Учебное пособие, Царев. Практикум по дисциплине Основы микробиологии. Предназначено для бакалавров направления 18. 03. 02 Энерго и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии
 Скачать 2.32 Mb.
|
|
рРНК, по-видимому, обеспечивают правильность взаимного расположения компонентов синтеза. Липиды. Липиды (жиры и жироподобные вещества) — органические соединения нерастворимые в воде, но растворимые в органических неполярных растворителях таких, как эфир, бензол, хлороформ. Липиды в клетках большинства микроорганизмов составляют 2-15% сухой массы. Лишь у кислотоустойчивых бактерий и у некоторых видов грибов и дрожжей количество жиров может достигать 40%. В связанном состоянии жиры находятся в цитоплазматической мембране. В свободном состоянии жиры играют роль запасных веществ и служат источниками энергии. Истинные жиры представляют собой сложные эфиры глицерина и высших жирных кислот с общей формулой: 50 Остатки жирных кислот, входящие в состав жиров, содержат четное число атомов углерода (12—22) и могут быть насыщенными или ненасыщенными, относиться к одному или разным типам кислот. В обшей молекулярной массе жиров основную долю составляют остатки жирных кислот вследствие чего свойства этих жиров в первую очередь определяются свойствами жирных кислот. Именно они придают жирам гидрофобность. Важнейшими жироподобными веществами являются фосфо- и гликолипиды. Фосфолипиды или глицерофосфаты, обладающие большой физиологической активностью, отличаются от истинных жиров тем. что один из остатков жирных кислот заменен и в них фосфорной кислотой, соединенной эфирной связью с каким-либо спиртом. Гликолипиды содержат в своем составе углеводы. К числу неомыляемых жиров, содержащихся в клетках микроорганизмов, относятся стероиды, жирорастворимые витамины и некоторые пигменты, например, каротиноиды. Углеводы. В клетках бактерий на долю углеводов приходится 12—.30% сухого вещества, в клетках грибов—до 40--60%. Углеводы принимают участие в синтезе белков и жиров, входят в состав структурных компонентов клетки и служат источником энергии в клетке. Эмпирическая формула углеводов (CH 2 O) n . Углеводы делятся на простые сахара, олигосахариды и полисахариды. Из простых сахаров наибольшее значение для живых организмов имеют гексозы (в частности, глюкоза) и пентозы (например, рибоза и дезоксирибоза). Среди олигосахаридов наиболее важны дисахариды (состоящие из двух молекул простых сахаров): сахароза, мальтоза, целлобиоза, лактоза. Большинство углеводов, встречающихся в природе, существует в форме высокомолекулярных полисахаридов. По химическому составу полисахариды подразделяют на пептозаны (мономер пентоза), гексозаны (мономер гексоза) и смешанные полисахариды, имеющие в своем составе различные сахара. К пентозанам относятся гемицеллюлозы: к гексозанам — 51 декстраны, состоящие из остатков глюкозы и часто встречающиеся в клетках дрожжей и бактерий, а также целлюлоза, крахмал и гликоген. По функциональному назначению различают структурные и резервные полисахариды. Важнейший структурный компонент зеленых водорослей — целлюлоза. У бактерий жесткий каркас клеточной стенки образуется в результате ковалентного связывания параллельных полисахаридных цепей короткими поперечными пептидными цепями. Полисахариды входят в состав капсул бактерий и выделяются микроорганизмами в виде слизи. К числу основных резервных полисахаридов относятся крахмал, гликоген и декстрины. 1.5. ФЕРМЕНТЫ 1.5.1. Природа ферментов и особенности ферментативного катализа Ферменты, или энзимы, составляют самый крупный и наиболее высокоспециализированный класс белковых молекул. Ферменты синтезируются самой клеткой и выполняют в ней функции катализаторов биохимических реакций. Катализаторами называются вещества, которые, участвуя в реакции, изменяют ее скорость, но сами к концу реакции остаются химически неизмененными. На рис. 5.1 представлена Энергетическая схема некатализируемой и катализируемой реакций. Химическое взаимодействие молекул происходит только в результате их столкновения при условии, что в этот момент они обладают некоторым избытком свободной энергии G, достаточным для перехода их в активированное (переходное) состояние. Скорость реакции пропорциональна концентрации активированных молекул. Сущность действия катализатора состоит в том, что он, связывая реаги- рующие вещества, приводит к появлению нового переходного состояния, для которого свободная энергия активации G существенно ниже, чем в некатализируемой реакции. Следует отметить, что введение катализатора не отражается на суммарном энергетическом эффекте реакции ΔG и не изменяет состояния равновесия в реагирующей системе. 52 С ВО БО ДН АЯ Э Н ЕРГ И Я ХОД РЕАКЦИИ I II III IV V G` G G Рис. 5.1. Энергетическая схема некатализируемой и катализируемой реакций: I — начальное состояние; II — свободная энергия активации катализируемой реакции, III — то же, некатализируемой реакции; IV — полное изменение свободной энергии в ходе реакции; V—конечное состояние. Катализ называют гомогенным, если катализатор и реагирующие вещества находятся в одной фазе, и гетерогенным, если они образуют две фазы. Ферментативный катализ обычно рассматривают как катализ гетерогенный, происходящий на поверхности гигантских белковых молекул ферментов. Подчиняясь общим закономерностям каталитических процессов, ферментативный катализ имеет ряд существенных отличий от химического катализа. Прежде всего, ферментативный катализ протекает в живой клетке в ограниченном диапазоне температур, значений рН и давления. В большинстве случаев условия, в которых ферменты осуществляют катализ, оказываются достаточно «мягкими». Одна из важнейших особенностей 53 ферментов как катализаторов — строгая специфичность их действия. Под специфичностью понимают способностьфермента реагировать только с одним веществом (абсолютная специфичность); с группой веществ, обладающих общими структурными признаками (групповая специфичность); действовать на определенную химическую связь (относительная специфичность) или определенный стереоизомер (стереохимическая специфичность). Многие ферменты образуют в клетке так называемые мультиферментные системы, различающиеся по сложности молекулярной организации. Процесс превращения вещества с участием системы ферментов представляет собой серию последовательных реакций, каждую из которых катализирует определенный фермент. При этом продукт первой реакции служит субстратом для второй, продукт второй реакции — субстратом для третьей и т. д. Превращение субстрата S в продукт Р в простейшей мультиферментной системе (E1—En) иллюстрируется следующей схемой: S———>S1———>S2———>S3.............Sn-1———>P E1 E2 E3 En Такая кооперативность и строгая последовательность в действии ферментов определяют их самое существенное отличие от катализаторов иной природы. Каждая клетка имеет регуляторные механизмы, позволяющие ей в зависимости от потребностей изменять скорость отдельных биохимических реакций в результате регуляции синтеза определенных ферментов или их активности. Способность подчиняться такой регуляции — крайне важная особенность ферментов как катализаторов. Каталитическая активность ферментов чрезвычайно высока. Химическая реакция разложения пероксида водорода катализируется ионами железа. В живой клетке под воздействием фермента каталазы, содержащего железо, эта реакция протекает в 10 10 раз быстрее, чем с неорганическим катализатором. 54 1.5.2. Структура, механизм действия и свойства ферментов Ферменты делятся на одно- и двухкомпонентные. Первые представляют собой простые белки, вторые — сложные белки. Каталитическая активность однокомпонентных ферментов обусловлена определенным пространственным расположением остатков аминокислот на отдельных участках молекулы фермента — активных центрах. Именно на них и протекают каталитические реакции. Активные центры реагируют только с тем субстратом, пространственная конфигурация которого совпадает со структурой активного центра. Большинство ферментов относится к двухкомпонентным. Их молекула состоит из белковой части — апофермента и небелкового компонента — кофактора. В зависимости от прочности связи с апоферментом кофактор называют простетическои группой, если он прочно связан с белком, или коферментом, если эта связь слабая. Каталитической активностью обладает только кофактор, роль которого часто выполняют сложные органические комплексы, например, некоторые витамины. Апофермент усиливает каталитическую активность кофакторов и определяет специфичность дейст- вия ферментов. Один и тот же кофактор, связываясь с разными белками, может катализировать определенную реакцию, например, отщепление водорода, с десятками различных субстратов. Ферментативная реакция проходит через ряд последовательных стадий. В начальный момент фермент Е образует с молекулой субстрата S промежуточное соединение — фермент-субстратный комплекс ES. На последующих стадиях фермент активизирует субстрат, т. е. изменяет его таким образом, что субстрат может вступить в соответствующую химическую реакцию. Этому моменту соответствует образование каталитически активного комплекса ES'. Далее происходит собственно реакция на молекуле фермента, в результате которой получается фермент- продуктный комплекс ЕР. Процесс заканчивается выделением продукта реакции Р и регенерацией фермента: 55 E + S <—> ES <—> ES ` <—> ЕР <—> E + Р. Такой механизм действия ферментов подтвержден экспериментально. Белковая природа ферментов обусловливает их лабильность, которая выражается в тем, что ферменты теряют активность под влиянием некоторых факторов. Важнейшие из них — температура и реакция среды. Зависимость активности ферментов от температуры носит сложный характер (рис. 5.2). С повышением температуры активность увеличивается, но в довольно узких пределах. Максимальная активность достигается в области оптимальной тем- пературы, после чего начинается падение активности, связанное с денатурацией белковой части фермента при повышенных температурах и потерей в результате этого каталитической активности. Оптимальная температура, как и температура, вызывающая инактивацию, для разных ферментов неодинакова. Одни ферменты начинают терять активность уже при 40°С, другие —только при 70°С. Почти все ферменты необратимо разрушаются при 80°С. Ак тив ность ф ер мента температура А АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА рН 2 4 6 8 10 А Б В Рис. 5.2. Влияние температуры на активность ферментов (точка А- оптимальная температура) Рис. 5.3. Влияние рН на активность ферментов: А- пепсин; Б- сахароза; В- трипсин Большинство ферментов имеют максимальную активность в нейтральной среде, но для некоторых оптимум рН может находиться и 56 кислой или щелочной области значений. Для каждого фермента характер зависимости активности от рН определяется степенью влияния концентрации водородных и гидроксильных ионов на ионизацию функцио- нальных групп фермента и субстрата и структуру апофермента (рис. 5.3). Активность ферментов зависит и от присутствия в среде некоторых химических соединений. Одни повышают активность ферментов и называются активаторами, другие — ингибиторы — снижают активность фермента. Различают обратимое и необратимое ингибирование. При необратимом ингибировании фермент полностью или частично теряет активность в результате необратимого разрушения или модификации его функциональных групп. Обратимое ингибирование может быть конкурентным и неконкурентным. В первом случае ингибитор (I) по структуре молекулы напоминает субстрат и может взаимодействовать с активным центром фермента, т. е. конкурировать за него с субстратом. При этом степень ингибирования зависит от соотношения концентраций субстрата и ингиби- тора, и поэтому действие ингибитора может быть снижено или устранено повышением концентрации субстрата. Схема действия конкурентного ингибитора показана на рис. 5.4. Классическим примером конкурентного ингибирования служит конкуренция между янтарной (субстрат) и малоновой Рис. 5.4. Схема действия конкурентного ингибитора (ингибитор) кислотами, между n-аминобензойной кислотой (субстрат) и стрептоцидом (ингибитор): 57 В основе неконкурентного ингибирования лежит способность ингибитора взаимодействовать с какой-либо группой молекулы фермента, существенно влияющей на его активность, но не входящей в активный центр. Кроме упомянутых видов ингибирования возможно торможение ферментативной реакции, наблюдаемое при избыточной концентрации субстрата (субстратное ингибирование). В этом случае в результате реакции фермента одновременно с двумя молекулами субстрата образуется неак- тивный фермент-субстратный комплекс. Ингибирование конечным продуктом осуществляется регуляторным механизмом клетки по типу обратной связи, заключается в подавлении синтеза ферментов, катализирующих реакцию, продукт которой оказывается в клетке в избытке. Каждому виду микроорганизмов свойствен определенный набор ферментов, постоянно присутствующих в клетке (конститутивные ферменты). В то же время некоторые ферменты синтезируются клеткой только тогда, когда в среде появляется соответствующий субстрат. Такие ферменты называются индуктивными. По месту действия ферменты подразделяют на внутриклеточные (эндоферменты) и ферменты, которые клетка выделяет во внешнюю среду (экзоферменты). Экзоферменты необходимы большинству прокариот. 58 1.5.3. Классификация ферментов В период открытия первых ферментов названия им давались по случайным признакам. Например, пепсин, обнаруженный в желудочном соке, получил свое название от греческого слова «пепсис» — пищеварение. Позднее Дюкло предложил ввести рациональную номенклатуру, где ферменты назывались по субстрату, на который они действуют, с прибавлением суффикса «аза». Так, фермент, разлагающий сахарозу, назывался сахараза, фермент, разлагающий мочевину (urea),— уреаза и т. д. Однако расширение знаний о ферментах показало, что такая номенклатура зачастую оказывается неоднозначной, так как различные реакции с одним и тем же субстратом могут катализировать разные ферменты. В настоящее время известно около 1000 ферментов. В 1961 г. Международный биохимический конгресс принял новые классификацию и номенклатуру ферментов, построенные строго на научных принципах. Согласно этой классификации все ферменты по типу катализируемой реакции делятся на шесть классов. Классы, в свою очередь, подразделяют на подклассы и подклассы с порядковой нумерацией. Каждый фермент имеет четырехзначный шифр с номерами класса, подкласса, подподкласса; последняя цифра соответствует номеру фермента в соответствующем подподклассе. Систематическое название фермента несет химическую информацию, однако часто оказывается чересчур громоздким, поэтому в повседневной практике чаще используют тривиальные названия ферментов. В приведенной ниже характеристике классов наибольшее внимание уделено ферментам, ознакомление с которыми необходимо для понимания сущности процессов разложения органических веществ микроорганизмами. 1. Оксиредуктазы ускоряют окислительно- восстановительные реакции, осуществляя перенос электронов или атомов водорода (е - +Н + ) от окисляемого субстрата (доноpa электрона) к акцептору, который при этом восстанавливается. 59 В переносе электронов от субстрата к конечному акцептору принимают участие четыре главные группы оксиредуктаз: первичные дегидрогеназы, вторичные дегидрогеназы, цитохромы, хиноны. Биологическое окисление органических веществ в клетке — процесс сложный и многостадийный, в котором участвует комплекс ферментов. Окисление осуществляется путем дегидрирования органического соединения. Процесс катализируют ферменты, носящие название дегидрогеназ. Коферментом для первичных дегидрогеназ служат никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинук- леотидфосфат (НАДФ): Соединяясь с различными белковыми носителями, НАД и НАДФ образуют множество ферментов, катализирующих реакцию дегидрирования разнообразных веществ. В общем виде окислительно- восстановительные реакции с участием первичных дегидрогеназ можно представитъ следующими уравнениями: вoccтановленный субстрат+НАД—>окисленный субстрат + НАД•Н 2 (5.1) восстановленный субстрат+НАДФ—>окисленный субстрат+НАДФ•Н 2 (5.2) Первичные дегидрогеназы называют анаэробными, так как они не 60 могут передавать отнятый от субстрата водород непосредственно кислороду. Вторичные дегидрогеназы в качестве кофермента содержат флавинадениндинуклеотид (ФАД) или флавинаденин-мононуклеотид (ФМН). Активной частью ФАД и ФМН является рибофлавин (витамин В2), непосредственно участвующий в окислительно-восстановительных реакциях. Вторичные дегидрогеназы катализируют дегидрирование жирных кислот, аминокислот. Донором водорода для них. т. е. восстановленным субстратом, могут служить и восстановленные первичные дегидрогеназы. В этом случае окислительно- восстановительная реакция имеет вид НАД•Н2 + ФАД—> ФАД•Н 2 + НАД (5.3) и представляет собой один из вариантов регенерации первичной дегидрогеназы. Кроме реакции (5.3) регенерация первичных дегидрогеназ может происходить при их взаимодействии с окисленным органическим веществом по схеме: НАД•Н 2 + окисленное органическое вещество—> восстановленное органическое вещество + НАД (5.4) Таким образом, конечным акцептором водорода для первичных дегидрогеназ служат либо ФАД и ФМН, либо окисленные органические вещества. Рис. 5.5. Схема передачи электронов по цитохромной системе Вторичные дегидрогеназы могут передавать водород непосредственно кислороду, поэтому носят название аэробных. Однако в большинстве случаев |