Тиманюк, Животова. Биофизика. Учебник для студентов фармацевтических и медицинских вузов удк 577. 3(075. 8) Ббк 28. 901я73 т 41
 Скачать 4.28 Mb.
|
|
а — стоксовая; б — антистоксовая линии 0 — основной уровень ? i — колебательный уровень — промежуточный электронный уровень молекулы; Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств поглощенного. Этот процесс приводит к появлению антистоксо- вой линии с частотой ? + ? i (рис. 18.3.2, б). Таким образом, фотон с энергией h ? исчезает и рождается фотон с энергией h( ? ± ? i ), а в спектре рассеянного света появляются новые линии, сопровождающие линию основной частоты сателлиты (рис. Красные сателлиты появляются со стороны меньших частот ( ? ? ? i ), фиолетовые со стороны больших+ Если имеется ряд собственных частот ? 1 , ? 2 , ? 3 , … колебаний молекулы, тов спектре рассеянного света должны появиться все комбинационные частоты ± ? 1 , ? ± ? 2 , ? ± ? 3 , … Частоты рассеянного излучения зависят от частоты падающего света, но разность между этими частотами является характеристикой веществ и не зависит от частоты возбуждающего излучения. Обычно частоты в спектре КРС соответствуют частотам колебательных и колебательно-вращательных движений в молекуле см, то есть лежат в ИК-диапазоне. Сопоставление спектров ИК и КРС показывает, что целый ряд спектральных линий совпадает (проявляются одни и те же частоты колебаний вещества, то есть спектры ИК и КРС дополняют друг друга. Но спектроскопия КРС имеет большие преимущества по сравнению с ИК-спектроскопией. Во-первых, те же измерения как бы переносят в видимую область, что приводит к упрощению измерительной аппаратуры. Те частоты, которые непосредственно измерялись в ИК-спектре, определяются между основной и сателлитными линиями примерно стой же точностью. Рассмотрим различие между процессами поглощения и рассеяния волн молекулами. В обоих случаях молекула испускает элементарные волны и ведет себя как диполь. Однако в первом случае молекула является диполем в отсутствие внешнего поля, во втором — молекула ведет себя как диполь под действием поля (см. § 18.2) падающей волны. Итак, излучение или поглощение имеет место тогда, когда изменение состояния молекулы сопровождается изменением собственного дипольного момента. Рассеяние возможно при условии, что изменения состояния молекулы сопровождаются изменениями индуцированного дипольного момента, то есть изменением поляризуемости. В связи с этим спектры КРС являются более стабильными, с одной стороны, Рис. 18.3.3. Линии в спектре КРС: 1 — красные сателлиты 2 — линия основной частоты фиолетовые сателлиты 18.3. Спектроскопия комбинационного рассеяния света ас другой — активными при тех частотах, при которых ИК-спектр не проявляется, и наоборот. Для примера рассмотрим молекулу СО. Из трех колебаний этой молекулы валентное симметричное колебание оставляет дипольный момент неизменно равным нулю. Это колебание неактивно в ИК-спектре. В спектре КР, напротив, активным будет только данное колебание, а два других не проявляются. Наконец, существенным преимуществом спектроскопии КРС является то, что ее экспериментальные возможности не зависят от диапазона частот исследуемой полосы, в то время как в ИК-спек- трах разрешение спектральных линий значительно уменьшается с уменьшением частоты. Для идентификации полученного вещества его спектр сравнивают со спектром соединения, которое предполагалось синтезировать. Чем больше полос в спектре такого соединения, тем надежнее идентификация. При анализе молекулярного спектра КРС на наличие или отсутствие в исследуемой молекуле различных функциональных групп полезны следующие обобщения в области частот выше 2500 см почти все основные полосы соответствуют валентным колебаниям водородных связей (О –Н, Н, Ни др интервал 2500—2000 см характерен для частот валентных колебаний молекул стройными связями (например Св области 2000—1600 см находятся частоты валентных колебаний молекул с двойными связями (С =С, Си деформационных колебаний групп ОН, С–Н, Н область ниже 1600 см можно использовать для идентификации многих органических соединений, поскольку в спектрах весьма близких веществ, снятых в этой области, наблюдаются заметные различия, и полосы поглощения данной функциональной группы различных соединений характеризуются разными частотами в зависимости от скелета моле- кулы. К недостаткам спектроскопии КРС следует отнести малую интенсивность линий, зависящую от частоты возбуждающегося света, а также наличие сплошного фона ввиду рассеяния на неоднородностях среды и возможности флуоресценции исследуемого вещества. Это приводит к повышению требований к возможностям регистрационной аппаратуры. Техника спектроскопии КРС. С помощью анализа спектров КРС исследуют твердые (в виде спрессованных таблеток, суспензий и порошков, предпочтительнее крупнокристаллических) и газообразные вещества, жидкости и растворы. Для наблюдения спектров КРС необходимо сконцентрировать интенсивный пучок света на изучаемом объекте. В качестве источ- Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств 561 ника возбуждающего света применяется ртутная лампа, а в последнее время, чаще,— лазеры. Рассеянный свет фокусируется и регистрируется фотографическим или фотоэлектрическим методом (рис. Подругой схеме образец облучают монохроматическим пучком света и измеряют интенсивность света, рассеянного под прямым углом к направлению падающего света. В качестве ячейки для образцов может служить, например, капилляр. Осложняющими факторами могут быть как поглощение монохроматического света, приводящее к деструкции образца, таки флуоресценция. Эти трудности сводятся до минимума путем выбора подходящей линии газового лазера. Благодаря применению лазеров в качестве источников возбуждающего света значительно расширился круг объектов, доступных для исследования методами КРС. Кроме того, применение лазеров резко сократило требования к количеству исследуемого вещества 18.4. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА Ядерным магнитным резонансом (ЯМР) называется избирательное (резонансное) поглощение электромагнитных волн радиочастотного диапазона спиновой ядерной системой вещества в сильном постоянном магнитном поле, обусловленное переориентацией магнитных моментов ядер. В зависимости оттого, в каких магнитных системах изучаются энергетические переходы, индуцируемые переменным магнитным полем, различают ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и электронный парамагнитный резонанс (ЭПР. Оба эти метода используются для анализа веществ, однако для химика-органика наиболее информативным методом является ЯМР-спектроскопия, с помощью которой можно не только выяснять электронное окружение ядерно и определять относительное количество ядер, принимающих участие в формировании сигнала ЯМР. Рис. 18.3.4. Установка для наблюдения КРС на про- свет: Л 1 и Л — линзы О — объект Э — экран для устранения возбуждающего излучения Сп — щель спектрографа 18.4. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса Спектроскопия ЯМР широко применяется для изучения самых разнообразных химических проблем, решение которых другими методами невозможно или очень затруднено. Среди них следует отметить определение молекулярной структуры (стереохимия молекул изучение диссоциации, реакций обмена, процессов образования водородной связи исследование распределения электронов в молекулах обнаружение свободных радикалов с небольшой продолжительностью жизни, возникающих в химических (биохимических) процессах, которые не поддаются изучению стандартными химическими методами именно из-за их быстротечности, и т. п. Весьма эффективно применение ЯМР-спектроскопии для идентификации и анализа лекарственных средств, то есть определения относительного содержания лекарственных веществ и примесей. Следует отметить, что методы ЯМР, ИК- и УФ-спектроскопии взаимно дополняют друг друга, поскольку в каждом из этих методов регистрируются переходы между различными энергетическими уровнями в разных структурных подсистемах молекулы (от ядра до квантованого вращательного спектра молекулы как целого). Между оптической спектроскопией в ИК- или УФ-областях спектра и спектроскопией ЯМР существуют принципиальные различия, связанные стем, что в первом случае индуцируются электро- дипольные переходы, а во втором — магнитодипольные, что определяет различия в строении спектров и их интерпретации. В спектре ЯМР нередко удается идентифицировать и определить положение каждой функциональной группы, входящей в состав молекулы, что весьма редко можно осуществить с помощью ИК- или УФ-спектров. Физические основы метода. Электрон, протон, нейтрон и целый ряд атомных ядер обладают собственным механическим моментом (спином) s L , с которым линейно связан магнитный момент = где ? — гиромагнитное отношение. Несмотря на то что ядра атомов состоят из протонов и нейтронов, обладающих спином, не все атомы имеют магнитные ядра. Ядра счетным массовым числом и четным атомным номером, так называемые четно-четные, не имеют магнитного момента = 0). Четно-нечетные ядра имеют целый спина нечетно-не- четные и нечетно-четные обладают полуцелым спином. Наиболее важные для исследования ядра: 1 Н (J = 1/2, ? = 2,675•10 8 Гц•рад/Тл); 2 Н (J = 1, ? = 0,411•10 8 Гц•рад/Тл); Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств 563 С (J = 1/2, ? = 0,673•10 8 Гц•рад/Тл); 14 N (J = 1, ? = 0,193•10 8 Гц•рад/Тл); 17 O (J = 5/2, ? = — 0,363•10 8 Гц•рад/Тл); 15 N (J = 1/2, ? = — 0,271•10 8 Гц•рад/Тл); 19 F (J = 1/2, ? = 2,517•10 8 Гц•рад/Тл); 31 P (J = 1/2, ? = 1,083•10 8 Гц•рад/Тл); где J — спиновое квантовое число ядра. Согласно положениям квантовой механики, механический момент ядра пропорционален спиновому квантовому числу J: = s L J где = ? / 2 h — нормированная постоянная Планка. Механический момент может располагаться только вдоль определенных пространственных направлений таким образом, что его проекции на направление внешнего магнитного поля могут принимать дискретные значения sz J L m где т — магнитное квантовое число, которое характеризует стационарные или собственные состояния ядра. Согласно условию квантования, запишем значения т Полное число возможных значений m J , а следовательно, и энергетических уровней ядра в магнитном поле равно 2J + 1. Из изложенного следует, что ядра, помещенные в магнитное поле В, могут иметь следующие дискретные эквидистантные уровни энергии ?? 0 m J E m Вследствие теплового движения на каждом энергетическом уровне в среднем будет находиться число ядер, определяемое распределением Больцмана 1 J m m где N m — населенность уровня N — общее количество ядер. Более высокие энергетические уровни населены слабее низких уровней, то есть на низких энергетических уровнях создается некоторый избыток ядер, при этом разность заселенностей соседних уровней равна 18.4. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 564 ? ? ? = ? ? + 0 1 (2 1) m Для протонов, ядер атомов водорода (двухуровневая система) при комнатной температуре и внешнем магнитном поле индукцией В 0 = 1,4 Тл на каждый миллион ядер приходится около 10 протонов, находящихся на нижнем уровне. Если на эти ядра воздействовать переменным магнитным полем H 1 = H 0 •sin ?t, перпендикулярным В, и частотой ?, то только в том случае, когда энергия кванта электромагнитного поля ? станет равной энергии перехода ядер на соседний энергетический уровень, то есть ? = ? 0 B , или = ? 0 B , ядра начнут переходить с нижних энергетических уровней на более высокие. На рис. 18.4.1 представлена система уровней для ядер со спином J = 1, а также возможные ориентации механиче- Рис. 18.4.1. Система уровней для ядер со спином J = 1 (а, а также возможные ориентации механического момента ядер и их намагниченностей (б) ского момента ядер и их намагниченностей. В каждом акте поглощения одно ядро поглощает один квант поля, при этом, согласно правилам отбора для магнитодипольных переходов, ?m = ±1. Для такого типа ядер в данном поле при отсутствии взаимодействия между ядрами существует только одна частота резонанса, которая соответствует одной линии поглощения на спектре ЯМР. Так, например, для ядра водорода (протона) н = 2,675•10 8 Гц•рад/Тл, и, следовательно, резонансная частота для протонов, находящихся в магнитном поле индукцией В = 1 Тл, равна ? = 42,58 мГц. Поглощение будет происходить до тех пор, пока не наступит выравнивание заселенностей уровней. В реальной физической системе различные механизмы взаимодействия ядер друг с другом и с окружающими их электронами восстанавливают избыток ядер на нижних энергетических уровнях. Электромагнитное поле стремится уравнять заселенность уровней, тогда как взаимодействие ядер противодействует этому. Процессы, в результате которых ядра переходят на более низкие энергетические уровни, называются релаксационным и. Известно два типа релаксации спин-решеточная релаксация, при которой теряемая энергия превращается в поступательную и вра- а б Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств 565 щательную энергию молекул или решетки, и спин-спиновая, связанная с обменом спиновыми состояниями, посредством прямого или косвенного спин-спинового взаимодействия между соседними ядрами. Релаксация спин-решеточная, или, как ее еще называют, продольная, характеризуется временем релаксации Та спин-спиновая (поперечная) — временем Т. Ширина линий поглощения на спектрограммах обратно пропорциональна временам релаксации, поэтому поскольку в твердых телах время поперечной релаксации мало (Т 2 < 10 –4 …10 –5 сто ширина линий поглощения в них очень большая. В жидкостях и газах ширину линий поглощения в основном определяет время продольной релаксации Т, которое может доходить до 10 4 с, что приводит к очень узким линиям поглощения, ширина которых часто меньше одного герца. Значение спектроскопии ЯМР для химии основывается на том, что с ее помощью можно отличить некоторое ядро, находящееся в определенном окружении, от других ядер того же типа, благодаря тому, что на резонансные частоты ядер влияют окружающие их электронные оболочки. Влияние электронов заключается в экранировании ядер атомов от внешнего магнитного поля диамагнитными электронными оболочками, которые создают собственные небольшие противоположно направленные магнитные поля. Степень экранирования, а следовательно, и химический сдвиг ЯМР-сигнала на спектрограмме по сравнению с незаэкранированным ядром строго пропорциональны индукции В внешнего магнитного поля. Локальное поле В лок на ядре оказывается меньшим внешнего поля В и равно В лок = В — где ? — постоянная экранирования. В результате магнитного экранирования для получения поглощения энергии экранированными ядрами необходимо повысить внешнее поле или уменьшить частоту. Смещение частот резонанса на спектрограмме в результате экранирования ядер оценивается с помощью химического сдвига ?: ( ) ?–?? ?? ? ? ? ? ? = ? 6 где ?–?? ? — частота резонанса для ядер данного эквивалентного химического окружения ?? ? — частота резонанса эталона, химический 18.4. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса сдвиг которого считается равным нулю 0 ? — рабочая частота спект- рометра. В качестве эталона для протонного магнитного резонанса (ПМР), в котором участвуют ядра атомов водорода Н, используется тетраметил- силан (ТМС) Si(СН 3 ) 4 . Единица измерения химического сдвига миллионная доля от рабочей частоты спектрометра ? 0 (млн. Так, например, для спектрометра с рабочей частотой 60 МГц, при работе с протонами, диапазон химических сдвигов для большинства органических соединений простирается от 0 до 16 млн, что соответствует максимальному смещению частоты резонанса, равному 960 Гц. Если в молекуле имеется несколько групп одинаковых ядер, находящихся вне- эквивалентных положениях, тона спектре ЯМР будут наблюдаться линии поглощения с различными химическими сдвигами, соответствующими различному экранированию этих группа число линий поглощения будет равно числу таких неэквивалентных групп. Степень экранирования зависит от числа электронов, окружающих протоны, а также от конфигурации электронных оболочек и их расположения, то есть от вида химической связи. Например, для протонов алифатических связей С –Н экранирование уменьшается в ряду ? > ? > ? 2 Резонансные сигналы олефиновых протонов лежат в области ? = 4,0…6,5, а протонов ароматических групп проявляются в характеристической области между ? = 7,0 и 9,0. На рис. 18.4.2 изображен спектр ПМР этилбензола. Интегральная интенсивность линий поглощения Рис. 18.4.2. Спектр ПМР этилбензола с интегральной кривой на спектрах ПМР пропорциональна числу протонов, участвующих в резонансном поглощении. Расщепление линий поглощения, связанных с резонансом протонов в группах СН 2 и СН 3 , вызвано взаимным влиянием магнитных моментов этих групп. Указанное взаимодействие передается с помощью электронов, принимающих участие в образовании хи- Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств 567 мических связей, и называется косвенным спин-спиновым взаимодействием (КССВ), а группы расщепленных линий — мультиплетами. Расстояние между линиями в мультиплетах, выраженное в герцах, определяет константу взаимодействия J АВ , которая не зависит от рабочей частоты спектрометра. Константы спин-спинового взаимодействия зависят от взаимного пространственного расположения групп взаимодействующих ядер, а также от геометрии пути, по которому происходит взаимодействие, то есть от стереохимии молекул. Техника спектроскопии ЯМР. Радиоспектрометр ЯМР — сложное устройство, в котором наиболее важным элементом является источник постоянного магнитного поля В (электромагнит с железным ярмом, постоянный магнитили сверхпроводящий соленоид. К конструкции магнита предъявляются очень жесткие требования, поскольку разрешающая способность спектрометра зависит от стабильности и однородности магнитного поля. Относительная разрешающая способность ?? спектрометра определяется отношением наименьшей ширины наблюдаемой линии в герцах к рабочей частоте спектрометра, то есть Так, например, для стационарного спектрометра с рабочей частотой МГц разрешающая способность равна 5•10 –9 , что соответствует неоднородности магнитного поля в объеме образца мм, равной 7•10 –10 Тл. Между полосами магнита размещается датчик ЯМР, в котором находится ряд устройств, необходимых для получения сигнала ЯМР. В датчике расположена катушка, на которую подается переменное напряжение, генерируемое стабилизированным генератором, частота которого равна рабочей частоте спектрометра. Внутри этой катушки размещается стеклянная ампула с исследуемым веществом, находящимся в жидком состоянии. С помощью этой катушки создается переменное магнитное поле Н, перпендикулярное постоянному полю B 0 (рис. Высокая степень однородности магнитного поля обеспечивается не только конструкцией магнита, но также и коррекцией однородности поля специальными катушками (шиммами), которые намотаны на корпусе датчика, изготовленного из немагнитного материала. Ток в этих катушках подбирается таким образом, чтобы наиболее узкая линия поглощения имела наименьшую ширину. Дальнейшее увеличение однородности достигается быстрым вращением ампулы 8 вокруг вертикальной оси, что приводит к усреднению магнитного поля в плоскости, перпендикулярной 18.4. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса оси вращения. В датчике также находятся катушки модуляции и сдвига (на рисунке не показаны. С помощью катушек модуляции на магнитное поле 0 B накладывается небольшое переменное магнитное поле частотой 1…2 кГц, в результате чего сигнал оказывается промодулированным по частоте, что дает возможность увеличить чувствительность спектрометра. Катушки сдвига изменяют в незначительных пределах магнитное поле 0 B для того, чтобы можно было записать любой участок спектра в увеличенном масштабе. Для сохранения условий резонанса служит блок стабилизации резонансных условий 3, который стабилизирует магнитный поток с помощью катушек 10, а также с помощью блока ядерной стабилизации вырабатывает сигналы, которые быстро корректируют магнитную индукцию 0 B и частоту ВЧ-генератора, что позволяет компенсировать магнитные помехи индустриального и космического происхождения. Ампула, в которой находится образец, представляет собой цилиндрический сосуд диаметром 5 мм, изготовленный с высокой точностью из однородного стекла. Для улучшения качества ампулы шлифуют, добиваясь высокой степени соосности внутренней и внешней поверхностей. Чтобы приготовить образец, 20—30 мг вещества помещают в ампулу и растворяют, добавляя около 0,5 мл растворителя и несколько капель стандарта, например ТМС. Рис. 18.4.3. Схема ЯМР-спектрометра: 1 — катушки электромагнита 2 — полюсы электромагнита 3 — блок стабилизации резонансных условий 4 — ВЧ-генератор; 5 — ВЧ-приемник; 6 — детектор — модулятор 8 — ампула с образцом 9 — регистрирующее устройство 10 катушки стабилизации магнитного поля 11 — катушки модуляции Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств В качестве растворителя используют вещества, не имеющие линий поглощения в исследуемом диапазоне химических сдвигов. Часто этими веществами являются известные растворители, в которых водород заменен дейтерием, частоты резонанса которого не попадают в область ПМР. Чувствительность ЯМР ниже чувствительности ИК-спектроскопии и определяется минимальным количеством эквивалентных протонов, сигнал которых можно уверенно выделить среди шумов. Стационарные спектрометры дают возможность наблюдать сигналы ПМР от 10 17 до 10 18 эквивалентных протонов 18.5. МАСС-СПЕКТРОСКОПИЯ Метод исследования вещества путем определения масс атомов и молекул и их фрагментов, входящих в его состав, называется масс- спектроскопией (масс-спектральным анализом. Совокупность значений масс и их относительных содержаний называется масс- спектром. В первую очередь метод используется для определения молекулярного веса органических соединений и их составляющих сочень высокой точностью проведения количественного анализа газообразных или низкокипящих углеводородов, а также при определении стабильных изотопов в газообразных продуктах деградации. Ряд качественных особенностей превращает масс-спектрометрию в очень перспективный метод определения элементов и структуры сложных органических соединений, в частности природных соеди- нений. Метод хорошо дополняет информацию, получаемую с помощью других физических методов. Так, например, УФ-спектр указывает на тип ароматической системы или сопряженного хромофора, ИК- спектр позволяет обнаружить наличие многих функциональных групп, спектр ЯМР дает в ряде случаев информацию об окружении этих групп. Интерпретация масс-спектра часто позволяет разместить эти функциональные группы в определенных местах молекулы и оценить, как они соединены друг с другом. Кроме того, поданным масс-спектра можно сделать вывод о размере и структуре боковых цепей, что трудно установить путем химической дегра- дации. Масс-спектрометры используются для быстрого анализа состава газовых смесей, непрерывного контроля и регулирования процессов в химической промышленности, для исследования кинетики химических реакций (в частности при измерении концентрации свободных радикалов. В физико-химических исследованиях масс- спектрометрия применяется при исследованиях процессов иони- § 18.5. Масс-спектроскопия 570 зации, возбуждения частиц и других задач физической и химической кинетики для определения энергии ионизации, теплоты испарения, энергии связи атомов в молекулах и т. п. Замечательной особенностью масс-спектрометрического метода является возможность ограничиться ничтожно малым количеством исследуемого вещества, не превышающим десятых долей микрограмма. Физические основы метода. Чтобы реалистически оценить возможности применения масс-спектрометрии, необходимо рассмотреть физику протекающих процессов, принцип работы масс-спек- трометра и способы получения масс-спектров. Масс-спектрометр — это прибор для разделения ионизированных молекул и атомов по их массам, основанный на воздействии магнитных и электрических полей на пучки ионов исследуемого вещества, летящих в вакууме. В масс-спектрометрах регистрация ионов осуществляется электрическими методами в масс-спектро- графах — по потемнению фоточувствительного слоя. Из основного уравнения движения заряженной частицы в магнитном и электрическом полях 2 d d r m q E B t ? ? = + ? Ч следует, что ее траектория определяется отношением заряда к массе m ). Так, двигаясь в электрическом поле, заряженная частица приобретает скорость в магнитном поле радиус траектории частицы определяется как m v r q B = ? Поэтому исследование отклонения частицы в электрическом и магнитном полях может быть использовано для нахождения Так как начальная скорость движения частицы v неизвестна, тоне может быть определено измерением отклонения частицы только в электрическом или только магнитном полях. Задача решается путем использования отклонения одной и той же частицы как в электрическом, таки в магнитном полях. Для нахождения скорости частицы в простейшем случае достаточно уравновесить электрическое отклонение магнитным. Для этого надо располо- Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств жить поля так, как показано на рис. 18.5.1. Заряженные частицы не будут отклоняться при условии = Ч [ ] qE q v B . Определив скорость, далее можно воспользоваться либо одним электрическим, либо одним магнитным отклонением от прямолинейного пути и по его значению рассчитать Схема работы простейшего масс-спектрографа представлена на рис. 18.5.2. Пучок исследуемых ионов последовательно проходит через электрическое и магнитное поля. В однородном электрическом поле конденсатора ионы отклоняются в направлении напряженности тем сильнее, чем меньше их скорость и больше удельный заряд q/m. В однородном магнитном поле (вектор B направлен перпендикулярно плоскости чертежа) ионы движутся поду- гам окружностей, радиусы которых тем больше, чем больше скорость ионов и меньше их удельный заряд q/m. Поэтому в магнитном поле пучок ионов расщепляется на несколько пучков, каждый из которых соответствует своему значению q/m. Магнитную индукцию B можно подобрать такой, чтобы ионы фокусировались на фотопластинке. В результате этого на пластинке образуется ряд узких параллельных линий, соответствующих различным значениям удельных зарядов ионов. Согласно рис. 18.5.2, линия А соответствует ионам с большим удельным зарядом q/m, а линия А — ионам с меньшим Более чувствительными являются масс-спектрометры — приборы с электрической регистрацией ионных токов. В статических, более распространенных, масс-спектрометрах исследуемые ионы движутся в постоянных во времени магнитных полях. В динамических масс-спектрометрах удельные заряды ионов определяются различными способами повремени их пролета от источника до коллектора, по периоду колебаний в переменных электрическом или магнитном полях, по резонансным частотами т. д. Рис. 18.5.1. Направление электрического и магнитного B полей по отношению к направлению скорости движения заряженной частицы Рис. 18.5.2. Схема простейшего масс-спектрографа E B § 18.5. Масс-спектроскопия Принцип работы масс-спектрометра. Исследуемое вещество, прежде всего, подвергается ионизации. В случае жидких и твердых веществ их либо предварительно испаряют, а затем ионизируют, либо же применяют поверхностную ионизацию. Нормальный масс-спектр отражает зависимость содержания положительно заряженных частиц, образующихся при электронной бомбардировке молекул исследуемого соединения, от их массы. Само соединение должно присутствовать в парообразном состоянии при довольно низком давлении Пав ионном источнике. Положительные ионы (молекулы и их осколки, образующиеся в результате потери молекулой электрона при электронном ударе (ионизации, ускоряются электрическим полем и отклоняются в магнитном поле. Непрерывное изменение одного из этих полей приводит к фокусировке пучков ионов различных масс на щели коллектора, и сигнал после соответствующего усиления регистрируется. Полярность электрического поля такова, что по направлению к магнитному полю ускоряются только положительные ионы все отрицательные частицы перемещаются в обратном направлении и теряются. Неионизированные молекулы и незаряженные осколки непрерывно откачиваются вакуумными насо- сами. Блок-схема масс-спектрометра представлена на рис. 18.5.3. Масс-спектрометр обычно содержит устройство для подготовки исследуемого вещества 1; ионный источник 2, где это вещество частично ионизируется и проходит формирование ионного пучка; Рис. 18.5.3. Блок-схема масс-спектрометра: 1 — устройство для подготовки исследуемого вещества 2 — ионный источник 3 — масс-ана- лизатор; 4 — приемник ионов 5 — усилитель 6 — регистрирующее устройство 7 — ЭВМ 8 системы электрического питания 9 — устройства, создающие и поддерживающие высокий вакуум в ионном источнике и анализаторе (пунктиром обведена вакуумированная часть прибора) И Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств 573 масс-анализатор 3, в котором происходит разделение ионов по массам, точнее, по величинам / m q ; приемник ионов 4, где ионный ток преобразуется в электрический сигнал, который усиливается усилителем и регистрируется. В регистрирующее устройство 6, помимо информации о количестве ионов (ионный ток, из анализатора поступает также информация о массе ионов. Масс-спектрометр содержит системы электрического питания 8 и устройства 9, создающие и поддерживающие высокий вакуум в ионном источнике и анализаторе. Иногда масс-спектрометр соединяют с ЭВМ При любом способе регистрации ионов спектр масс, в конечном счете, представляет собой зависимость ионного тока I от массы т (рис. 18.5.4). Например, в масс-спектре свинца каждый из пиков ионного тока соответствует однозарядным ионам изотопов свинца. Высота каждого пика пропорциональна содержанию изотопа в свинце. Отношение массы иона к ширине пика называется разрешающей способностью масс-спектрометра Иногда разрешающей способностью называют значение той наибольшей массы, при котором два пика, отличающиеся по массе на единицу, разрешаются до заданного уровня. Считается, что масс- спектрометр с R до 10 2 имеет низкую разрешающую способность, при = 2 3 10 ...10 R — среднюю, = 3 4 10 ...10 R — высокую. Особенности применения масс-спектрометрии к анализу органических соединений (лекарственных препаратов. Летучесть соединения является решающим фактором в масс-спектрометрии. Путем несложных химических превращений можно расширить область применения метода. Очень часто удается перевести соединение, само по себе недостаточно летучее, в такое производное, которое, сохраняя все существенные черты строения исходной молекулы, обладает вместе стем достаточным давлением пара. Чтобы получить воспроизводимый масс-спектр, необходимо следить за концентрацией соединения, то есть за его давлением Рис. 18.5.4. Масс-спектр свинца 18.5. Масс-спектроскопия в ионном источнике. Если систему напуска поместить в печь, то можно добиться требуемого давления пара у многих сравнительно сложных органических соединений, если только они не содержат слишком большого числа полярных групп. Для веществ того типа, с которыми встречаются в химии природных соединений, верхним пределом является температура 200 Свыше которой не всегда удается избежать пиролитических реакций, усложняющих интерпретацию масс-спектра. Вполне пригодный масс-спектр можно получить и от сравнительно нелетучих соединений, если их испарять непосредственно в ионном источнике. Как правило, любое соединение, которое легко перегоняется или сублимируется при температуре системы напуска и давлении порядка 1,3—2,6 Падает хороший масс-спектр. После опыта прибор нужно длительное время откачивать перед тем, как ввести в него новый образец (для удаления следов вещества). Количество вещества, требуемое для получения практически пригодного масс-спектра, в значительной степени зависит от приемов и способов введения этого вещества в масс-спектрометр. Чтобы получить в баллоне объемом приблизительно 3 л (средний объем большинства выпускаемых приборов) давление порядка Па, требуется примерно 1 мкмоль вещества. Однако в некоторых случаях при интерпретации спектра неизвестного соединения приходится принимать во внимание сравнительно малые пики, которые можно различить только в достаточно интенсивном спектре, который, в свою очередь, зависит от концентрации молекул в ионном источнике. Кроме того, процессы выделения чрезвычайно малых количеств вещества и их введение в масс-спектрометр часто приводит к неизбежному загрязнению объекта примесями, количество которых может даже превысить количество исследуемого соединения. Тем не менее количество вещества, требуемое для получения пригодного для интерпретации масс-спектра, меньше, чем для получения других типов спектров. Практически обычно не превышает мг. Использование в масс-спектрометрии исследуемого вещества в виде разбавленных растворов проблематично. Впрыскивание большого количества пробы приведет к повышению давления в ионном источнике, который перестанет нормально работать. Другими словами, существует верхний предел общего количества вводимого в прибор вещества, и если исследуемый компонент присутствует в слишком низкой концентрации, тов наблюдаемом масс-спектре будут представлены очень сильные пики растворителя и чрезвычайно слабые пики растворенного вещества. Очевидно, что в та- Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств 575 ких случаях следует или сконцентрировать растворили, что еще лучше, полностью удалить растворитель. При расшифровке масс-спектров необходимо учитывать характер возможных загрязнений вещества. Особенно тщательно следует избегать загрязнения образцов смазочными маслами, вакуумной смазкой, силиконовым маслом, пластификаторами и другими обычно используемыми материалами, применение которых приводит к артефактам. Вакуумные смазки и масла дают непрерывную серию пиков, вплоть до очень больших масса силиконы, триалкил-фосфаты — ряд очень интенсивных пиков, усложняющих анализ. Однако высокая степень воспроизводимости масс- спектров позволяет получить спектр чистого соединения в присутствии другого вещества, если спектр последнего известен. Спектрометр, применяемый для определения структуры природных соединений, должен быть пригоден для регистрации полного масс-спектра каждого исследуемого соединения. Выпускаемые приборы дают возможность регистрировать пики до 700 а. е. м., а при наличии дополнительных приспособлений даже более высокие массы. Практически этого диапазона вполне достаточно для исследований, поскольку очень низкая летучесть соединений с высоким молекулярным весом, как правило, препятствует определению их масс-спектров. § 18.6. РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ Для исследования лекарственных и биологически активных веществ все шире применяется рентгеноструктурный анализ, основанный на дифракции рентгеновских лучей. Метод рентгеноструктурного анализа является уникальным для изучения физико- химических свойств, обычно используемых при изучении органических и неорганических кристаллических веществ. Перспективы использования методов дифракции рентгеновских лучей в фармации связаны с идентификацией кристаллических лекарственных веществ, их полиморфных модификаций и пр. Этот метод — чувствительный тест при установлении идентичности двух кристаллических веществ. С помощью методов рентгенографии исследуют элементный и фазовый состав как неорганических, таки органических лекарственных веществ — алифатических и ароматических соединений, гетероциклических соединений природного и синтетического происхождения. Перспективными можно считать рентгенодифракционную диагностику субмикронных слоев, исследование механизмов сорбции 18.6. Рентгеноструктурный анализ на кристаллическую поверхность и десорбции. Взаимодействие атомов, лежащих на поверхности, связано как с чисто электронными свойствами сорбированного атома и кристалла, таки с локальной деформацией нескольких атомных слоев, лежащих вблизи поверхности. Эти деформации нередко составляют всего сотые доли межатомного расстояния, но они оказываются существенными для определения характера межатомного взаимодействия, позволяя определить состав и тип химической связи вблизи поверхности, в области одного монослоя. Соответствующие методы (рентгеноэлектронная и ОЖЭ-спектроскопия, просвечивающая электронная микроскопия, различные типы спектроскопии вторичных и рассеянных ионов и другое) позволяют проводить измерения в областях менее 0,1 мкм. В последнее время появилась и успешно развивается новая наука бионеорганическая химия, которая изучает поведение так называемых элементов жизни — металлов, имеющих колоссальное значение для жизнедеятельности организма. Эти микроэлементы (КМ, Са, М, е и др) вводятся в организм в виде координационных соединений их с биоактивным веществом (лигандом. В таком виде они более активны, менее токсичны и обладают сильным каталитическим действием. Поиск новых комплексных координационных соединений является актуальной задачей для создания новых медицинских препаратов и биостимуляторов. Синтез новых биосое- динений органически связан с методами исследования структуры, свойств, природы и совместимости металла и лиганда. Эти задачи решаются прежде всего с помощью методов рентгеновского анализа, а также ИК- и ЭПР-спектроскопии, дериватографии. Для эффективного практического применения рентгеновского анализа необходимо иметь представление о природе и свойствах рентгеновских лучей, основных принципах их взаимодействия с ве- ществом. Физические основы метода. Рентгеновский структурный анализ представляет собой совокупность метода исследования вещества, основанный на определении интенсивностей, а также соответствующих им направлений рассеянного на атомах анализируемого объекта рентгеновского излучения. В основе этих методов лежит взаимодействие рентгеновского излучения с электронами вещества, в результате которого возникает дифракция рентгеновских лучей. Дифракционная картина зависит от длины волны рентгеновского излучения и однозначно соответствует атомному строению вещества. На рентгеновское излучение в спектре электромагнитных волн приходится довольно широкий диапазон длин волн от 10 –7 м (мягкое рентгеновское излучение) дом (жесткое рентгеновское излучение, однако для исследования атомной структуры вещества при- Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств меняют излучение с длиной волны примерном, то есть порядка размеров атомов и межатомных расстояний. Источником рентгеновского излучения является рентгеновская трубка, в которой используется столкновение ускоренных электронов с веществом анода. Электроны, освобождающиеся в результате термоэмиссии, разгоняются между двумя электродами вакуумированной трубки, к которым приложено высокое напряжение (обычно 10 4 …10 5 В). Вид спектра выделяющегося из трубки рентгеновского излучения изменяется в зависимости от ускоряющего электроны напряжения. Увеличение напряжения приводит к появлению в сплошном спектре четких линейчатых максимумов интенсивности излучения. Длина волны, соответствующая этим максимумами разность потенциалов (порог возбуждения излучения, при которых они возникают, зависят только от вещества анода, поэтому такое излучение названо характеристическим. Характеристическое излучение возникает при переходе электронов с оболочки на оболочку в атомах металлов — от С до Мо, причем длины волн лежат в интервале 0,23…0,07 нм. Наиболее интенсивной является линия, интенсивность K ? - линии в несколько раз меньше. Рентгеновские трубки с анодами Сr—Мо являются источниками практически монохроматического излучения Характерной чертой рентгеновских спектров является то, что линии образуют отделяющиеся друг от друга группы серий (K, L, M, ..., — в направлении от более коротких длин волн к более длинным. Структура рентгеновских спектров проще и более обозримая, чему оптических спектров. Здесь нет существенной разницы между спектрами атомов и связанных систем характеристический спектр связанных систем можно грубо рассматривать как сумму спектров, составляющих систему атомов. Применение рентгеновского излучения для исследования кристаллических веществ основано на том, что каждое вещество имеет свою определенную кристаллическую решетку с определенными параметрами, а длина волны рентгеновского излучения сопоставима с расстоянием между упорядоченно расположенными атомами в кристаллической решетке, которая для него является естественной дифракционной решеткой. Следовательно, каждое кристаллическое вещество характеризуется своей собственной дифракционной картиной рентгенограммой. Сущность рентгеновского анализа заключается в исследовании дифракционной картины, получаемой при отражении рентгеновских лучей от атомных плоскостей кристалла. Все плоскости, одинаково ориентированные в пространстве, составляют семейство плоскостей, которое характеризуется кристалло- § 18.6. Рентгеноструктурный анализ графическими индексами Совокупность индексов плоскости называется символом плоскости (hkl). Каждому семейству плоскостей с индексами) соответствуют определенные межплоскостные расстояния, ? ? ? n k l d — расстояние между двумя соседними параллельными плоскостями (рис. Межплоскостные расстояния важнейшие структурные характеристики кристаллических веществ. В рентгеноструктурном, а также электроннографичес- ком анализе расстояния d выражаются как функции индексов h, k, l (h, k, l = 0, 1, 2, 3, Параметры кристаллической решетки d hkl , ? — угол падения (или отражения) монохроматического рентгеновского луча на атомную плоскость и длина волны ? связаны условием Вульфа—Брэгга, |