаться как в присутствии, так и в отсутствие кислорода (возбудители брюшного тифа, паратифов, кишечная палочка). Облигатные анаэробы -бактерии, для которых наличие молекулярного кислорода является губительным (клостридии столбняка, ботулизма). Аэробные бактерии в процессе дыхания окисляют различные органические вещества. Дыхание у анаэробов происходит путем ферментации субстрата с образованием небольшого количества энергии. Процессы разложения органических веществ в безкислородных условиях, сопровождающиеся выделением энергии, называют брожением. В зависимости от участия определенных механизмов различают следующие виды брожения: спиртовое, осуществляемое дрожжами, молочно-кислое, вызываемое мол очно-кислыми бактериями, масляно-кислое и пр. Для выращивания анаэробов в бактериологических лабораториях применяют анаэростаты – специальные емкости, в которых воздух заменяется смесью газов, не содержащих кислорода. Воздух можно удалять из питательных сред путем кипячения, с помощью химических адсорбентов кислорода, помещаемых в анаэростаты или другие емкости с посевами. Методы культивирования анаэробов в лабораторных условиях. Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и биологических методов. Физические методы основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается: 1) посевом в среды, содержащие редуцирующие (кусочки животных или растительных тканей) и легко окисляемые вещества (глюкоза, лактоза); 2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред (Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов.); 3) Механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы (Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов — анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов.); 4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом). Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта — Тароцци, которая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов. Химические методы основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия. Биологические методы основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). Культуральные свойства микроорганизмов, их своеобразие у различных видов и обеспечение в лабораторных условиях. К культуральным или макроморфологическим свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред в зависимости от посева микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона. 1) Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием, они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры. При описании колоний учитывают следующие признаки: форма, поверхность (гладкая, шероховатая), профиль (плоский, выпуклый, конусовидный), прозрачность, цвет, край колоний (ровный, волнистый, зубчатый), структура (однородная, мелко или крупнозернистая, струйчатая), консистенция (плотная, мягкая). Глубинные колонии чаще всего похожи на сплющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами). Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ. Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну. 2) Описание роста микроорганизмов при посеве штрихом включает его особенности: скудный, умеренный, обильный; сплошной с ровным или волнистым краем; диффузный; перистый; ризоидный; древовидный. Характеризуют цвет, поверхность, консистенцию. Особенности колонии могут изменяться с возрастом, они зависят от состава среды, температуры культивирования. Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают, используя 4-7 суточные культуры, выращенные в стационарных условиях. В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка. Рост бактерий с равномерным помутнением среды, что характерно для факультативных анаэробов. Степень помутнения может быть слабая, умеренная, сильная. Придонный рост бактерий характеризуется образованием осадка: скудного, обильного, рыхлого, слизистого, хлопьевидного, зернистого. Питательная среда может быть прозрачной или мутной. Пристеночный рост - образование зерен, рыхлых хлопьев на внутренней поверхности стенок сосуда. Питательная среда при этом остается прозрачной. Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности среды пленки: тонкой, плотной, рыхлой, гладкой, складчатой, влажной, сухой, кольцеобразной, сплошной. Такой рост наблюдается при культивировании аэробных бактерий. При росте на полужидких (0,5-0,7% агара ) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду. Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров (уксусноэтилового , уксусноамилового и др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты. Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды , антоцианы, меланины. Если пигмент не растворим в воде, окрашивается только культуральный налет, если же он растворим, окрашивается и питательная среда. Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов. В природе существуют, так называемые, фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются, главным образом, в речной или морской воде. К светящимся бактериям - фотобактериям - относятся аэробные бактерии (вибрионы, кокки, палочки). Биохимическая активность микроорганизмов, ее определение и дифференциально-диагностическое значение. Для определения способности МКО ферментировать углеводы (сахаролитические свойства) используют короткий и длинный «пестрый» ряд. К первому относятся жидкие питательные среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом - маннитом. В длинный пестрый ряд наряду с этими углеводами вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиноза, ксилоза), полисах. (инулин, крахмал) и спиртами (глицерин, инозит). В качестве индикатора ко всем средам добавляют индикатор – реактив Андреде или ВР. Чистую культуру засевают петлей в среды «пестрого» ряда. Инкубируют при темп. 37 град. в течении 18-24 ч. Если бактерии ферментируют углеводы до образования кислых прод., наблюдается изменение цвета среды; при разложении до кислоты и газа помимо изменения цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используются среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика. Т.к бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав среды Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, отсюда и название. Для определения протеолитических ферментов производят посев культуры бактерий уколом в столбик 10-20% желатина, пептонную воду. Посевы в желатине инкубируют при температуре 20-22 град. в теч. нескольких дней. При наличии протеолитич. ферментов бактерии разжижают желатин, образую фигуру, напоминающую воронку или елочку. Реакция на аммиак. Узкую полоску лакмусовой бумаги укрепляют под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питат. средой. Посинение бумаги свидет. об образовании аммиака. Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий прибавляют 2-3 мл эфира, содержимое перемешивают и добаляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальегида с хлороводородной кислотой). В присутствии индола наблюдается розовое окрашивание, при осторожном наслаивании образуетсяся розовое кольцо. Реакция на сероводород. Делают посев культуры бакт. уколом в столбик с питательной средой, содержащей реактивы для выявления сероводорода (смесь солей: сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфат натрия). При наличии сероводорода происходи почернение агара. Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят каплю 1-2% р-ра пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактеиальной культурой. Каталаза разлагает перекись на кислород и воду. Выделение пузырьков кислорода свидететельствует о наличии каталазы. Патогенность и вирулентность бактерий. Факторы патогенности микробов, их выявление. Среди бактерий по способности вызывать заболевания выделяют: 1)патогенные; 2) условно-патогенные; 3) сапрофитные. Патогенные видыпотенциально способны вызывать инфекционное заболевание. Патогенность – это способность микроорганизмов, попадая в организм, вызывать в его тканях и органах патологические изменения. Это качественный видовой признак, детерминированный генами патогенности – вирулонами. Они могут локализоваться в хромосомах, плазмидах, транспозонах. Условно-патогенныебактерии могут вызывать инфекционное заболевание при снижении защитных сил организма. Сапрофитные бактерииникогда не вызывают заболевния, так как они не способны размножаться в тканях макроорганизма. Реализация патогенности идет через вирулентность– это способность микроорганизма проникать в макроорганизм, размножаться в нем и подавлять его защитные свойства. Вирулентность – это степень патогенности, поддается количественной характеристике. Количественными характеристиками вирулентности являются: DLM(минимальная летальная доза) – это количество бактерий, при введении которых соответствующим путем в организм лабораторных животных получают 95%-98% случаев гибели животных в эксперименте; LD 50– это количество бактерий, вызывающее гибель 50% животных в эксперименте; DCL (смертельная доза) – вызывает 100% гибель животных в эксперименте. |