Учебное пособие, Царев. Практикум по дисциплине Основы микробиологии. Предназначено для бакалавров направления 18. 03. 02 Энерго и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии
 Скачать 2.32 Mb.
|
Лабораторная работа № 1. Реакция на белки по осаждению Приготовление раствора белка. 1. Приготовление яичного альбумина Белок куриного яйца, отделенный от желтка, взбивают и затем смешивают в колбе при встряхивании с десятикратным объемом дистиллированной воды. Раствор фильтруют через двойной слой смоченной водой марли или через один слой полотна, помещенный в воронку. Фильтрат представляет собой раствор яичного альбумина, а осадок на марле представляет собой яичный глобулин. Яичный глобулин переносят в химический стакан и растворяют в небольшом количестве 10 % раствора NaCl. Полученный раствор глобулина фильтруют, и фильтрат соединяют с половиной ранее полученного водного раствора яичного альбумина. В итоге получают два раствора: раствор чистого альбумина (раствор 1) и раствор альбумина и глобулина (раствор 2). 2. Приготовление растительного альбумина 25 г пшеничной муки смешивают со 100 мл дистиллированной воды и перемешивают полученную смесь в течение часа. Полученную взвесь муки центрифугируют, и прозрачный раствор осторожно сливают из центрифужных стаканчиков в колбу. Прозрачный раствор содержит преимущественно альбумин пшеничных зерен (раствор 3). Оборудование и реактивы: лабораторная центрифуга, воронка, фильтры, растворы белков, насыщенный раствор сернокислого аммония, хлористый 111 натрий в порошке, сернокислый магний в порошке, 1% и 10% раствор гидроксида натрия, 5% раствор сернокислой меди, 5% раствор уксуснокислого свинца. Опыт 1. Высаливание белков сернокислым аммонием Наливают в пробирку 1 –1,5 мл раствора белка (раствор 2 или раствор 3), добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и слегка встряхивают смесь до появления мути. Объясните, какой белок выпадает в осадок? Мутную жидкость фильтруют через сухой складчатый фильтр. Полученный прозрачный раствор помещают в пробирку и нагревают до кипения. Что при этом происходит? Какой белок в этом случае выпадает в осадок? Опыт 2. Высаливание белков хлористым натрием и сернокислым магнием В две пробирки наливают по 2-3 мл раствора белка (раствор 2 или раствор 3). Прибавляют при перемешивании до полного насыщения раствора, т.е. до момента, когда часть кристаллов солей перестают растворяться, в одну пробирку тонко измельченного хлористого натрия, а в другую сернокислого магния, через несколько минут в обеих пробирках появляется осадок. Объясните, какой белок переходит в нерастворимое состояние в этих опытах? Содержимое пробирок отфильтровывают и прибавляют к фильтрату несколько капель разбавленной уксусной кислоты до слабокислой реакции. Что при этом происходит? В водном растворе белков их частицы являются заряженными и сильно гидратированными. Эти факторы обуславливают устойчивость белковых растворов. Но при высокой концентрации солей происходит разрушение водных оболочек белковых молекул за счет гидратации ионов соли, т.е. 112 молекулы воды переходят из гидратной оболочки белка в гидратную оболочку соответствующих ионов и вслед за этим наступает снятие заряда с белковой молекулы в слабокислой среде адсорбирующимися на ней ионами соли, в результате этих двух процессов белковые растворы теряют устойчивость, частицы белка слипаются друг с другом и выпадают в осадок. Опыт 3. Свертывание белков при нагревании В три пробирки наливают по 2 мл растворов белка (раствор 1, раствор 2 или раствор 3) а) нагревают содержимое первой пробирки. Что при этом происходит? б) добавляют во вторую пробирку около 0,5 мл 10 % раствора уксусной кислоты и нагревают. Образуется ли осадок белка в этом случае? в) добавляют в третью пробирку около 0,5 мл 10 % раствора гидроксида натрия и нагревают. Происходят ли какие-либо изменения с раствором? Выпадение белков и осадок при нагревании (свертывание) характерно почти для всех белков (исключение составляет желатина). Особенно легко и полно происходит осаждение белков в слабокислой среде, вблизи от изоэлектрической точки. В сильно кислой среде осаждение белков идет значительно хуже, а в щелочной среде вовсе не наблюдается. Белки, как амфотерные электролиты, могут диссоциировать как кислоты и как основания. Схематично молекулу белка можно представить следующим образом: H ₂N – R – COOH. В водной среде, особенно вблизи изоэлектрической точки, молекулы белка представляют собой нейтральный, биполярный ион: H ₃N –R -COO‾. В кислой среде подавляется кислотная диссоциация белка, и молекула заряжается положительно: 113 ⁺H₃N –R- COO⁻ + H⁺ -------- ⁺H₃N – R – COOH, а в щелочной среде подавляется, основная диссоциация белка и молекулы его несут отрицательный заряд. Наличие заряда препятствует осаждению белка, поэтому в кислых и щелочных растворах белок находится в растворенном состоянии даже при его кипячении. Опыт 4. Осаждение белков солями тяжелых металлов В две пробирки наливают по 1 – 1,5 мл раствора белка (раствор 2 или 3) и медленно по каплям при встряхивании прибавляют в одну из них раствор сернокислой меди, а в другую – раствор уксуснокислого свинца. В обоих случаях образуются хлопьевидные осадки вследствие образования малорастворимого солеобразного соединения. Отметьте цвет осадков в обеих пробирках. После образования осадков добавьте в обе пробирки избыток соответствующих солей (2 – 2,5мл). Что происходит в этом случае? Соли тяжелых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb и др.) вызывают необратимое осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде соединения. Вследствие этого белки применяются в качестве противоядия при отравлении солями тяжелых металлов. Однако некоторые из таких осадков растворяются в избытке осадителя в результате пептизации осадка адсорбирующимися на его частицах ионами осадителя. Лабораторная работа № 2. Цветные реакции на белки Оборудование и реактивы: лакмусовая бумага, пробирки, растворы белков, азотно-ртутный реактив (реактив Миллона), концентрированная азотная кислота, 10 % раствор едкого натра, 1 % раствор медного купороса, 0, 1 % раствор нингидрина. Цветные реакции белков обуславливаются наличием в белковой молекуле определенных атомных группировок, образующих с 114 соответствующими реактивами окрашенные соединения. Цветные реакции дают возможность в некоторой степени судить о составе белков. Опыт 1. Реакция с азотно-ртутным реактивом (реакция Миллона) В пробирку наливают 0,5 - 1мл раствора белков и прибавляют равный объем реактива Миллона. Образуется белый осадок. Полученный осадок нагревают. Что при этом происходит? Реактив Миллона дает окрашивание почти со всеми фенолами. У белков реакция обусловлена присутствием в них аминокислоты тирозина или триптофана, содержащих в своем составе бензольные кольца, поэтому эту реакцию дают почти все белки, за исключением тех, молекулы которых не содержат этих аминокислот (например, желатина). Опыт 2. Ксантопротеиновая реакция белков К 1 мл раствора белка в пробирке добавляют 5 – 6 капель концентрированной азотной кислоты до появления белого осадка или мути от свернувшегося под действием азотной кислоты белка. Осторожно нагревают раствор и наблюдают изменение окраски осадка. Охлаждают смесь и осторожно добавляют к кислому раствору, не взбалтывая, по каплям избыток раствора щелочи до щелочной реакции. Выпадающий в начале осадок кислотного альбумината растворяется, и жидкость меняет свою окраску. Отметьте цвет образующейся жидкости. Ксантопротеиновая реакция зависит от наличия в молекулах белков остатков ароматических аминокислот, таких как фенилаланин, тирозин. Эти аминокислоты в результате нитрования образуют желтоокрашенные нитросоединения. Желатина, не содержащая ароматических аминокислот, не дает этой реакции. 115 Опыт 3. Биуретовая реакция В пробирку наливают 1 – 1,5 мл раствора белка и добавляют равный объем раствора щелочи и затем 2-3 капли разбавленного (почти бесцветного) раствора медного купороса. Отметьте, в какой цвет окрашивается жидкость в пробирке. Биуретовая реакция обусловлена наличием в молекулах белка пептидных группировок СO – NH , т.е. эту реакцию дают все белки. Этой реакцией можно установить наличие белка при растворении его 1 : 10000. Окраска возникает в результате образования комплексных соединений, содержащих медь. Свое название эта реакция получила за способность биурета, содержащего пептидную группировку NH₂ - CO – NH – CO - NH₂, вступать в эту реакцию (но биурет не является белком!). Биурет получают путем сплавления двух молекул мочевины. 116 Опыт 4. Нингидриновая реакция К 1 мл раствора белка в пробирке прибавляют 4-5 капель 0,1 % раствора нингидрина, и раствор нагревают около минуты. Отметьте цвет раствора. 117 Нингидриновая реакция характерна для α - аминокислот, поэтому она получается и с белками, содержащими в своей молекуле карбоксильные и α - аминогруппы. Восстановленный нингидрин, конденсируясь с аммиаком и окисленной молекулой нингидрида, образует раствор, который имеет фиолетово–синюю окраску. Лабораторная работа № 3. Определение аминного азота медным способом Количественное определение α-аминного азота аминокислот и пептидов наряду с другими методами можно осуществить сравнительно просто так называемым медным способом. Сущность этого метода состоит в том, что α –аминокислоты и пептиды способны образовывать комплексные растворимые соединения с ионами двухвалентной меди, которые в дальнейшем определяют изометрическим методом. Испытуемый раствор смешивают при слабощелочной реакции с избытком суспензии фосфорнокислой меди в боратном буферном растворе. Раствор хорошо перемешивают. Медь образует при этом с аминокислотами и пептидами растворимые внутрикомплексные соли. Избыток фосфата меди отфильтровывают и в полученном прозрачном растворе разлагают медные комплексные соли, действуя на них йодистым калием в кислой среде. При этом происходит восстановление меди и выделяется свободный йод, который оттитровывают тиосульфатом натрия. При этом протекают следующие реакции: I ₂ + 2 Na₂S₂O₃ → Na₂ S₄O₆ + 2NaI 118 Оборудование и реактивы: колбы мерные по 25 мл - 2 штуки, пипетки на 2 мл – 1 шт., на 10 мл – 3 шт., бюретка на 20 – 50 мл, воронка для фильтрования, фильтры, конические колбы на 50 мл – 2 шт., раствор хлорной меди (27,3 г в 1 л раствора), трехзамещенный фосфат натрия (68,5 г (Na ₃PO₄⋅12 H₂O) в 1 л раствора), боратный буферный раствор (28,6 г буры растворяют в 750 мл воды, добавляют 50 мл 1 н. раствора HCl и добавляют водой до 1 л), суспензия фосфорнокислой меди (смешивают один объем хлорной меди с двумя объемами трехзамещенного фосфата натрия и приливают два объема боратного буфера), тимолфталеин (0,25 г тимолфталеина в 100 мл 50% этилового спирта), 0,1н раствор тиосульфата натрия (Na₂S₂O₃ ⋅ 5 H₂O), 1% раствор крахмала, раствор иодистого калия (10г в 100 мл раствора), концентрированная уксусная кислота, 0,5н раствор гидроксида натрия, 1% раствор глицина. Порядок выполнения работы В мерную колбу на 25 мл берут 2 мл исследуемого раствора (1% раствор глицина). Добавляют 2 капли фенолфталеина и по каплям прибавляют раствор едкого натра до слаборозового окрашивания, (т.е. доводят рН раствора до 10,2). После этого добавляют 10 мл суспензии фосфата меди и хорошо перемешивают. Если вся суспензия фосфата меди входит в реакцию (на что указывает отсутствие осадка – избытка фосфата меди), следует добавить еще 5 мл суспензии. Колбу доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают многократным переворачиванием колбы и отфильтровывают избыток фосфата меди через плотный фильтр. Фильтрат должен быть совершенно прозрачным. Из фильтрата берут две пробы по 10 мл в конические колбы для титрования, подкисляют 0,5 мл концентрированной уксусной кислоты, добавляют 5 мл раствора йодистого калия и выделившийся йод титруют 0,01 н. раствором тиосульфата натрия. Крахмал добавляют в тот момент, когда раствор примет соломенно-желтую окраску, в количестве 0,1 –0,2 мл (2 - 4 капли). 119 Титрование продолжают до исчезновения появившейся синей окраски. По окончании процесса титрования отмечают количество мл тиосульфата натрия, пошедшего на титрование 10 мл пробы. Необходимо также проделать холостой опыт, в котором вместо раствора глицина берется такой же объем дистиллированной воды и все остальные операции проводятся также, как и в случае раствора аминокислоты. Если на титрование холостого опыта затрачивается какое-то количество мл тиосульфата натрия, то это его количество вычитают из найденного для опытного раствора. По уравнению реакции 1 атом выделившегося йода соответствует 1 атому меди, а атом меди соответствует 2 атомам или 28 г аминного азота. С другой стороны, 1 атом йода реагирует с другим эквивалентом тиосульфата натрия, следовательно, 1 эквивалент тиосульфата натрия соответствует 28 г аминного азота. Отсюда, 1 мл 0,01 н. раствора тиосульфата натрия отвечает 0,28 мг аминного азота. Умножением величины 0,28 мг на затраченный объем 0,01 н. раствора тиосульфата натрия получают количество мг аминного азота во взятом объеме пробы (10 мл), после этого делают перерасчет на весь объем раствора в колбе (25 мл) и сравнивают найденное количество аминного азота с теоретическим количеством содержащимся в 2 мл исследуемого раствора глицина. Расчетно-графические задания 1. Приведите все возможные взаимодействия, которые поддерживают третичную структуру белка при взаимодействии фрагментов полипептидной цепи: -глу-вал-лей-цис-тир- -арг-фен-ала-цис-гис- 2. Напишите уравнения реакций взаимодействия глицина: а) с гидроксидом натрия; б) с хлороводородной кислотой; в) с гидроксидом меди (II). 120 валина: а) с этиловым спиртом; б) с пентахлоридом фосфора. 3. Напишите уравнения реакций согласно схеме и назовите продукты реакций: Охарактеризуйте вещества А и Б и их биологическое значение. ТЕМА 2. ФЕРМЕНТЫ Лабораторная работа № 4. Действие ферментов Оборудование и реактивы: мерный цилиндр на 25 мл, химические стаканы, воронки для фильтрования, вата, пробирки, водяная баня, термометры до 100˚С, сосуд со льдом, пластинки стеклянные, стеклянные палочки, ступка с пестиком, раствор крахмального клейстера, 1 % раствор йода в йодистом калии, дрожжи, 1 % раствор сахарозы. Опыт 1. Приготовление разбавленной слюны Ополаскивают рот 2 –3 раза дистиллированной водой, чтобы удалить остатки пищи. Затем отмеряют цилиндром 20 мл дистиллированной воды, сливают в стакан и ополаскивают этой водой рот в течение 1 –2 мин, выливают жидкость в другой стакан. Эту операцию повторяют 2 –3 раза. Собранную жидкость (примерно 50 –60 мл) фильтруют через вату, и прозрачный фильтрат употребляют для проведения следующих опытов. 121 Опыт 2. Гидролиз крахмала под действием амилазы слюны В две пробирки наливают по 5 мл крахмального клейстера и в одну из них 5 мл воды, а в другую 5 мл раствора слюны. Обе пробирки одновременно помещают в водяную баню, в которой поддерживают температуру 40˚С. В каждую пробирку помещают стеклянную палочку. Наблюдение за ходом гидролиза осуществляют с помощью йодной реакции. Для этого наносят на стеклянную пластинку, положенную на лист белой бумаги, несколько капель раствора йода в йодистом калии и смешивают их с каплями гидролизуемой смеси из пробирок, где идет гидролиз. Через 1 мин с момента нагревания пробирок в водяной бане от каждой смеси отбирают, с помощью стеклянной палочки по капле жидкости и смешивают ее с каплей раствора йода на стекле. Повторяют подобное исследование через 2, 4, 6, и 8 минут. После 10 минут выдержки смеси в водяной бане к оставшейся в каждой пробирке жидкости добавьте 1 –2 мл Фелинговой жидкости и нагрейте. Что происходит при этом в пробирках? Объясните результаты наблюдений. Опыт 3. Влияние температуры на активность амилазы слюны В три пробирки А, В, и С наливают по 5 мл разбавленной слюны. Пробирку А помещают в сосуд со льдом, пробирку В оставляют при комнатной температуре, которую отмечают по термометру, а пробирку С помещают на водяную баню при температуре 40˚С. Через 5 мин во все три пробирки добавляют по 5 мл раствора крахмала. С помощью стеклянных палочек одновременно берут пробы из пробирок А, В и С и смешивают их с каплями йода в йодистом калии, нанесенными на стеклянной пластинке. Отмечают окраску проб жидкостей из каждой пробирки. Пробы берут через каждые 2 минуты до тех пор, пока жидкость из какой-либо пробирки уже не будет изменять желтой окраске йода, что свидетельствует об окончании процесса гидролиза в данной пробирке. 122 Ход гидролиза крахмала отмечают в таблице по окраске с йодом различных проб: Состав пробы Время, мин 0 2 4 6 8 10 12 А (крахмал + слюна при 0˚С) В (крахмал + слюна) С (крахмал + слюна при 40˚С) В заключении следует сделать выводы об оптимальной температуре для действия фермента и относительной скорости гидролиза при различных температурах. Опыт 4. Действие сахарозы 5 г дрожжей растереть в фарфоровой ступке с 2 –3 мл воды и небольшим количеством речного песка. К тщательно растертой массе добавить около 40 мл дистиллированной воды, хорошо перемешать и полученный раствор профильтровывать через вату. В две пробирки налить по 2 мл приготовленной вытяжки и добавить в каждую по 5 мл воды. Содержимое одной из пробирок нагреть до кипения и охладить. Затем в обе пробирки внести по 5 мл 1% раствора сахарозы и оставить на 10 минут. По истечении времени исследовать содержимое каждой пробирки на способность восстанавливать реактив Фелинга. Для этого к 4 мл реактива Фелинга в пробирке добавить 2 мл исследуемого раствора и смесь довести до кипения. Опишите результаты опыта и объясните их. Расчетно-графические задания 1. Приведите возможные уравнения реакций, которые иллюстрируют каталитическое влияние липазы, фосфатазы, гидролазы, синтетазы, карбон-нитроген-лигазы, карбон-оксиген-лигазы. 2. Напишите уравнения реакций (с использованием структурных формул субстратов) и определите класс ферментов, которые участвуют в следующих превращениях: 123 1) аденозин + Н 2 О → аденин + рибоза 2) АМФ + Н 2 О → аденозин + Н 3 РО 4 3) аденозин + H 3 PO 4 → аденин + β-D-рибофуранозо- 1 -фосфат 4) глутаминовая кислота +NH 3 + АТФ → глютамин + АДФ + Н 3 РО 4 5) фумаровая кислота + NH 3 → аспарагиновая кислота 6) аденозин + Н 2 О → инозит +NH 3 7) глутаминовая кислота → γ-аминомасляная кислота 8) NH 3 + СО 2 + АТФ → АДФ + карбамоилфосфат 9) ПВК → СО 2 ацетальдегид 10) ПВК + СО, + АТФ → ЩОК + АДФ + Н 3 РО 4 11) ацетил -КоА + глиоксиловая кислота → малатоил-КоА 12) стеариновая кислота + HS-KoA + АТФ →стеарил-КоА +АМФ + пирофосфат |