1.4 Кодирование по МКБ 10
C91.4 - Острый промиелоцитарный лейкоз
2. Диагностика
2.1 Жалобы и анамнез
Манифестация клинических проявлений ОПЛ сопровождается жалобами анемического характера, развитием геморрагического синдрома различной интенсивности и инфекционных осложнений на фоне нейтропении. Данные проявления могут развиться остро или постепенно нарастать.
Рекомендуется из анамнестических данных выявлять связь с возможными токсическими, лекарственными агентами. Необходим тщательный сбор семейного анамнеза, для исключения врожденных аномалий, а также – на наличие сиблингов (родных братьев и/или сестер). В анамнезе заболевания должны быть описаны все эпизоды инфекционных осложнений, проведенная антибиотическая терапия, данные бактериологических посевов. Необходимо полное описание частоты и потребности в проводимой трансфузионной терапии, осложнения на ее фоне.[1-16].
Уровень убедительности рекомендации Уровень достоверности
доказательств 2+
2.2 Физикальное обследование
При ОПЛ осмотр включает измерение роста и массы тела, температуры тела; оценку состояния костно-суставной системы; выявление признаков геморрагического синдрома; наличие гепатоспленомегалии, лимфоаденопатии; наличие признаков дисфункции сердца, легких, печени, органов эндокринной системы. В случае появления папулезных высыпаний на коже рассматривается вопрос о биопсии кожи.
11
2.3 Лабораторная диагностика. Как уже отмечалось, клиническая картина ОПЛ имеет достаточно яркие характеристики, и диагноз этого варианта ОМЛ может быть заподозрен даже до выполнения необходимых лабораторных тестов. При этом в клинической практике можно столкнуться и со случаями ОПЛ, которые протекают не столь драматично, –
отсутствуют проявления геморрагического синдрома, больные в течение нескольких недель могут наблюдаться по поводу лейкопении, умеренной тромбоцитопении.
У 80 % больных манифестация заболевания характеризуется лейкопенией (медиана числа лейкоцитов составляет 1,8*109/л). Хотелось бы отметить, что если у больного в момент диагностики острого лейкоза определяется лейкопения менее 1*10 9
/л, особенно в сочетании с гипофибриногенемией, то с большой долей вероятности можно предполагать промиелоцитарный вариант ОМЛ. У 15-20% пациентов в дебюте болезни определяется выявляется лейкоцитоз (медиана 83*109/л) с увеличением числа лейкоцитов до 150 и более тысяч. У подавляющего числа больных (80-90%) определяется анемия, причем, у половины из них концентрация гемоглобина составляет менее 100 г/л. У 75% больных содержание тромбоцитов снижается до
50*10 9
/л и ниже. Лабораторные признаки диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови и истощенного фибринолиза определяются у 80-90% пациентов.
Проявления геморрагического синдрома (гематомы, кровоточивость десен, повышенная травмируемость кожных покровов, распространенные петехиальные высыпания, нередко кровотечения из носа, желудочно-кишечного тракта) имеются у
90% пациентов на момент диагностики. Гепатоспленомегалия или лимфоаденопатия определяются менее чем, у 20 % пациентов.
При обнаружении клинических симптомов, подозрительных на ОПЛ, необходимо выполнить определенный спектр исследований
2.3.1. Морфологическая оценка бластных клеток В большинстве случаев диагноз может быть заподозрен при морфологической оценке лейкемических клеток. Для этого необходимо выполнить пункцию костного мозга.
Бластные клетки при ОПЛ у большинства больных прежде всего характеризуются значительным ядерным полиморфизмом и наличием крупной фиолетово-бурой зернистости, густо заполняющей цитоплазму, большим количеством палочек Ауэра
(классический гипергранулярный вариант ОПЛ). У 15-20% больных в цитоплазме опухолевых клеток обнаруживается лишь несколько мелких гранул или они не выявляются вовсе, при этом все остальные признаки (клинические, цитохимические, цитогенетические) ОПЛ присутствуют.
Классическим признаком опухолевых клеток ОПЛ является очень выраженная цитохимическая реакция на миелопероксидазу (MPO), липиды, которая выявляется с помощью суданового черного (SBB), и на хлорацетатэстеразу.
Рекомендуется проведение следующих исследований до начала лечения ОПЛ и во время лечения ОПЛ в ходе индукционной терапии:[1-16].
1. Общий клинический анализ крови с подсчетом ретикулоцитов и тромбоцитов
12 2. Миелограмма
3. Цитохимическое исследование бластных клеток
4. Иммунофентипирование (оптимально)
5. Цитогенетические исследования
6. Молекулярное исследование
7. Коагулограмма
8. Биохимический анализ крови
9. Тромбоэластограмма (оптимально)
Коммертарии: Гемограмма (особенно число лейкоцитов и тромбоцитов)
выполняется ежедневно в первые дни терапии ATRA для оценки риска возникновения
ДС (при быстром увеличении числа лейкоцитов целесообразно начать профилактику
ДС, даже если не было исходного лейкоцитоза; уровень тромбоцитов не должен
быть ниже 30*10
9
/л, целевой уровень - 50*10
9
/л и более), затем - через день-два до
констатации ремиссии. Развернутая формула - два раза в неделю.
У больных ОПЛ после курса химиотерапии наблюдается две волны «выхода» из
агранулоцитоза. Первую контрольную пункцию костного мозга следует выполнять
не ранее завершения второй «волны» выхода в среднем на 30 день после завершения
курса химиотерапии. Более ранний анализ пунктата костного мозга может
привести к ложному подсчету процента бластных клеток – продолжающих
дифференцироваться опухолевых клеток, которые через 7-10 дней полностью
исчезнут из костного мозга. Таким образом, первая контрольная пункция костного
мозга осуществляется на в среднем 30 день после последнего введения идарубицина**
(то есть, на 36-40 день от начала курса), или при окончательном восстановлении
показателей периферической крови.
У больных, индукционное лечение которым выполняют триоксидом мышьяка в
сочетаниис ATRA, описанная выше закономерность отсутствует. При применении
АТО у большого числа больных в течение первых двух недель терапии отмечается
постепенное увеличение числа лейкоцитов в периферической крови (лейкоцитоз
может достигать 150-180 тыс), что при отсутствии клинических признаков
дистресс-синдрома терапии не требует.
2.3.2. Иммунофенотипирование бластных клеток
Иммунофенотипирование с использованием многоцветной проточной цитометрии может повысить точность морфологических исследований ОПЛ, но не является ключевым методом диагностики. Как правило, PML / RARA-положительные бластные клетки имеют иммунофенотип, аналогичный нормальным промиелоцитам
(CD34-/+ гетерогенный, CD117-/+ dim, HLADR-/+ dim, CD13+/++, CD11b-). Тем не менее, в отличие от нормальных промиелоцитов PML/RAR-положительные промиелоциты имеют крайне низкий уровень CD15 (CD15-/+ dim , вместо CD15+++).
Бластные клетки при гипогранулярной (вариантной) форме ОПЛ (M3V) часто коэкспрессируют Т-линейные маркеры, такие как CD2, совместно с миелоидными маркерами такими как CD13 и CD33.
В литературе описаны случаи острых миелоидных лейкозов с морфологическими и/или иммунофенотипическими характеристиками ОПЛ, однако без PML/RARA, и наоборот.
2.3.3. Цитогенетическое исследование
13
Для диагностики ОПЛ крайне необходимым является быстрое цитогенетическое подтверждение диагноза. Поскольку эффективность таргетного лечения на основе ретиноидов и/или производных мышьяка строго зависит от наличия химерного гена
PML/RARA, генетические подтверждение диагноза является обязательным во всех случаях. В 1977 году J.D.Rowley и соавт. было доказано, что практически во всех случаях промиелоцитарного лейкоза обнаруживается транслокация (15;17)(q22;q12-
21). В результате этой транслокации ген промиелоцитарного лейкоза (
PML-ген), расположенный на 15 хромосоме, переносится на длинное плечо 17
хромосомы в область, где находится ген альфа-рецептора ретиноевой кислоты (
Эту транслокацию относят к группе реципрокных, сбалансированных, что означает, что генетический материал не утрачивается и передается с одной на другую хромосому. В результате t(15;17) появляется два сливных аномальных гена: PML/RARа на деривате (der) 15 хромосомы и RARа/PML на (der) 17 хромосомы. Генетическое подтверждение диагноза должно выполняться, если возможно, на бластных клетках, полученных из костного мозга (КМ). Идентификация ОПЛ- специфических генетических поломок в бластных клетках осуществляется на уровне анализа хромосом, ДНК, РНК и химерного белка с использованием стандартного кариотипирования, флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), или анти-PML моноклональных антител. Соответственно, каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки.
Кариотипирование на G-окрашенных метафазах, полученных из образцов костного мозга (КМ) выполняется обычными методами на прямой, 24-часовой и 48-часовой культуре. Несмотря на высокую специфичность, цитогенетический анализ дорог, отнимает много времени, нуждается в метафазах хорошего качества (потери до 20%), и по определению, не в состоянии обнаружить случаи, когда PML / RARA является результатом так называемой криптогенной перестройки (ложно отрицательный результат).
Этот метод позволяет обнаруживать дополнительные хромосомные перестройки, но они не имеют существенного прогностического значения при ОПЛ. Также, цитогенетический анализ может быть полезен в тех случаях ОПЛ, когда синтез химерного белка PML/RARA не осуществляется. Стандартная цитогенетика также может способствовать выявлению редких вариантов ОПЛ в том числе с t(11, 17) (q23; q21), t(11, 17) (q13; q21) и t(5, 17) (q35; q21), приводящих к синтезу химерных продуктов PLZF-RARA, NuMA RARA и NPM1-RARA соответственно, а также другим, описанным совсем недавно.
Рекомендуется до начала лечения проведение цитогенетического исследования бластных клеток костного мозга.[1-16].
Комментарии: В клиниках, где нет возможности выполнить цитогенетическое исследование, диагноз должен быть подтвержден в референс-лаборатории. Образцы костного мозга или периферической крови должны быть доставлены в лабораторию до начала терапии. 2.3.4. FISH (флюоресцентная in situ гибридизация). FISH анализ PML/RARa выполняется с использованием флуоресцентных зондов. Хотя в некоторых случаях образцы периферической крови (ПК) пригодны для
14 исследования (в частности, когда на момент установления диагноза имеется гиперлейкоцитоз), FISH анализ лучше выполнять на образцах КМ. Этот метод высоко специфичен, обладает достаточной чувствительностью, намного дешевле и менее трудоемок, чем кариотипирование. Однако FISH не дает никакой информации об изоформе химерного транскрипта PML/RARA, который необходим для осуществления молекулярного мониторинга минимальной остаточной болезни.
Тем не менее, FISH может быть полезен в диагностики предполагаемых случаев ОПЛ, при которых не выявляется химерный транскрипт PML-RARа. Так, FISH- исследование может выявить реаранжировку гена RARа, который может быть партнером другого – не PML- гена.
Рекомендуется до начала лечения проведение FISH-исследования образцов костного мозга со специфическими пробами для выявления перестройки генов
RARa и PML.[1-16].
Комментарии: В клиниках, где нет возможности выполнить FISH исследование,
диагноз должен быть подтвержден в референс-лаборатории. Образцы костного
мозга или периферической крови должны быть доставлены в лабораторию до начала
терапии.
2.3.5. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
ОТ-ПЦР анализ PML-RARа проводят на РНК, выделенной из клеток КМ, хотя химерный транскрипт, как правило, легко определяется и в ПК, даже в случаях с лейкопенией. ОТ-ПЦР анализ для выявления химерного продукта PML-RARA был созданы стандартизован в рамках международной кооперации (Biomed-1 Concerted
Action). ОТ-ПЦР является «золотым стандартом» для подтверждения диагноза ОПЛ.
Помимо своей высокой специфичности и чувствительности, важно, он определяет расположение очки разрыва PML, устанавливая тем самым маркер для следующего мониторинга МОБ. Однако, малое количество РНК (и как следствие – ложноотрицательный результат), контаминация/артефакты (ложноположительный результат), а также относительно длительный период пробоподготовки (около 2 дней) являются основными недостатками этого метода. Кроме того, очень желательно, чтобы детекцию химерных транскриптов и мониторинг образцов проводили в референс-лабораториях с хорошо обученным персоналом и большим опытом.
Рекомендуется до начала лечения проведение FISH-исследования образцов костного мозга со специфическими пробами для выявления перестройки генов
RARa и PML.[1-16].
Комментарии: В клиниках, где нет возможности выполнить молекулярное
исследование, диагноз должен быть подтвержден в референс-лаборатории. Образцы
костного мозга или периферической крови должны быть доставлены в лабораторию
до начала терапии.
2.3.6. Иммуноокрашивание с помощью анти-PML моноклональных антител
Иммуноокрашивание с помощью анти-PML моноклональных антител на сухих мазках
КМ или ПК (при условии наличия бластных клеток) позволяет очень быстро установить диагноз. Этот метод является весьма специфичным при наличии
15 химерного белка PML-RAR. Результат иммунофлуоресцентного анализа может быть получен в течение всего 2х часов. К сожалению, этот тест не применяется в РФ.
Все вышеупомянутые методы диагностики одинаково специфичны, но не одинаково надежны. В частности, кариотипирование (стандартная цитогенетика) гораздо менее эффективно, чем другие методы. Для быстроты диагностики оптимальным является использование метода FISH. Однако эти технологии не должны заменять ОТ-ПЦР, которая позволяет определять изоформы PML-RARA и мониторировать МОБ.
2.3.7. Исследования дополнительных молекулярных маркеров.
Мутации в гене, кодирующем FMS-подобную тирозинкиназу 3 (FLT3), при ОПЛ наблюдаются чаще, чем при других ОМЛ – у 30-40% больных. Однако, хотя FLT3- мутации ассоциированы с более высоким числом лейкоцитов в момент диагностики острого лейкоза, они не являются каким-либо прогностическим фактором и не оказывают влияние на выбор терапевтической тактики.
Не рекомендуется рутинное исследование мутаций FLT3 при ОПЛ.[1-16].
2.3.8. Подготовка образцов для молекулярно-генетических исследований и их
хранение
FISH
Для FISH-исследования необходимо от 3 до 4 мазков КМ и от 3 до 4 мазков ПК, полученных на момент установления диагноза. Образцы могут быть отправлены при комнатной температуре. Мазки, которые не используются немедленно, должны храниться на -20 0
C, покрытые алюминиевой бумагой.
ОТ-ПЦР.
Для выделения РНК и ОТ-ПЦР, требуется одна пробирка с КМ (2-3 мл) или одна пробирка с ПК (20-30 мл, поскольку часто при ОПЛ регистрируется глубокая лейкопения), содержащая либо цитрат натрия, либо этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). Образцы костного мозга или периферической крови должны быть обработаны в течение 24 часов. Выделенные мононуклеарные клетки в гуанидине изотиоцианате могут храниться на -20 0
C. Для всех исследований предпочтителен костный мозг.
Кариотипирование и FISH.
Для обычного кариотипирования и FISH исследования, КМ объемом (1-2 мл) должен быть помещен в пробирку с гепарином и отправлен при комнатной температуре.
Образцы, обработанные при поступлении в лабораторию в виде осажденных ядер, фиксированных с помощью метанола и уксусной кислоты (3:1), могут храниться при температуре -20 0
С.
Для подтверждения диагноза ОПЛ и мониторирования в дальнейшем:
Рекомендуется при возникновении подозрений на ОПЛ клиническую ситуацию и любые действия в отношении больного расценивать как неотложные, поскольку ключевым в лечении ОПЛ является немедленное
16 назначение специфической терапии полностью транс-ретиноевой кислотой.
[1-16].
Рекомендуется подтверждение диагноза ОПЛ молекулярно-генетическими методами (стандартная цитогенетика, FISH и РТ-ПЦР).
Самым быстрым методом, подтверждающим диагноз ОПЛ, является метод FISH.
[1-16]. Рекомендуется методом РТ-ПЦР определить вариант химерного транскрипта
PML-RARа (или другой более редкий вариант) для выполнения в дальнейшем мониторинга минимальной резидуальной болезни.[1-16].
2.3.9. Рекомендации по мониторингу МРБ Все случаи ОПЛ, установленного морфологическими и цитохимическими методами исследования, должны быть подтверждены методом полимеразной цепной реакции в момент установления диагноза, так как в 5-10% случаев при отсутствии классической транслокации (15;17) обнаруживается транскрипт PML-RARa.
Высокоэффективным методом диагностики и мониторинга минимальной остаточной болезни при ОПЛ является метод dual-FISH, чувствительность которого составляет
1:1000, однако отсутствие маркера при этом исследовании не означает отсутствие минимальной резидуальной болезни. Отсутствие МРБ всегда должно быть подтверждено методом ПЦР.
Определение молекулярного варианта ОПЛ (PML-RARa, PLZF-RARa, NuMА-RARa,
NPM-RARa и др.) может «подсказать», чувствительны ли опухолевые клетки к воздействию ATRA и мышьяка. Варианты ОПЛ с PLZF-RARa онкогеном плохо отвечают на терапию ретиноидами.
Варианты транскрипта PML/RARa (bcr1, bcr2, bcr3) и экспрессия транскрипта RARa-
PML служат маркерами для мониторинга минимальной остаточной болезни при ОПЛ с транслокацией (15;17), но не определяют прогноз заболевания.
Мониторинг минимальной остаточной болезни необходим для определения терапевтической тактики при ОПЛ с самых ранних этапов постремиссионной терапии.
Достигнутая молекулярная ремиссия (метод ПЦР для определения молекулярной ремиссии должен выявлять не менее одной опухолевой клетки на 10 тысяч нормальных, то есть его чувствительность составляет 10-4) является принципиальным моментом в лечении ОПЛ, поскольку отсутствие молекулярной ремиссии после выполнения интенсивной консолидации свидетельствует о неизбежном рецидиве и требует изменения терапевтической тактики.
Мониторинг минимальной остаточной болезни позволяет использовать более интенсивное лечение у больных, у которых риск развития рецидивов выше, в то время, как при меньшем риске больным может быть понижена интенсивность лечения, что позволит уменьшить как токсичность препаратов, так и вероятность возникновения вторичных опухолей
Больным, у которых после завершения интенсивной консолидации продолжает определяться химерный транскрипт (чувствительность метода 10-4), необходимо
17 продолжить интенсивную терапию с целью предупреждения развития рецидива
(использовать препараты мышьяка, предлагать больному трансплантацию аллогенных стволовых гемопоэтических клеток).
Больным, у которых выявлен возврат минимальной остаточной болезни
(молекулярный рецидив) необходимо продолжить и модифицировать терапию с целью предупреждения развития рецидива. В случае раннего, до года полной ремиссии, молекулярного рецидива следует модифицировать терапию (например, ввести в протокол цитарабин** - провести программу 7+3 с даунорубицином** в дозе
60 мг/м2 в сочетании с 30 дневным приемом ATRA, постараться получать молекулярный ответ и обязательно реализовать проект ТКМ). При позднем рецидиве
(от года до 2-х лет полной ремиссии) на фоне постоянной поддерживающей терапии следует также выполнить курс 7+3+ATRA (с идарубицином**) с дальнейшей постоянной поддерживающей терапией.
При очень позднем молекулярном рецидиве (после снятия с программной терапии) оптимальным является применение препаратов мышьяка, но вследствие его отсутствия в списке зарегистрированных в РФ препаратов, можно рекомендовать монотерапию ATRA с частым контролем МРБ
Оптимальной терапией при развитии любого варианта молекулярного рецидива является терапия триоксидом мышьяка в течение минимум 6 месяцев.
Молекулярный мониторинг особенно важен в первые 12 месяцев после завершения интенсивной консолидации. По нашим наблюдениям у подавляющего большинства больных молекулярная ремиссия достигается после трех курсов химиотерапии, а большая часть молекулярных и/или гематологических рецидивов наблюдается через
18-24 месяца после достижения первой ремиссии. У больных, которым индукция ремиссии осуществляется АТО в сочетании с ATRA, молекулярная ремиссия достигается в подавляющем большинстве случаев после 1-2 курсов.
Строгость в выполнении мониторинга в течение 12 месяцев после консолидации (18 месяцев лечения) определяется исходным числом лейкоцитов, то есть у больных с числом лейкоцитов в дебюте заболевания более 10*10 9
/л маркеры МРБ необходимо мониторировать значительно чаще - 1 раз в 2-3 месяца, поскольку вероятность рецидива у них более высокая. У больных, у которых маркер МРБ персистирует и после третьего курса консолидации, необходимо рассматривать возможность изменения терапевтической тактики (применение мышьяка, выполнение аллогенной и мониторинг следует осуществлять после каждого нового последующего метода воздействия.
ПЦР-анализ клеток костного мозга является более чувствительным, чем ПЦР-анализ клеток крови. В нашем исследовании, помимо указанной закономерности, было обращено внимание и на возможность несоответствия результатов ПЦР, проводимой на клетках пунктата костного мозга, взятых из подвздошной кости и грудины. Мы определяли транскрипт PML-RARa в клетках, полученных из подвздошной кости, в то время как в клетках пунктата грудины транскрипт не выявлялся.
Прежде чем принимать терапевтические решения, основанные на данных молекулярного мониторинга, необходимо повторно получить положительный результат ПЦР-анализа. Причем, чтобы уменьшить вероятность получения ошибочных результатов из-за методических погрешностей или путаницы образцов,
18 транскрипт PМL-RARa должен выявляться при анализе свежеполученных клеток костного мозга. Все лаборатории, которые проводят ПЦР-анализ, на основании результатов которого изменяется терапия, должны иметь очень жесткий внутренний контроль качества выполнения анализов и участвовать во внешнем контролировании.
По нашим наблюдениям, для исключения ошибок в диагнозе молекулярного рецидива следует выполнять одновременно dual-FISH -анализ. В случае, когда при однократном определении транскрипта PML-RARa методом ПЦР получают положительный результат и при dual-FISH-анализе, устанавливается молекулярный рецидив. Если отсутствует возможность выполнять dual-FISH анализ, то повторный ПЦР-анализ следует выполнять в более ранние сроки – через 14 дней после получения первых положительных результатов.
Мониторинг минимальной остаточной болезни следует проводить и у больных во второй морфологической ремиссии ОПЛ, особенно когда осуществляется подготовка к выполнению аутологичной трансплантации.
У больных, у которых в костном мозге и в концентрате заготовленных аутологичных стволовых клеток не обнаруживается PML-RARa транскрипт, прогноз в отношении безрецидивной выживаемости благоприятный.
У больных, у которых в костном мозге и в концентрате заготовленных аутологичных стволовых клеток обнаруживается PML-RARa транскрипт, прогноз безрецидивной выживаемости неблагоприятный.
У больных, у которых в костном мозге PML-RARa транскрипт не обнаруживается, а в концентрате заготовленных
аутологичных стволовых клеток он присутствует, или у которых в костном мозге PML-RARa транскрипт обнаруживается, а в концентрате заготовленных аутологичных стволовых клеток он отсутствует, прогноз по поводу безрецидивной выживаемости неопределенный. По нашим наблюдениям, при обнаружении транскрипта в концентрате заготовленных аутологичных стволовых клеток при отсутствии его в костном мозге перед аутологичной трансплантацией, у больного прогноз неблагоприятный.
Определение маркеров минимальной остаточной болезни после аутологичной или аллогенной ТКМ позволяет выбирать необходимую терапевтическую тактику.
Обнаружение транскрипта PML/RARa в течение 3 месяцев после ТКМ указывает на неизбежность рецидива и в указанной ситуации самым оптимальным препаратом является триоксид мышьяка
Скачать 0.84 Mb.