Учебное пособие, Царев. Практикум по дисциплине Основы микробиологии. Предназначено для бакалавров направления 18. 03. 02 Энерго и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии
 Скачать 2.32 Mb.
|
«phyton» — растение). Число органических соединений, используемых ими в качестве источников углерода, чрезвычайно велико — это углеводы, спирты, органические кислоты, аминокислоты и т. д. Практически любое природное соединение может быть использовано тем или иным видом микроорганизмов в качестве источника питания или энергии. Вторую группу гетеротрофных организмов составляют паразиты, развивающиеся в живых клетках. Паразиты, нарушая равновесие биохимических процессов в организме, вызывают его заболевание. Некоторые микроорганизмы в зависимости от условий могут существовать либо как паразиты, либо как сапрофиты. Их называют условными или факультативными паразитами. К их числу относятся возбудители многих кишечных инфекций. Другие могут развиваться только в живых клетках — это строгие, или облигатные, паразиты. Способность к биосинтезу у них самая низкая. Для синтеза клеточных белков микроорганизмам необходим азот. По отношению к источникам азотного питания среди микроорганизмов можно выделить автоаминотрофов и гетероаминотрофов. Первые способны использовать азот неорганический (аммонийный, нитратный, молекулярный) или простейшие формы органического (мочевина) и из этих соединений строить разнообразные белки своего тела. При этом все формы азота сначала переводятся в аммонийную форму. Эта наиболее восстановленная форма азота легко трансформируется в аминогруппу. Гетероаминотрофы 74 нуждаются в органических формах азота — белках и аминокислотах. Некоторым из них требуется полный набор аминокислот, другие создают необходимые белковые соединения из одной-двух аминокислот путем их преобразования. Многие гетеротрофные по отношению к углероду микроорганизмы являются автоаминотрофами. К ним относятся бактерии, участвующие в очистке сточных вод. Потребность в кислороде и водороде для конструктивного обмена микроорганизмы удовлетворяют за счет воды и органических питательных веществ. Источниками зольных элементов (Р, S, К, Mg, Мn, Fe) служат соответствующие минеральные соли. Потребность в этих элементах невелика, но присутствие в среде обязательно. Помимо того, для нормальной жизнедеятельности микробов необходимы микроэлементы— Zn, Со, Сu, Ni и др. Часть их входит в состав естественного питания микробов, часть усваивается ими из минеральных солей. Способы получения пищи, т. е. способы питания микроорганизмов, отличаются большим разнообразием. Различают три основных способа питания: голофитное, сапрозойное, голозойное. Голофитное питание (от греч. «голо» —целиком, «фит» — растение) совершается по типу фотосинтеза растений. Такое питание присуще только автотрофам. Среди микроорганизмов этот способ свойствен водорослям, окрашенным формам жгутиковых и некоторым бактериям. Гетеротрофные микроорганизмы питаются либо твердыми пищевыми частицами, либо поглощают растворенные органические вещества. Голозойный способ питания (от греч. «голо» — целиком, «зоик» — подобно животному) предопределяет развитие у микроорганизмов специальных органоидов для переваривания пищи, а у некоторых — и для ее захвата. Например, неокрашенные жгутиковые и ресничные инфузории имеют ротовое отверстие, к которому пища подгоняется соответственно жгутиками или ресничками. Наиболее высокоорганизованные инфузории 75 образуют околоротовыми ресничками ток воды в виде воронки, направленной узким концом в рот. Пищевые частицы осаждаются на дне воронки и заглатываются инфузорией. Такие инфузории называют седиментаторами. Амебы питаются путем фагоцитоза. Микроорганизмы с голозойным способом питания для конструктивного метаболизма используют главным образом цитоплазму других организмов — бактерий, водорослей и т. д. и имеют специальные органоиды для пищеварения. Пищеварительный процесс у простейших осуществляется в пищеварительных вакуолях. Переваривание заключается в гидролитическом расщеплении сложных органических веществ до более простых соединений. При этом углеводы гидролизуются до простых сахаров, белки — до аминокислот, а при гидролизе липидов образуются глицерин и высшие жирные кислоты. Продукты пищеварения всасываются в цитоплазму и подвергаются дальнейшему преобразованию. Бактерии, микроскопические грибы, дрожжи не имеют специальных органоидов для захвата пищи, и она поступает в клетку через всю поверх- ность. Такой способ питания называется сапрозойным. Чтобы проникнуть в клетку, питательные вещества должны находиться в растворенном состоянии и иметь соответствующий размер молекул. Для многих высокомолекулярных соединений цитоплазматическая мембрана непроницаема, а некоторые из них не могут проникнуть даже через клеточную оболочку. Однако это не означает, что высокомолекулярные соединения не используются микроорганизмами как питательные вещества. Микроорганизмы синтезируют внеклеточные пищеварительные ферменты, гидролизующие сложные соединения. Таким образом, процесс пищеварения, протекающий у простейших в вакуолях, у бактерий осуществляется вне клетки (рис. 6.2). Размер молекул — не единственный фактор, обусловливающий проникновение питательных веществ в клетку. 76 Рис. 6.2, Схема внеклеточного пищеварения: А — выделение клеткой гидролитических экзоферментов; Б — фермента- тивный гидролиз сложных веществ; В — проникновение продуктов гидролиза внутрь клетки Цитоплазматическая мембрана способна пропускать одни соединения и задерживать другие. Известно несколько механизмов переноса веществ через мембрану клетки: простая диффузия, облегченная диффузия и активный перенос (рис. 6.3). Простая диффузия—это проникновение молекул вещества в клетку без помощи каких-либо переносчиков. В снабжении клетки питательными веществами простая диффузия большого значения не имеет. Однако именно таким путем в клетку поступают молекулы воды. Немаловажную роль в этом процессе играет осмос — диффузия молекул растворителя через полупроницаемую перепонку в направлении более концентрированного раствора. Роль полупроницаемой перепонки в клетке выполняет цитоплазматическая мембрана. В клеточном соке растворено огромное количество молекул разнообразных веществ, поэтому клетки 77 микроорганизмов обладают довольно высоким осмотическим давлением. Величина его у многих микробов достигает 0,5—0,8 МПа. В окружающей среде осмотическое давление обычно ниже. Это вызывает приток воды внутрь клетки и создает в ней определенное напряжение, называемое тургором. Рис. 6.3. Транспорт веществ через цитоплазматическую мембрану. А—-цитоплазма; Б—мембрана, В—окружающая среда: s, S — субстрат, Р — переносчик При облегченной диффузии растворенные вещества поступают в клетку с участием специальных ферментов-переносчиков, носящих название пермеаз. Они как бы захватывают молекулы растворенных веществ и переносят их к внутренней поверхности мембраны. Простая и облегченная диффузия представляет собой варианты пассивного транспорта веществ. Движущей силой переноса веществ в клетку в этом случае служит градиент концентраций по обе стороны мембраны. 78 Однако большинство веществ поступает в клетку против градиента концент- раций. В этом случае на такой перенос затрачивается энергия и перенос называется активным. Активный перенос протекает с участием специфических белков, сопряжен с энергетическим обменом клетки и позволяет накапливать в клетке питательные вещества в концентрации во много раз большей, чем концентрация их во внешней среде. Активный перенос — основной механизм поступления питательных веществ в клетки с сапрозойным питанием. 1.6.3. Типы метаболизма микроорганизмов Для полной характеристики микроорганизмов используют понятие тип метаболизма. Различия в типах метаболизма определенных групп микроорганизмов обусловлены особенностями конструктивного и спецификой энергетического обменов. В зависимости от используемого источника энергии для получения АТФ микроорганизмы делят на фототрофов (используют энергию света) и хемотрофов (используют энергию химических реакций). Процесс образования АТФ называется фосфорилированием-, он осуществляется в митохондриях (у эукариот) или в ферментных системах, локализованных на цитоплазматической мембране (у прокариот). Механизм образования АТФ у разных групп микроорганизмов неодинаков. Различают субстратное, окислительное и фотофосфорилирование (подробно рассмотрены в разделах 1.6.4.-1.6.6.). Любой тип фосфорилирования обязательно сопряжен с переносом электронов в ходе окислительно- восстановительных реакций энергетического обмена. При этом одни микроорганизмы в качестве доноров электронов (водорода) используют неорганические, другие — органические соединения. Соответственно первые называются литотрофами, вторые — органотрофами. Таким образом, принимая во внимание тип питания (авто- или гетеротрофное), природу донора электрона и источник энергии (свет или химическая реакция), возможные сочетания вариантов конструктивного и энергетического обменов 79 можно представить в виде следующей схемы: Каждый из представленных вариантов характеризует определенный тип метаболизма. В табл. 6.1 приведены представители микроорганизмов каждого типа метаболизма. Большинство микроорганизмов, обитающих в природных и сточных водах и играющих важную роль в формировании качества воды и ее очистке, относятся к восьмому и первому типам метаболизма. В связи с этим при дальнейшем изложении материала именно им уделено основное внимание 1.6.4. Энергетический метаболизм фототрофов Все указанные в табл. 6.1 фотосинтезирующие микроорганизмы приспособлены к использованию света видимого (длина волны 400—700 нм) и ближней инфракрасной части спектра (700—1100 нм). Эта способность существовать за счет энергии света обусловлена присутствующими в клетках фототрофов специфическими светочувствительными пигментами. Каждому виду микроорганизмов свойствен характерный и постоянный набор пигментов (смотри раздел 1.2 и 1.3). Световая энергия улавливается системой поглощающих свeт пигментов и передается в реакционный центр, который содержит молекулы хлорофилла. В темноте молекула хлорофилла находится в стабильном невозбужденном состоянии. Когда свет падает на эту молекулу, она возбуждается вследствие перехода одного из электронов на более высокий энергетический уровень. Молекулы хлорофилла тесно сопряжены с системой транспорта электронов. Каждый квант поглощенного света 80 обеспечивает отрыв от молекулы хлорофилла одного электрона, которым, проходя по цепи переноса электронов, отдает свою энергию системе АДФ— АТФ, в результате чего энергия света трансформируется в энергию макроэргической связи молекулы ЛТФ. Такой процесс образования АТФ называется фотосинтетическим фосфорилированием. Таблица 6.1 Типы метаболизма микроорганизмов Тип метаболизма Представители 1. Фотолитоавтотрофия 2. Фотолитогетеротрофия 3. Фотоорганоавтотрофия 4. Фотоорганогетеротрофия 5. Хемолитоавтотрофия 6. Хемолитогетеротрофия 7. Хемоорганоавтотрофия 8. Хемоорганогетеротрофия Водоросли, цианобактерии, большинство пурпурных и зеленых серобактерий Частично цианобактерии, пурпурные и зеленые серобактерии Некоторые пурпурные бактерии Большинство несерных пурпурных бактерий Нитрифицирующие, тионовые, некоторые железобактерии Бесцветные серобактерии Некоторые бактерии, окисляющие муравьиную кислоту Простейшие, грибы, большинство бактерий Однако для осуществления биосинтетических процессов конструктивного обмена микроорганизмам кроме энергии, необходим восстановитель — донор водорода (электронов). Для водорослей и цианобактерии таким экзогенным донором водорода служит вода. Восстановление диоксида углерода в процессе фотосинтеза и превращение его в структурные компоненты клетки у этих видов микроорганизмов протекает аналогично фотосинтезу высших растений: энергия АТФ СО 2 +Н 2 О ——>(СН 2 О)+О 2 (6.3) Формула СН 2 О символизирует образование органического соединения, в котором уровень окисленности углерода примерно соответствует окисленности углерода в органических веществах клетки. У фотосинтезирующих бактерий донорами водорода для реакций 81 синтеза могут быть как неорганические, так и органические вещества. Большинство пурпурных и зеленых серобактерий, относящихся к группе фотолитоавтотрофов, восстанавливает СО 2 , используя H 2 S как донор водо- рода: энергия АТФ СО 2 +2Н 2 S——>(СН 2 О)+Н 2 О+2S(6.4) Такой тип фотосинтеза получил название фоторедукции. Основное отличие бактериальной фоторедукции от фотосинтеза зеленых растений и водорослей заключается в том, что донором водорода служит не вода, а другие соединения и что фоторедукция не сопровождается выделением кислорода. В отличие от неорганических восстановителей, которые выполняют роль только доноров водорода, экзогенные органические восстановители могут одновременно служить и источниками углерода (фотоорганогетеротрофия). Способность использовать органические соединения в той или иной степени присуща всем фотосинтезирующим бактериям. Для фотолитогетеротрофов они служат только источниками углеродного питания, для фотоорганоавтотрофов — только донорами водорода. Например, несерные пурпурные бактерии рода Rhodopseudomonas sp. могут осуществлять фотосинтез, используя в качестве донора водорода изопропанол, восстанавливая при этом диоксид углерода и продуцируя ацетон. энергия АТФ СО 2 + 2СН 3 СНОНСН 3 ——> (СН 2 О) + 2СН 3 СОСН 3 + Н 2 О 1.6.5. Энергетический метаболизм хемотрофов, использующих процессы брожения Из трех путей образования АТФ (см. раздел 1.6.3.) субстратное фосфорилирование- наиболее простой. Такой тип энергетического метаболизма характерен для многих бактерий и дрожжей, осуществляющих различные виды брожения. 82 Брожение идет в анаэробных условиях и может быть определено как процесс биологического окисления сложных органических субстратов для получения энергии, при котором конечный акцептор водорода (также органическое вещество) образуется в ходе распада исходного субстрата. При этом одни органические вещества служат донорами водорода и окисляются, другие — акцепторами водорода и в результате восстанавливаются. Перенос водорода от доноров к акцепторам осуществляется с помощью окислительно- восстановительных ферментов и схематически может быть представлен реакциями (5.1), (5.2) и (5.4). Кроме углеводов, многие бактерии способны сбраживать самые разнообразные соединения: органические кислоты, аминокислоты, пурины и т.д. Условие, определяющее способность вещества к сбраживанию,— наличие в его структуре не полностью окисленных (восстановленных) атомов углерода. Только в этом случае возможна внутри и межмолекулярная перестройка субстрата за счет сопряжения окислительных и восстановительных реакций без участия кислорода. В результате процессов брожения в среде накапливаются вещества, в которых степень окисления углерода может быть как выше, так и ниже, чем в исходном субстрате. Однако строгое равновесие окислительных и восстановительных процессов при брожении приводит к тому, что средняя степень окисления углерода остается такой же, как у субстрата. Например, при спиртовом брожении глюкозы: C 6 H 12 O 8 2СО 2 +2С 2 Н 5 ОН образуются две молекулы СО 2 (степень окисления углерода +4) и две молекулы спирта со степенью окисления углерода —2. Средняя степень окисления углерода в процессах брожения составляет: 2 (+4) + 2 [2 (—2)]=0, т. е. равна степени окисления атомов углерода в исходной молекуле глюкозы. Существует несколько типов брожений, названия которым даются по конечному продукту: спиртовое (осуществляют дрожжи и некоторые виды бактерий), пропионовокислое (пропионовые бактерии), метановое 83 (метанообразующие бактерии), маслянокислое (маслянокислые бактерии). Многие микроорганизмы, осуществляющие процессы брожения,— облигатные анаэробы, не способныеразвиваться в присутствии кислорода и даже более слабых окислителей. Другие — факультативные анаэробы — могут расти как в кислородной среде, так и в бескислородной. Это отли- чительное свойство факультативных анаэробов объясняется тем, что они могут изменять способ образования АТФ и переключаться с окислительного фосфорилирования при наличии в среде кислорода (см. раздел 1.6.6) на субстратное при его отсутствии. Характерная особенность процессов биоло- гического окисления — их многостадийность, обеспечивающая постепенное выделение свободной энергии, заключенной в сложных органических субстратах. Рис. 6.4. Схема окисления углеводородов в процессе брожения 84 Многостадийность энергетического метаболизма принципиально необходима для жизнедеятельности любого организма. Если бы в клетке окисление сложных веществ протекало в одну стадию, то одновременное освобождение нескольких сотен килоджоулей привело бы к выделению большого количества тепла, резкому повышению температуры и к гибели клетки, поскольку эффективность использования энергии ограничена возможностями системы АДФ-АТФ. Рассмотрим процесс брожения и образование АТФ на примере сбраживания углеводов (рис. 6.4). Первый этап превращения углеводов — подготовка к энергетическим преобразованиям, состоящая в ферментативном гидролизе углеводов до простых сахаров. Этот процесс идет вне клетки, если используется экзогенный субстрат, и внутри клетки, если организм окисляет запасные вещества. На следующем этапе, включающем несколько ферментативных реакций, происходит фосфоролиз молекулы глюкозы с участием АТФ. В результате молекула глюкозы активируется, превращаясь во фруктозо-1,6- дифосфат (ФДФ): En C 6 H 12 O 6 +2АТФ С 6 Н 10 О 6 (Н 2 РО 3 ) 2 +2АДФ Далее фруктозо-1,6-дифосфат превращается в фосфоглицериновый альдегид (ФГА): En C 6 H 10 O 6 (H 2 PО 3 ) 2 2C 3 H 5 O 3 (H 2 PО 3 ) Из фосфоглицеринового альдегида в результате семи последовательных ферментативных реакций образуется пировиноградная кислота (ПВК): En 2С 3 Н 5 О 3 (Н 2 РО 3 )+2НАД+4АДФ+2Н 3 РО 4 2CH 3 COCOOH+4AТФ+2НАД•Н 2 (6.5) На этом этапе превращения глюкозы окислительные реакции являются собственно энергетической частью процесса брожения. Как видно из выражения (6.5), окисление сопряжено с образованием АТФ. Фосфорилирование осуществляется непосредственно на молекуле субстрата, 85 поэтому и носит название субстратного. Таким образом, общий энергетический выход процесса превращения молекулы глюкозы в ПВК составляет 2АТФ, поскольку из четырех образовавшихся молекул АТФ две затрачиваются на активацию глюкозы. В реакциях энергетического обмена ПВК— ключевой метаболит. До стадии образования ПВК процесс идет одинаково у всех организмов. Конечным продуктом этого этапа кроме ПВК является и восстановленная дегидрогеназа НАД•Н 2 Регенерация фермента совершается в результате окислительно-восстановительных реакций с участием ПВК или продуктов, полученных из нее. Эти реакции дальнейшего превращения ПВК у разных микроорганизмов значительно варьируют, определяя тип брожения. Простейший пример анаэробного окисления глюкозы — молочнокислое брожение. Оно вызывается молочнокислыми бактериями, факультативными анаэробами, не образующими спор. Превращение ПВК при молочно-кислом брожении протекает следующим образом: СН 3 СОСООН + НАД Н 2 —> СН 3 СНОНСООН + НАД В этой заключительной реакции процесса сбраживания глюкозы ПВК выполняет роль конечного акцептора водорода, обеспечивая регенерацию НАД. При спиртовом брожении ПВК превращается в этанол и CO 2 Возбудителями этого вида брожения служат дрожжи. Под действием фермента пируватдекарбоксилазы ПВК переходит в уксусный альдегид: СН 3 СОСООН = 2(CН 3 )СНО + СO 2 Затем уксусный альдегид реагирует с НАД Н 2 , в результате чего образуется этиловый спирт: СН 3 СНО+ НАД Н 2 СН 3 СН 2 ОН + НАД Роль конечного акцептора водорода при спиртовом брожении выполняет уксусный альдегид. Как при молочном, так и при спиртовом брожении превращение ПВК в конечный продукт не сопровождается запасанием энергии. 86 Значительно сложнее механизм пропионовокислого брожения, служащего источником энергии группе пропионовых бактерий, факультативных анаэробов, неподвижных неспорообразующих бактерий рода Propionibacterium. Эти бактерии синтезируют конечный акцептор, присоединяя к молекуле ПВК СО 2 . Процесс известен под названием гетеротрофной ассимиляции СО 2 . В результате образуется щавелевоуксусная кислота — акцептор водорода для НАД Н 2 . Дальнейшие ферментативные реакции приводят к образованию пропионовой кислоты. Масляно-кислое брожение осуществляют бактерии рода Clostridium. Для развития масляно-кислых бактерий необходимо присутствие в среде веществ разной степени окисленности. Такими веществами могут быть, например, ПВК и молочная кислота. Клостридии превращают ПВК в ацетилкоэнзим - А — ключевое соединение во всех видах брожений, вызываемых клостридиями. Реакция протекает с участием ферментов дегидрогеназы ПВК и коэнзима-А и сопровождается декарбоксилированием ПВК: СН 3 СОСООН + HSKoA + НАД—> 2(СН 3 )СО SKoA + НАД Н 2 + О 2 (6.6) коэнзим-А ацетил-коэнзим А Синтез масляной кислоты — процесс многостадийный, включающий конденсацию двух молекул ацетил-КоА, восстановление с участием НАД H 2 [из реакции (6.6)] с последующим гидрированием, дегидратацией, повторным восстановлением и отщеплением HSKoA. Характерный продукт брожения — масляная кислота. Очевидно, что такого рода синтетические процессы, приводящие к образованию вещества с четырьмя атомами углерода в молекуле (СН 3 —СН 2 —СН 2 —СООН) из промежуточных трехуглеродных (СН 3 СОСООН) и двухуглеродных (СН 3 СОSKoA) соединений, не могут быть источником энергии. Некоторые виды клостридии осуществляют ацетоно-бутиловое брожение. На первом этапе они образуют масляную кислоту. Но по мере ее накопления в среде и падения вследствие этого значения рН в их клетках 87 индуцируются ферменты, обеспечивающие превращение масляной кислоты в н-бутанол и ацетон, физиологический смысл этих дополнительных ферментативных реакций состоит в образовании продуктов нейтрального характера, какими являются м-бутанол и ацетон. В результате бактерии снижают кислотность среды и противодействуют неблагоприятным условиям. Таким образом, энергетический выход процесса брожения невелик, поскольку органические вещества не окисляются полностью и часть энергии исходного субстрата сохраняется в достаточно сложных продуктах брожения. В большинстве случаев при сбраживании глюкозы клетка запасает две молекулы АТФ на 1 моль глюкозы. Для получения энергии, необходимой для синтеза клеточного вещества и других жизненных функций, микроорганизмам, осуществляющим процессы брожения, приходится перерабатывать большое количество органических веществ. Именно в силу этих причин на очистных станциях систем водоотведения анаэробные процессы брожения используют для обработки концентрированных субстратов — осадков сточных вод. |