Учебное пособие, Царев. Практикум по дисциплине Основы микробиологии. Предназначено для бакалавров направления 18. 03. 02 Энерго и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии
 Скачать 2.32 Mb.
|
|
•Н2 к молекулярному кислороду за счет обратимого изменения валентности атома железа. Непосредственно с кислородом может реагировать только последний в цепи цитохром, называемый цитохромоксидазой. Схема передачи электронов по цепи цитохромов показана на рис. 5.5. Одновременно через раствор кислороду передается ионизированный атом водорода. Рис. 5.6. Схема передачи водорода в полифенольной системе Хиноны, способные к обратимому окислительно- восстановительному процессу в результате присоединения и отдачи атомов водорода, могут участвовать в передаче электронов от флавиновых дегидрогеназ на цитохромную систему и функционировать в полифенольной системе (рис. 5.6). Совокупность оксиредуктаз, участвующих в транспорте водорода (электрона) от исходного субстрата к конечному акцептору, составляет дыхательную цепь ферментов, длина которой зависит от вида микроорганизмов. Важнейшее значение имеет структурная организация системы окислительно- восстановительных ферментов. В клетках эукариот 62 она локализована на внутренней мембране митохондрий. Системы оксиредуктаз прокариот обнаруживаются в цитоплазматической мембране и на внутриклеточных мембранных образованиях. Помимо описанных ферментов к классу оксиредуктаз относятся каталаза, расщепляющая токсичный для клетки пероксид водорода по схеме: каталаза Н 2 О 2 + Н 2 О 2 ------->2Н 2 О + О 2 и пероксидаза, катализирующая реакции окисления органических веществ пероксидами. 2. Трансферазы катализируют перенос функциональных групп, ферменты этого класса подразделяют в зависимости от характера переносимой группы. К трансферазам относят очень распространенные и важные для клетки ферменты — фосфоферазы, катализирующие перенос остатка фосфорной кислоты. Благодаря этой реакции в клетке целый ряд органических соединений превращается в фосфорные эфиры с повышенной химической активностью и поэтому легко вступает в последующие реакции. 3. Гидролазы катализируют реакции гидролитического расщепления сложных органических субстратов: E S 1 S 2 + НОН ---> S 1 Н +S 2 ОН В зависимости от химической природы связи, на которую действуют гидролазы, различают эстеразы, осуществляющие гидролиз сложных эфиров; гликозидазы, действующие на гликозидные связи углеводов; пептидазы, катализирующие гидролиз белков по пептидным связям, и т. д. У прокариот многие гидролазы относятся к внеклеточным ферментам. 4. Лиазы катализируют негидролитическое отщепление атомных группировок с образованием двойных связей или присоединение по месту этих связей. Действуют на связи типа С-С, C=N, С-О и т.д. 5. Изомеразы катализируют внутримолекулярные превращения, например, превращение одного изомера в другой. 6. Лигазы (синтетазы) катализируют синтез сложных органических 63 соединений. 1.5.4. Кинетика ферментативных реакций Под ферментативной кинетикой понимают зависимость скорости реакции от концентрации фермента и субстрата и условий их взаимодействия таких, как температура, реакция среды, наличие активаторов и ингибиторов и т. д. В упрощенном виде реакция превращения субстрата S в продукт Р при участии фермента Е записывается следующим образом: k +1 k +2 S + E <-----> ES ----> E + P , (5.5) k -1 где k +1 , k -1 — константы скоростей прямой реакции образования комплекса ES и обратной реакции его диссоциации; k +2 — константа скорости образования конечного продукта. Живая клетка—это открытая система с непрерывным поступлением и удалением веществ, характеризующаяся постоянством скоростей биохимических изменений. Такое состояние системы называется стационарным. Организм в целом или отдельные его части всегда находятся в стационарном состоянии или в периоде перехода от одного стационарного состояния к другому. Применительно к рассматриваемой реакции условием стационарности процесса служит постоянство концентрации фермент-субстратного комплекса. Принимая во внимание скорости образования, диссоциации и распада комплекса ES, представим это условие в следующем виде: Σd[ES]/dt = k +1 [E] [S] - k -1 [ES] -- k +2 [ES] = 0 . (5.6) Обозначим общую концентрацию фермента в системе E о и выразим концентрацию его [E] в любой момент времени [Е]= [Е o ] — [ES]. Подставив значение [Е] в выражение (5.6), получим k +1 [Eo][S] - k +1 [ES][S] - k -1 [ES] - k +2 [ES] = 0, откуда 64 S k k k S E ES 1 2 1 0 . (5.7) Обозначив ((k -1 )+(k +2 ))/k +1 = K m , получим следующее выражение для концентрации комплекса [ES]: S К S E ES m 0 . (5.8) Скорость v образования конечного продукта определяется скоростью распада фермент-субстратного комплекса: v = k +2 [ES]. (5.9) Подставляя в уравнение (5.9) значение [ES] для уравнения (5.8), получим уравнение (5.10): S К S E k v m 0 2 . (5.10) Уравнение (5.10) является основным уравнением стационарной кинетики ферментативных реакций и называется уравнением Михаэлиса — Ментен, экспериментально доказавшим применимость его ко многим ферментативным процессам. Соотношение констант (5.7), обозначаемое К m , называется константой Михаэлиса — Ментен. Максимальная скорость реакции v mах достигается при такой концентрации субстрата, когда весь фермент связан в фермент-субстратный комплекс, т. е. [Eo]=[ES] и V max = k +2 [ES] = k +2 [Eo]. Тогда уравнение (5.10) можно выразить: S К S v v m max . (5.11) В частном случае v= v max / 2. При этом условии K m = [S]. Таким образом, константа Михаэлиса численно равна такой концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимального значения. К m имеет размерность в молях на литр (моль/л) и не имеет определенного 65 значения для каждого фермента, так как зависит и от структуры субстрата. На величину К т влияют температура и значение рН. С [E] [S] max O A B C Рис. 5.7. Зависимость скорости ферментативной реакции v от кон- центрации фермента [Е] Рис. 5.8 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата [S]; OA— реакция первого порядка BC - реакция нулевого порядка Анализ уравнения (5.10) показывает, что при условии [S]>> [E o ] скорость ферментативной реакции линейно возрастает с увеличением концентрации фермента (рис. 5.7). Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата имеет гиперболический характер (рис. 5.8). При низких концентрациях субстрата, когда соблюдается условие [S]<<K m , можно принять, что K m +[S]=K m . Поэтому m К S E k v 0 2 , (5.12) т. е. скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата (реакция первого порядка). Когда [S]>> К т , то К т + [S] = [S] и v=k +2 [E o ]=v max . Таким образом, при некоторой концентрации субстрата скорость реакции достигает постоянного максимального значения и становится не зависящей от концентрации субстрата (реакция нулевого порядка). В переходной зоне от момента нарушения линейной зависимости v от [S] до до- стижения максимальной скорости реакция имеет смешанный порядок. 66 Так как зависимость скорости реакции от концентрации субстрата выражается гиперболической функцией, практическое определение величин K m и v max затруднительно. Лайнуивером и Берком предложен один из способов определения этих величин путем линеаризации уравнения (5.11) и приведения его к виду: max max 1 1 1 v S v K v m . (5.13) При использовании уравнения (5.13) по экспериментальным данным строят график в координатах 1/v– 1/[S]. Прямая линия, выражающая эту зависимость, отсекает на оси ординат отрезок, равный 1/v max , и имеет наклон, равный отношению K m /v max Присутствие в среде ингибитора I существенно влияет на кинетику ферментативной реакции. В случае обратимого конкурентного ингибирования, помимо комплекса ES, образуется комплекс IS и скорость реакции v описывается уравнением: i m m i K I K S К S E k v 0 2 , (5.14) где K i = [Е] [I] / [ЕI] — константа равновесия реакции фермента и ингибитора. Таким образом, степень снижения скорости ферментативной реакции при конкурентном ингибировании определяется величиной K m [I]/K i При обратимом неконкурентном ингибировании ингибитор способен реагировать как с ферментом, так и с фермент-субстратным комплексом. Кинетика такой реакции подчиняется уравнению, полученному Холденом: ) 1 ( 0 2 i m i K I S К S E k v . (5.15) Величина (1+[I]/K i ) отражает снижение скорости реакции при увеличении концентрации ингибитора. Наиболее наглядно процесс ингибирования и его характер 67 демонстрируются графиками Лайнуивера — Берка (рис. 5.9). При конкурентном ингибировании с повышением концентрации ингибитора увеличивается угол наклона прямой к оси абсцисс, но величина максимальной скорости остается постоянной. Рис. 5.9. Графики Лайнуивера — Берка А — конкурентное ингибирование: I — в отсутствие ингибиторанаклон графика = К m /V mах ; отсекаемый на оси абсцисс отрезок = —1/K m ; II — в присутствии ингибитора наклон графика = (1+ [I]/K i )(K m /V max ); отсекаемый на оси абсцисс отрезок = —1/[K m (1+[I]/K i )]; Б — неконкурентное ингибирование: I — в отсутствие ингибитора отсекаемый на оси ординат отрезок = l/V max ; II—в присутствии ингибитора отсекаемый на оси координат отрезок = (1/V max ) (1+[I]/K i ) Аналогичный график для случая неконкурентного ингибирования отличается от графика неингибированной реакции не только наклоном прямой, но и отрезком, отсекаемым на оси ординат. Это показывает, что в присутствии неконкурентного ингибитора максимальная скорость реакции понижается и тем больше, чем выше концентрация ингибитора. Основные положения ферментативной кинетики применяют и для 68 описания процессов биохимической очистки, хотя это значительно более сложный процесс, в котором участвует множество ферментов и субстратов. 1.6. МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ 1.6.1. Общие понятия об обмене веществ и энергии Совокупность процессов превращения материи в живом организме, сопровождающихся постоянным ее обновлением, называется обменом веществ или метаболизмом. Важнейшими свойствами живых организмов являются способность к самовоспроизведению и теснейшая взаимосвязь их с окружающей средой. Любой организм может существовать только при условии постоянного притока питательных веществ из внешней среды и выделения в нее продуктов жизнедеятельности (рис. 6.1). Питательные вещества, поглощаемые клеткой, в результате сложных биохимических реакций превращаются в специфические клеточные компоненты. Совокупность биохимических процессов поглощения, усвоения питательных веществ и создания за их счет структурных элементов клетки называется конструктивным обменом или анаболизмом. Конструктивные процессы идут с поглощением энергии. 69 Рис. 6.1. Схема основных путей метаболизма у микроорганизмов А —окружающая среда, Б — клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана; В — цитоплазма Энергию, необходимую для процессов биосинтеза и других клеточных функций таких, как движение, осморегуляция и т.д., клетка получает за счет потока окислительных реакций, совокупность которых представляет собой энергетический обмен, или катаболизм (рис. 6.1). Все живые организмы могут использовать только химически связанную энергию. Каждое вещество обладает определенным запасом потенциальной энергии. Главные материальные носители ее - химические связи, разрыв или преобразование которых приводит к освобождению энергии. Энергетический уровень химических связей неодинаков. Для одних он имеет величину порядка 8—10 кДж. Такие связи называют нормальными. В других связях заключена значительно большая энергия - 25—40 кДж. Это так называемые макроэргические связи. Почти все известные соединения, 70 обладающие такими связями, включают атомы фосфора или серы, участвующие в образовании этих связей. Важнейшую роль в жизнедеятельности клетки играет аденозинтрифосфорная кислота (АТФ). В состав ее молекулы входят аденин, рибоза и три остатка фосфорной кислоты: АТФ занимает центральное место в энергетическом обмене клетки. Макроэргические связи в молекуле АТФ (обозначены волнистой линией) очень непрочны. Гидролиз этих связей приводит к освобождению значительного количества свободной энергии: Е n АТФ + Н 2 О АДФ + Н 3 РО 4 + 30,56 кДж (6.1) Гидролиз протекает с участием специфических ферментов, обеспечивая энергией биохимические процессы, идущие с поглощением энергии. В этом случае АТФ играет роль поставщика энергии. Имея малый размер, молекула АТФ легко диффундирует в различные участки клетки. Запас АТФ в клетках непрерывно возобновляется за счет реакций присоединения остатка фосфорной кислоты к молекуле аденозиндифосфорной кислоты (АДФ): 71 Е n АДФ + Н 3 РО 4 АТФ + Н 2 О (6.2) Синтез АТФ, как и гидролиз, идет при участии ферментов, но сопровождается поглощением энергии, способы получения которой у микроорганизмов хотя и разнообразны, но могут быть сведены к двум типам: 1) использование энергии света; 2) использование энергии химических реакций. При этом тот и другой виды энергии трансформируются в энергию химических связей АТФ. Таким образом, АТФ выполняет в клетке роль трансформатора. Анаболизм и катаболизм неразрывно связаны, составляя единое целое, поскольку продукты энергетического обмена (АТФ и некоторые низкомолекулярные соединения) непосредственно используются в конструктивном обмене клетки (рис. 6.1). В клетках микроорганизмов соотношение между энергетическими и конструктивными процессами зависит от ряда конкретных условий, в частности, от характера питательных веществ. Тем не менее по объему катаболические реакции обычно превосходят биосинтетические процессы. Взаимосвязь и сопряженность этих двух видов метаболизма проявляется прежде всего в том, что суммарный объём конструктивных процессов полностью зависит от количества доступной энергии, получаемой в ходе энергетического обмена. 1.6.2. Конструктивный метаболизм Конструктивный метаболизм направлен на синтез четырех основных типов биополимеров: белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Ниже показана обобщенная условная схема биосинтеза сложных органических соединений, где выделены следующие основные этапы: образование из простейших неорганических веществ органических 72 предшественников (I), из которых на следующем этапе синтезируются «строительные блоки» (II). В дальнейшем строительные блоки, связываясь друг с другом ковалентными связями, образуют биополимеры (III): Представленная схема биосинтетических процессов не отражает всей сложности превращения низкомолекулярных предшественников в строительные блоки с большой молекулярной массой. На самом деле синтез протекает как серия последовательных реакций с образованием разнообразных промежуточных продуктов метаболизма. Кроме того, уровни развития биосинтетических способностей микроорганизмов очень различны. У одних микробов конструктивный метаболизм включает все показанные на схеме этапы, у других ограничен вторым и третьим или только третьим этапом. Именно поэтому микроорганизмы резко отличаются друг от друга по своим пищевым потребностям. Однако элементный состав пищи одинаков для всех живых организмов и должен включать все компоненты, входящие в клеточное вещество (смотри раздел 1.4): углерод, азот, водород, кислород и др. В зависимости от используемых в конструктивном обмене источников углерода микроорганизмы делятся на две группы: автотрофы и гетеротрофы. Автотрофы (от греч. «autos» - сам, «trophe» — пища) в качестве единственного источника углерода используют диоксид углерода и из этого 73 простого неорганического соединения-предшественника синтезируют все необходимые биополимеры. Способность к биосинтезу у автотрофов самая высокая. Гетеротрофы (от греч. «heteros» — другой) нуждаются в органических источниках углерода. Их пищевые потребности чрезвычайно разнообразны. Одни из них питаются продуктами жизнедеятельности других организмов или используют отмершие растительные и животные ткани. Такие микроорганизмы называются |