лекция. Технология это наука о развитии естественных процессов в искусственных условиях. Биотехнология

• Название: Технология это наука о развитии естественных процессов в искусственных условиях. Биотехнология
• Анкор: лекция
• Дата: 27.11.2021
• Размер: 440.42 Kb.
• Имя файла: 1.docx
• Тип: Документы; #283901

Тема1.1. Современная биотехнология в создании и производстве лекарственных средств. Слагаемые биотехнологического процесса. Структура биотехнологического процесса.

Технология – это наука о развитии естественных процессов в искусственных условиях.

Биотехнология(от греч. вios– жизнь, teken – искусство, мастерство, logos – наука, умение, мастерство) – это получение продуктов из биологических объектов или с применением биологических объектов.

В настоящее время как минимум третья часть ЛС от общего объема производимых лекарств производится с помощью биотехнологии.

Биообъект – это продуцент, синтезирующий нужный продукт, либо фермент, который катализирует определенную реакцию. Фермент иммобилизируется (закрепляется) на нерастворимом носителе, что позволяет его использовать многократно.

Примеры биообъектов:

•        Человек.

С помощью человека-донора производят гомологичную иммунную плазму (антистафилококковую, противокоревую, эритроцитарную и лейкоцитарную массу для трансфузий и так далее).

В настоящее время в промышленном масштабе освоено выращивание лимфобластов человека, продуцирующих интерфероны.

•        животное

Корова и як являются донорами

поджелудочной железы – для производства инсулина и панкреатина (пищеварительные ферменты – амилаза, липаза, протеаза)

паращитовидной железы – паратиреоидин

гипофиз – тиреотропин (на щитовидную железу)

хрящи – румалон

Свинья является донором слизистой желудка для производства пепсина и поджелудочной железы – для производства инсулина.

Марал (изюбр, пятнистый олень) является донором пантов, из которых получают пантокрин.

•        растения. Например, почки и однолетние побеги тополя представляют сырье при изготовлении простагландинов, смола сосны – для получения скипидара, смола пихты – это сырье для бальзамов.

•        прокариоты (сине-зеленые водоросли, бактерии, актиномицеты). Используются в производстве витаминов, антибиотиков.

•        вирусы, бактериофаги

•        эукариоты, которые являются микрообъектами (простейшие, водоросли, грибы, плесени, дрожжи). Например, использование клеток плесени при производстве антибиотиков, а клеток дрожжей – при производстве эргостерина (предшественника витамина D), бетакаротина (предшественника витамина А).

•        культуры клеток растений и животных.

1.                 биообъекты растительного происхождения, используемых для получения культур клеток, таких как каллусные(выращивание клеток на твердой поверхности) и суспензионные культуры (выращиваемые в жидких средах).

Можно привести пример такого растения как женьшень при извлечении из него панаксозидов (тритерпеновые сапонины), как биологически активного вещества:

• в дикорастущем виде сбор может производится только на шестидесятом году его роста;

• в условиях его выращивания на плантациях – на шестом году;

• в каллусной культуре клеток растительной ткани панаксозиды можно извлекать уже на 15-25-тый день роста культуры ткани.

2.                 Новые технологии получения лекарственных средств используются и на основе клеток животных организмов. Например, на культуре клеток почек зеленых мартышек (обезьян) и фибробластов (донорская кровь) человека усовершенствовано производство осповакцины и вакцины против полиомиелита.

Успешно работает сегодня и технология получения интерферона, основанная на культивировании лейкоцитов человека из донорской крови.

ИСТОРИЯ БТ

В истории развития биотехнологии можно выделить три основных периода:

1.     эмпирическая биотехнология (доисторическая) – самый  длительный, охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 тысяч лет – до нашей эры и около 2000 лет – нашей эры.

Самый первый биотехнологический процесс, осуществленный человеком – получение пива, был изобретен шумерами (около 5 тысяч лет назад).

Человек использовал биотехнологию на протяжении многих тысяч лет: люди занимались пивоварением, пекли хлеб, придумали способы хранения и переработки продуктов путем ферментации (производство сыра, уксуса, соевого соуса), научились делать мыло из жиров, изготавливать простейшие лекарства и перерабатывать отходы. 

2.     научная биотехнология (этиологический период) (1856 – 1933 гг.)

Он связан с исследования Луи Пастера – основателя научной микробиологии.

1856г – Луи Пастер выдвинута теория, согласно которой за процесс брожения отвечают микроорганизмы.

Пастер доказал возможность жизни в бескислородных условиях, экспериментально опроверг ходившее тогда представление о самопроизвольном зарождении живых существ, создал научные основы вакцинопрофилактики и вакцинотерапии, предложил метод стерилизации – пастеризацию и т.д.

В этот период удалось доказать индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах. Каждый вид мог быть размножен на питательных средах и использован в целях воспроизведения соответствующих процессов (бродильных, окислительных и др.).

Было начато изготовление пищевых прессованных дрожжей, а также некоторых продуктов обмена ацетона, бутанола, лимонной и молочной кислот.

Во Франции приступили к созданию биоустановок для микробиологической очистки сточных вод.

3.     биотехнический период (начался в 1933 г. и длился до 1972 г.) –

В 1933 г. Клюйвер и Перкин опубликовали работу «Методы изучения обмен веществ у плесневых грибов», в которой изложили основные технические приемы, а также подходы к оценке получаемых результатов при глубинном культивировании грибов.

Началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, обеспечивающего проведение процессов в стерильных условиях.

Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (время второй мировой войны 1939-1945 гг., когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с инфицированными ранами).

1953г – Уотсон и Крик – расшифровка пространственной структуры ДНК.

4.     Геннотехнический период (от греч. genesis – происхождение, возникновение, рождение) начался с 1972г., когда П. Берг создал первую рекомбинантную ДНК.

В течение последних 10 - 15 лет происходит бурное развитие биотехнологии, выделены основные направления и разделы биотехнологии: медицинская биотехнология, иммунобиотехнология, биогеотехнология, инженерная энзимология, биоэнерготехнология, космическая биотехнология и др.

Биотехнологические продукты можно разделить на три категории:

1. природные – вырабатываемые собственно микроорганизмами (антибиотики);

2. второго поколения – полученные с помощью генноинженерных штаммов (человеческий инсулин);

3. третьего поколения – продукция XXI века, основана на изучении взаимодействия БАВ и рецепторов клеток и создании принципиально новых препаратов. Примером таких препаратов могут быть антисмысловые нуклеиновые кислоты. Используя принцип комплементарности можно создать цепь нуклеиновых кислот, которые могут выключать тот или иной ген, что позволяет с помощью антисмысловых нуклеиновых кислот управлять генами, корректируя обмен.

Например – короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс

По выпуску биотехнологической продукции: США, Япония, Израиль.
Биосинтез БАВ (биологически активные вещества) в условиях производства.

Создание стерильных условий для биосинтеза

Биосинтез микроорганизмов осуществляется в ферментерах различной емкости от 100 литров (1м³) до 10000 литров (100м³). Это многостадийный процесс.

Для успешного осуществления биосинтеза необходимо использовать

•        стерильное оборудование

•        стерильную питательную среду – термическим способом прямо в ферментере или в отдельной емкости.

•        стерильный воздух – фильтрацией, т.е. из воздушного потока удаляют микроорганизмы с помощью фильтров. Воздух стерилизуют только фильтрацией, пропуская его через систему фильтров, другие способы (УФ, термические) не подходят, так как нужно стерилизовать очень большие объемы воздуха.

Биосинтез осуществляется с использованием жидкой питательной среды, т.е. используется глубинное культивирование.

Способы хранения продуцента:

•        под слоем минерального масла

•        замораживание

•        в лиофилизированном состоянии (высушивание под вакуумом)

•        частый пересев

•        в сыпучих материалах

•        криозамораживание (-176⁰)

•        на скошенном агаре

Далее продуцент переносится в колбы с жидкой питательной средой. После накопления биомассы и проверки культуры на чистоту 0,5-1% посевного материала переносится в инокулятор. В нем происходит рост и деление микроорганизмов. Из инокулятора 2-3% материала переносится в посевной аппарат. Из посевного аппарата 5-10% посевного материала переносится в ферментер.

Ферментер – это аппарат для проведения ферментации.



Обвязка ферментера - все основные рабочие узлы этого аппарата:

•        мешалка, для равномерного распределения всех продуктов среды,

•        тепловая рубашка для обогрева,

•        отбойники, препятствующие образованию «мертвых зон», то есть недоступных зон для регулирования ферментационного процесса,

•        слив для культуральной жидкости для последующего выделения целевого продукта,

•        барботер с воздухом для аэрации процесса ферментации (устройство для пропускания через слой жидкости пузырьков газа или пара)

•        клапаны для входа и выхода воздуха,

•        входное отверстие для загрузки ферментера.

Параметры, влияющие на биосинтез (физически, химические, биологические)

1. Температура

- бактерии – 28°

-актиномицеты – 26-28°

-грибы -- 24°

2. Число оборотов мешалки (для каждого м/о разное число оборотов, разные 2х, 3х, 5-ти ярусные мешалки).

3. Расход подаваемого на аэрацию воздуха.

Аэрация – это процесс механического введения атмосферного воздуха в жидкие культуры микроорганизмов для усиленного снабжения их кислородом. При росте в жидких средах потребность микробов в кислороде удовлетворяется сначала за счет кислорода, растворенного в питательной среде, а затем, по мере его использования, за счет кислорода, поступающего из атмосферы. В связи с малой растворимостью кислорода размножение м/о прекращается вследствие дефицита кислорода еще при наличии в среде питательных веществ. Для обеспечения дальнейшего размножения микроорганизмов рекомендуется аэрация (продуванием стерильного воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием).

4. Давление в ферментере

5. рН среды

6. Парциальное давление растворенного в воде кислорода (количество кислорода)

7. Концентрация углекислого газа при выходе из ферментера

8. Биохимические показатели (потребление питательных веществ)

9. Морфологические показатели (цитологические) развития клеток м/о, т.е. надо следить в процессе биосинтеза за развитием м/о

10. Наличие посторонней микрофлоры

11. Определение в процессе ферментации биологической активности

Для проведения ферментации необходимо добавлять пеногасители – жиры (рыбий жир, синтетические жиры). В процессе ферментации в результате метаболизма м/о образуется пена.

Виды процессов биосинтеза.

1. Периодический процесс – в ферментер подается посевной материал, задаются определенные технологические параметры (температура, рН, обороты мешалки) и процесс проходит самостоятельно с образованием целевого продукта. Экономически не выгоден, т.к. образуется мало целевого продукта.

2. Полупериодический процесс (регулируемая ферментация) – в процессе ферментации в ферментер добавляются различные питательные вещества, регулируется рН, в определенный момент добавляется предшественник. Является экономически выгодным, имея большой выход продукции.

3. Непрерывный процесс. Из ферментера в процессе биосинтеза берется определенное количество культуральной жидкости и вносится в другой ферментер, в котором тоже начинается биосинтез. Культуральная жидкость выполняет функции посевного материала. В ферментер, из которого взяли часть культуральной жидкости, добавляется такое же количество воды и процесс биосинтеза в нем продолжается. Эта операция постоянно повторяется. Преимущество – сокращается стадия выращивания посевного материала.

4. Многоциклический процесс

заключается в том, что в конце ферментации 90% культуральной жидкости сливается из ферментера, а оставшаяся часть выполняет роль посевного материала.

Кривая роста микроорганизмов при полупериодическом, регулируемом режиме культивирования

В процессе роста культуры можно выделить 5 фаз:

1. Лаг-фаза (фаза приспособления, адаптации). В этой фазе нет деления и роста микроорганизмов, но есть увеличение количества белков, как ответная реакция на новые условия их существования. Затем – фаза ускоренного роста (переходная фаза). В этой фазе повышается содержание белков, РНК, нуклеиновых кислот, происходит уже деление клетки.

2. Логарифмическая фазой роста (экспоненциальная кривая), когда компонентов питания достаточно и биообъект полностью адаптирован к условиям в ферментере. Идет аэрация.

3. Фаза замедленного роста клеток. В этой фазе число клеток сокращается, так как и число делений сокращается. Уменьшается скорость роста микроорганизмов, так как по мере наращивания биомассы уменьшаются компоненты питательной среды. Клетки лизируются, происходит автолиз клетки и они начинают уничтожать своих соседей (одни клетки съедают другие).

4. Фаза стационарная, когда количество живых клеток сохраняется за счет умерших и не происходит роста биомассы.

5. Фаза гибели клеток, когда число погибших клеток больше, чем живых.

Можно использовать несколько источников питания, но добавление это делать в логарифмической фазе роста клеток. Если ферментационная среда не очень отличается от посевной среды, то обычно берут 5-10% питательной среды во избежание появления слишком большого количества метаболитов – отработанных веществ, засоряющих эту среду.

С увеличением сложности организации биологических объектов возрастает время ферментации:

Ферментация грибов – до 7 суток при 24°С

Ферментация актиномицетов – до 5 дней при 26-28°С

Подготовительные операции для синтеза

Ферментация бактерий – 1-2 суток при 28°С.Начало формы



Способы предупреждения попадания продуцента в окружающую среду.

После использования культуральной жидкости ее стерилизуют и только после этого смешивают со сточными водами.

В геноме многих продуцентов имеется дополнительная потребность в азоте и они могут размножаться только на хороших питательных средах, поэтому при выходе из ферментера они уже размножаться не могут.

Продуцент делают капризным, то есть зависимым от какого либо вещества питательной среды, без которого он размножаться не может (например, это может быть также какая-либо витаминная добавка).

Конец формы