Цитология методичка 1-15 сабак. Саба 1 Апаратты дидактикалы топтама
 Скачать 1.99 Mb.
|
|
Сабақ 15 Молекулалық генетикалық әдістер зерттелінетін ДНҚ молекуласының нақтылы учаскесінің (аллель, ген) құрылымының ерекшеліктерін анықтауға бағытталған зерттеу әдістері болып табылады. Бұл әдістер ДНҚ және РНҚ молекулаларын тәжірибелік зерттеулерге негізделінеді. Қазіргі кезде молекулалық биология, генетика жетістіктері, адам геномын зерттеулер, молекулалық генетикалық әдістерін медицина практикасында кеңінен қолдануға мүмкіндік туғызды. ДНҚ (РНҚ) үлгісін алу жасушадағы ДНҚ молекуласын бөліп алу не полимеразалық тізбектік реакция (ПТР) арқылы жинақтау. ДНҚ молекуласын кез келген ядролы жасушалардан бөліп алуға болады. Ол ағзаның біртұтас геномы болғандықтан оны геномдық ДНҚ деп атайды. Әдетте, ДНҚ молекуласын лейкоциттерден, хорион жасушаларынан, амнион сұйықтығының жасушаларынан, фибробласт культурасынан бөліп алады.Бір рет талдау жасау үшін бірнеше нанограммнан бірнеше микрограмммға дейін ДНҚ қажет. Ол үшін 20-40 мг. хорион, 1мл қан, 5-10мг қолдан өсірілген жасушалар қажет. Ауруларды дұрыс анықтау не гетерозиготалық күйін анықтау үшін геномның кішкентай фрагментін зерттеудің өзі жеткілікті, тек осындай фрагменттерді жеткілікті мөлшерде көшірмелеп көбейту (амплификация) қадет. Бұрын бұл процесс бірнеше саты арқылы жүргізілетін: рекомбинантты плазмида құрастыру, оны бактерия жасушасына енгізу, бактерияны көбейту, ДНҚ фрагменттерін бөліп алу. Қазіргі уақытта қажетті ДНҚ фрагментін полимеразалық тізбектік (ПТР) реакция арқылы жеп жеңіл жүзеге асады. Бұл реакцияны америка ғалымы К. Мюллис ашты. ПТР ДНҚ ны амплификациялау, яғни көшірмелерін көбейту. Бірнеше сағат ішінде ДНҚ ның кез келген бөлшектерін (бір генге дейін) миллиондаған дана күйінде көбейтуге мүмкіндік береді. ПТР жүргізу үшін көбейтілетін ДНҚ фрагментінің нуклеотидтер бірізділігін күні бұрын білу қажет. Зерттелінетін ДНҚ учаскесіеің 5 және 3 ұштарының нуклеотидтер бірізділігіне сәйкес 20-30 нуклеотидтен тұратын екі олигонуклеотидтік праймерлер (РНҚ ұйытқы) синтезделінеді. ДНҚ фрагментін амплификациялау процессі қайталанатын циклдардан тұрады: жылылықпен әсер етіп (94С) ДНҚ молекуласын жеке тізбектерге ыдырату (данатурациялау); бір тізбекті ДНҚның негіздеріне комплиментарлы праймерлерді байланыстыру (37С-68С); ДНҚ полмераза ферментінің қатынасуымен жаңа ДНҚ тізбегін синтездеу (72 С) ДНҚ молекуласын фрагменттерге бөлшектеу (рестрикциялау) рестриктазалар арқылы ДНҚ молекуласын ұзынды қысқалы фрагментерге кесу. Рестриктаза қос тізбекті ДНҚ молекуласының 4-6 жұп нуклеотидтер бірізділігін танып кеседі де, фрагменттерге бөлшектейді. ДНқ фрагменттерінің электрофарезі рестриктазалар арқылы кесілген фрагменттер агрозды не полиакриламидті гель бетінде өлшемдеріне қарай түрліше таралып үлестіріледі, яғни молекула массасы үлкен фрагменттер тез қозғалады. Электрофорез аяқталған соң ДНҚ фрагменттері гель бетіне әртүрлі орындарда орналасады. ПТР дан кейін ДНҚ фрагменттерін визуальді зерттейді, ол үшін агроздық гелде электрофорез жүргізеді. Содан кейін гельді этидий бромидимен өңдейді. Этидий бромиди ДНҚ мен байланысып, гель бетін ультракүлгін сәулесімен сәулелегенде, спектрдің қызыл учаскесінде жарқырау байқалады. Сол жарқыраулар зерттеуге қажет ДНҚ фрагменті болып табылады. Адам геномы үлкен болғандықтан рестрикция нәтижесінде көптеген рестрикция фрагменттері түзіледі және оны электрофорезден кейін оларды этидий бромидимен бояғанда ультракүлгін спектрінде ДНҚ фракцияларының бәрі біркелкі боялады. Сондықтан, ДНҚ ның ерекше фрагменттерін бөліп алып зерттеу Саузерннің блот гибридтеу әдісі арқылы жүргізіледі. Бұл әдіс мына кезеңдерден тұрады. Электрофорезден кейін гельді сілті ерітіндіге енгізеді, бұл кезде қос тізбекті ДНҚ молекуласы бір тізбекті болып ыдырайды ДНҚ фрагменттерін буферлік ерітінді көмегімен нитроцеллюлозалы не нейтронды фильтрге ауыстыру. Ол үшін гель бетін фильтрмен және бір бума фильтрлеуші қағаздармен жабады. Капиллярлық эффект нәтижесінде гель бетіне перпендикуляр буферлік ерітінді ағыны пайда болады. Гельден бөлініп шыққан ДНҚ фрагменттерінің бәрі фильтрде ұсталынып қалады. ДНҚ фрагменттерінің фильтрде орналасу реті олардың гельдегі орналасуына дәлме дәл болады. Қажет фрагменттерді визуальді табу үшін ДНҚ фрагменттерін радионуклид не флюроценттік таңбамен таңбаланған синтетикалық олигонуклеотидтік зонд бірізділігімен гибридтейді. Әрбір зонд 16-30 жұп негіздерден тұрады. Зонд нуклеотидтерінің бірізділігі зерттелуші геномдық ДНҚ фрагментімен толық не ішінара комплиментарлы болуы қажет. Таңбаланған зонды бар ерітіндімен фильтрді әрекеттестіргенде ДНҚ фрагменттерімен ДНҚ зонд тізбектері комплиментарлы будандасады.. Радиоактивтік таңбамен таңбаланған будан учаскелерін рентгенмен зерттегенде (ауторадиография) зерттелуші ДНҚ фрагменттері айқын байқалады ДНҚ диагностикасының тура және көлденең әдісі. ДНқ диагностика әдістерін ауру диагнозын растау үшін, ауру симптомдары клиникалық байқалғанға дейін, туылғанға дейін құрсақтағы бала ауруларын анықтау үшін жүргізіледі. Моногендік тұқым қуалайтын тура және көлденең ДНҚ диагностика деп аталатын әдістері бар. Тура ДНҚ диагностика әдістерін ауру гені клонданған, оның экзон интрондық құрылымы белгілі болған жағдайда жүргізіледі. Егер ауру гені клоданбаған болса, не ауру генетикалық гетерогенді күйде болатын болса, тура ДНҚ диагностика әдістерін қолдануға болмайды. Бұл жағдайда көлденең ДНҚ диагностика әдістері қолданылады. Мутацияларды диагностикалаудың тура әдістері. Қазіргі кезде ДНҚ диагностикасының екі әдісі қолданылады: белгілі мутацияларды детекциялау; мутациялық скрининг әдістері. Белгілі мутациялрды детекциялау, егер мутация белгілі болса, онда оларды фермент рестриктаза арқылы кесіп рестрикциялық талдау не ДНҚ будандастыру арқылы табуға болады. Мутациялық скрининг әдісі егер мутация сипаты белгісіз бірақ аурудың клиникалық көрінісі қандай генде мутация пайда болғанын болжамдауға мүмкіндік беретін болғанда жүргізілетін әдіс. Олардың түрлері: саузерн блот гибридизация арқылы қайтақұрылымды талдау; бір тізбекті ДНҚ молекуласының конформация полиморфизмін талдау; денатурант градиентінде қос тізбекті ДНҚ электрофорезі; гетеродуплексті талдау Мутацияларды талдаудың ақырғы кезеңі оларды секвендеу болып табылады, яғни электрофорезде аномальді қозғалатын ДНҚ фрагментінің нуклеотидтер бірізділігін анықтау. Осы фрагменттің нуклеотидтер бірізділіг қалыпты фрагментпен салыстырып, патологиялық сипатын анықтайды. Секвендеу ДНҚ молекуласының не оның бір фрагментінің нуклеотидтік бірізділігін анықтау, екі әдісі белгілі Максам Гилберт және Сангер. Максам Гильберт химиялық жолмен ДНҚ молекуласын бір бірлеп нуклеотидтерге ыдыратуға негізделген, әрі өте ұзаққа созылатын қымбат әдіс. Сангер әдісі қарапайым және арзан, сондықтан оны жиі қолданады. Бұл әдіс зерттелуші ДНҚ тізбегінің синтезін белгілі бір азоттық негізге жеткенде дидезоксинуклеотидті енгізу арқылы тоқтатуға негізделінеді. |