Тиманюк, Животова. Биофизика. Учебник для студентов фармацевтических и медицинских вузов удк 577. 3(075. 8) Ббк 28. 901я73 т 41

• Название: Учебник для студентов фармацевтических и медицинских вузов удк 577. 3(075. 8) Ббк 28. 901я73 т 41
• Дата: 01.03.2020
• Размер: 4.28 Mb.
• Имя файла: Тиманюк, Животова. Биофизика.pdf
• Тип: Учебник; #110412
• страница: 33 из 42

которое положено в основу любого дифракционного анализа = ?
2
sin hkl d
n (n = 1, 2, 3, где n — порядок дифракционного максимума. Это уравнение является условием для возникновения дифракционного максимума интенсивности рентгеновского излучения при его взаимодействии с решеткой кристалла. Для любого направления падения рентгеновских лучей на решетку образуется целая совокупность дифрагированных волн, часть которых будет удовлетворять условию
Вульфа—Брэгга и создавать дифракционный максимум на регистрирующем устройстве. Интенсивность дифракционных максимумов от любой группы плоскостей зависит от расположения атомов в элементарной ячейке. Условие дифракции d >
? выполняется для рентгеновских лучей (
? 0,1 нм) и для электронов в электронном микроскопе (
? 0,001 нм. Измеряя направления и интенсивности брэгговских рефлексов, можно определить расположение атомов в веществе, включая и такие сложные объекты, какими являются биологические молекулы, состоящие из нескольких десятков тысяч атомов (рис. Аппаратура для рентгеновских дифракционных исследований.
Рентгеновские установки для структурного анализа кристаллических веществ делятся на фоторегистрирующие аппараты (типа УРС)
и рентгенодифрактометры (типа ДРОН). Первые — конструктивно
Рис. 18.6.1. Дифракция рентгеновских лучей на кристаллической решетке — угол падения (отражения) монохроматического рентгеновского луча на атомную плоскость d hkl и d h'k'l'
— межплоскостные расстояния в кристаллической решетке
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

несложные, простыв эксплуатации, надежны в работе, однако определение интенсивности дифракционных максимумов, необходимых при решении ряда задач, довольно трудоемко. Наиболее распространенной и удобной в работе камерой для рентгенографических исследований поликристаллов является камера РКД-57,3.
В современных лабораториях применяются рентгенодифрак- тометры, в которых дифракционная картина регистрируется с помощью счетчиков квантов. Измерения интенсивности дифракционных максимумов и их углового положения производятся с помощью ионизирующих или сцинтилляционных счетчиков излучения. Универсальность этих приборов дает возможность использовать различные варианты геометрии и условий съемки, менять специальные приставки к рентгенгониометру, варьировать скорости движения счетчика и вращения образца. Окончательную информацию — дифракционный спектр — можно записать на диаграммную ленту электронного потенциометра или в память компьютера. Преимущество этого способа — высокая точность, чувствительность и экспресс- ность. Оба метода являются неразрушающими.
Важным и непростым этапом в рентгенографическом исследовании является регистрация дифракционной картины. В основе способов регистрации рентгеновского излучения лежит его способность ионизировать газы, разлагать бромистое серебро фотоэмульсии, вызывать люминесценцию или фотопроводимость в кристаллических веществах. В
соответствии с этим используются пропорциональный счетчики счетчик Гейгера, фотографический метод, сцинтилляционные счетчики и полупроводниковые детекторы.
Методы получения рентгенограмм различаются как по способу регистрации, таки по способу реализации условий получения дифракционных спектров. Если дифракционная картина поликристалла фиксируется на рентгеновскую пленку, то метод называется фотографическим, а снимки — дебаеграммами. Дифракционная картина,
зафиксированная на дифрактометрах, называется дифрактограммой.
Фотографический метод регистрации целесообразно применять в том случае, когда в распоряжении исследователя имеется малое количество исследуемого образца. Этот метод удобен для проведения качественного фазового анализа, так как на рентгенограммах образуется полный набор дифракционных линий соответствующей кристаллической фазы. При съемке смеси на рентгенограмме получается набор линий всех присутствующих кристаллических веществ (фаз).
Для решения задач, требующих точного знания интенсивности дифракционных максимумов, вещество лучше снимать на рент- генодифрактометре. В обоих случаях — при съемке дебаеграмм и при регистрации дифрактограмм исследуемые образцы обычно приготовляются в виде мелких порошков. Крупные кристаллы из порош-
§ 18.6. Рентгеноструктурный анализ

580
кового образца дают на дебаеграмме точечные линии, а на дифрактограмме искажают истинную форму и интенсивность дифракционных максимумов, что затрудняет измерение и правильную интерпретацию дифракционной картины. В некоторых случаях следует учитывать, что сухое растирание вещества приводит к нарушению его кристаллического строения при интенсивном растирании возможны также полиморфные превращения или изменение агрегатного состояния. Тогда необходимо выполнять пробные съемки в целях контроля и устранения этих нежелательных эффектов (артефактов).
Конкретные способы приготовления объектов исследования изложены в специальной литературе.
Расчет дифрактограмм и идентификация кристаллических веществ.
Первым этапом в расшифровке дифракционных картин согласно условию Вульфа—Брэгга является определение значений углов отражения, при которых наблюдаются максимумы интенсивности. Дифрактометрический способ анализа поликристаллов достаточно сложный, нов тоже время — более быстрый и точный. На дифрактограмме положение дифракционного максимума соответствует углу отражения 2
?, а площадь и высота — интенсивности.
На практике применяются два способа определения положения пиков — по максимуму и по центру тяжести (метод геометрических построений).
После расшифровки рентгенограммы, получения совокупности значений межплоскостных расстояний и относительных интенсивностей дифракционных линий можно приступать к идентификации исследуемого вещества. Возможность идентификации основывается на том, что измеренный набор величин является однозначной характеристикой данного вещества в данном состоянии. Важно то, что идентификацию кристаллических веществ можно провести без знания атомно-кристаллической структуры, достаточно лишь сравнить дифракционный спектр анализируемого вещества (достаточно пяти наиболее интенсивных рефлексов) со спектрами известных кристаллических веществ или сих справочными кристаллографическими данными. Если вещество не является однофазным, а содержит два и более кристаллических соединений, то с помощью предлагаемого способа можно определить фазовый состав всего ве- щества.
В специальной литературе описаны дифрактограммы кристаллических лекарственных веществ, широко используемых в меди- цине.
Излучение рентгеновского диапазона находит применение в биологии и медицине для диагностики и терапии различных заболеваний. Электромагнитные волны рентгеновского диапазона по- разному поглощаются веществом в зависимости от длины волны
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

излучения и от свойств самого вещества. Так, более жесткое рентгеновское излучение обладает большей проникающей способностью,
поэтому мягкое излучение, поглощаемое в большей мере, может вредно воздействовать на поверхностные слои (например на кожу 18.7. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Учитывая, что свет представляет собой электромагнитные волны в широком диапазоне частот (длин волн, к микроскопии относятся не только обычная световая, но и ультрафиолетовая (люминесцентная, ИК-микроскопия (тепловидение, просвечивающая электронная микроскопия, растровая электронная микроскопия и другие в зависимости от вида используемого излучения.
Различные типы микроскопов используются в фармации для обнаружения и изучения бактерий, органических клеток, мелких кристаллов. Кристаллооптический и микро-кристаллоскопический анализ — надежные методы идентификации фармацевтических препаратов. Эти методы, с использованием поляризационного микроскопа, отличаются простотой, быстротой получения и наглядностью микроскопической картины, высокой чувствительностью, возможностью идентификации веществ, имеющих сходные по форме кристаллы.
Оценка дисперсного состава частиц является одной из важнейших задач исследования коллоидных систем и технологии переработки дисперсных материалов, так как размер частиц определяет их реологическое поведение, влияет на коллоидную стабильность и многие технологические свойства. Изображения, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии, служат исходными данными в исследовании структуры биологических макромолекул, знание которой позволяет установить ее связь с выполняемыми функциями.
Метод люминесцентной микроскопии применяется для исследования культуры тканей, находящихся в питательной среде, для определения подлинности лекарственного растительного сырья.
Физические основы методов микроскопии. Приготовление мик- ропрепаратов. Предпосылкой для всех микроскопических исследований является изготовление микропрепаратов (образцов. В Государственной фармакопее Украины изложены некоторые методики приготовления микропрепаратов из сухого лекарственного растительного сырья для исследования листьев, трав, цветов, плодов семян, корней методом люминесцентной микроскопии. Для изучения других объектов каждый исследователь использует свой личный опыт 18.7. Микроскопический анализ

препарирования, дающий удовлетворительные результаты. Микро- скопист, изучая вместе с технологом изменения микроструктуры объекта под влиянием различных воздействий, помогает выбрать оптимальный режим получения микропрепарата с заданными свой- ствами.
При приготовлении биологических препаратов для электронной микроскопии используют микротомы — машины для вырезки очень тонких срезов объектов. В любом случае приготовление мик- ропрепаратов имеет чрезвычайно важное значение, поскольку от этого зависит правильность толкования микростуктур. Если препарат приготовлен неправильно, могут возникнуть артефакты структуры, связанные с механическим или химическим воздействием на объект, и ошибочное толкование микроструктуры становится неизбежным.
Световая микроскопия. В химико-биологических исследованиях (микробиологии, гистологии, цитологии, ботанике, медицине и других) используются главным образом биологические, люминесцентные и инвертированные микроскопы (в последних объектив располагается под наблюдаемым объектом, а конденсор сверху. Биологические микроскопы часто снабжаются приставками поляризационными и измерительными устройствами, тер- мостатирующими камерами, фоторегистрационными приспособлениями и др. Исследования проводят как в проходящем, таки в отраженном свете.
Свойство линзы или системы из двух и более линз давать увеличенное изображение предметов было известно еще в XVI веке.
Разработанная в конце XIX века теория образования изображений
(теория Аббе) несамосветящихся объектов способствовала развитию разнообразных методов микроскопических исследований.
Особенности формирования изображений объектов световым пучком, проходящим через линзы и отраженным от зеркал, изучаются в курсе общей физики в разделе геометрической оптики. Одна из типичных оптических схем микроскопа приведена на рис. Объект 5, расположенный на предметном столике 8, освещается дневным светом (или специальным осветителем) 1 с помощью зеркала и конденсора 4. Для увеличения объекта служит объектив и окуляр 7. Объектив создает действительное перевернутое и увеличенное изображение 5' объекта 5. Окуляр образует вторично увеличенное мнимое изображение 5", обычно на расстоянии наилучшего видения (250 мм. Если окуляр сдвинуть так, чтобы изображение объекта 5' оказалось перед передним фокусом окуляра, то изображение, даваемое окуляром, становится действительными его можно получить на экране, фотопленке или сетчатке глаза.
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

Общее увеличение равно произведению увеличения объектива
?/1 об) на увеличение окуляра (0,25 ?/f ок
) см. формулу. Обычно объективы микроскопов имеют увеличения от до 100, а окуляры — от 7 до 15. Поэтому общее увеличение лежит в пределах от 44 до 1500 (теоретически).
Важной характеристикой микроскопа является его разрешающая способность, определяемая как величина, обратная наименьшему расстоянию, на котором два соседних элемента структуры
(точки) еще могут быть видимы раздельно. Минимальное разрешение глаза составляет 0,1…0,2 мм. С помощью оптического микроскопа можно различить структуру с расстоянием между элементами до 0,20 мкм. Разрешающая способность тем больше, чем меньше длина волны используемого света и чем больше числовая апертура
(А) объектива. Приданном освещении разрешение микроскопа можно повысить путем использования иммерсионной жидкости с большим показателем преломления, заполняющей пространство между предметом и объективом. Разрешающая способность системы линз ограничена дифракцией света, так как длина волны видимого света лежит в пределах ч 0,7 мкм.
Существование предела разрешающей способности влияет на выбор увеличения микроскопа. Увеличение в пределах
Ч500…1000
Рис. 18.7.1. Типичная оптическая схема микроскопа — источник света 2 — линза-корректор; 3 — зеркпдо; 4 — конденсор объект 6 – объектив 7 — окуляр 8 — предметный столик 5' — действительное перевернутое и увеличенное изображение объекта 5, созданное объективом 5" — вторично увеличенное мнимое изображение объекта, созданное окуляром;
А — числовая апертура объектива 18.7. Микроскопический анализ

называется полезным, потому что при этом глаз различает все элементы структуры объекта. При увеличениях свыше 1000 никакие новые особенности структуры препарата не выявляются.
Оператор должен учитывать также глубину резкости изображения, которая характеризуется размером вертикального смещения деталей образца без потери фокусировки. Эта величина пропорциональна А, а это означает, что при грубой поверхности объекта целесообразно использовать объективы с малой числовой апертурой А.
Методы микроскопического анализа. Структуру препарата можно различить, если разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет, либо отличаются одна от другой (или от среды)
показателями преломления. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, прошедших через различные участки препарата, отчего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения, применяемые в световой микроскопии, выбираются с учетом характера и свойств изучаемого препарата. Рассмотрим некоторые из них. Метод светлого поля в проходящем свете. Это наиболее распространенный метод исследования прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими) частицами и деталями. Частицы поглощают и отчасти рассеивают падающий на них свет, что и обусловливает, согласно дифракционной теории,
возникновение изображения. Указанный метод может быть полезен и при неабсорбирующих объектах, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть пучка не попадает в объектив. В этом случае свет должен падать перпендикулярно к освещаемому препарату. Косое освещение. В некоторых случаях для усиления контрастности изучаемых деталей свет направляется на объект под некоторым углом. Эффект косого освещения достигается либо смещением линз конденсора относительно оптической оси, либо смещением источника света вне микроскопа и освещением образца снизу из-под линз объектива. Вследствие того, что большинство линз объектива имеет небольшое рабочее расстояние, этот метод применим только при работе с малыми увеличениями, когда используются объективы с большим фокусным расстоянием.
Темнопольное освещение. Данный метод применяется также для усиления контрастности структурных деталей. На пути светового пучка ставится так называемый конденсатор темного поля,
в результате чего свет непосредственно в объектив не попадает,
и изображение формируется только светом, рассеянным микрочастицами препарата. В поле зрения на темном фоне видны светлые изображения частиц, отличающихся от окружающей среды показате-
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

585
лями преломления. Часто детали структуры, которые в светлом поле имеют слабую контрастность, становятся резко контрастными в темном поле. Метод исследования в свете люминесценции. Под микроскопом в этом случае изучается зелено-оранжево-желтое свечение объекта,
возникающее при освещении специальными люминесцентными осветителями, дающими сине-фиолетовый светили УФ-излучение.
При этом увеличивается предельная разрешающая способность микроскопа, пропорциональная 1/
?, и расширяются возможности микроскопических исследований. Это происходит в результате того,
что элементы многих веществ, прозрачные в видимом свете, поглощают излучение, близкое к ультрафиолету, и легко различаются.
Например, клетки эпидермиса семян обычно имеют сине-голубое свечение механические элементы коры — зеленовато-голубое или же зеленое свечение отчетливо видны пыльцевые зерна цветков,
имеющих желтое или голубоватое свечение, и т. п.
Люминесцентная микроскопия применяется в фармакогнозии для определения подлинности лекарственного растительного сырья. Преимуществом метода является возможность его применения для изучения сухого растительного материала, из которого приготовляют толстые срезы или препараты порошка и рассматривают их впадающем свете при освещении препаратов сверху,
через опак-иллюминатор или объектив. Метод исследования в поляризованном свете. С помощью анализаторов и компенсаторов, которые включены в оптическую систему (например в приставке, называемой столиком Федорова),
изучается угол поворота плоскости поляризации света, прошедшего через препарат. Метод применяется для изучения анизотропных объектов, каковыми являются некоторые животные и растительные ткани и клетки. Этот метод особенно эффективен при проведении анализа органических фармацевтических препаратов и ядов, основанного, в свою очередь, на комбинации двух методов микрокристаллоскопического и кристаллооптического. В основу применения микрокристаллоскопического метода положена идентификация веществ по внешнему облику (форма, цвет) и кри- сталлооптическим константам кристаллов — продуктов реакций исследуемого вещества стем или иным реактивом. Микроскопический метод базируется на использовании явления двойного лучепреломления оптически анизотропных кристаллов, изучаемого в курсе общей физики. Признаками идентификации являются морфологические характеристики кристалликов — продуктов реакций форма, окраска, размера также кристаллооптические константы показатели преломления, знак удлинения, угол погасания,
плеохроизм (изменение окраски кристалла в зависимости от направления световых колебаний) и др 18.7. Микроскопический анализ

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ). Работа электронного и оптического микроскопов основана на разных физических явлениях, но общность их функций делает обоснованным его рассмотрение в данном разделе.
В электронном микроскопе изображение формируется ускоренными в электрическом поле электронами, проходящими сквозь исследуемый объект. Здесь также используется система электронных линз (объектив, конденсор и другое, фокусирующих пучок электронов. Электронные линзы — это система электрических и магнитных полей, изменяющих траекторию движения электронов. Для построения изображения предмета в электронной оптике справедливы соотношения, рассмотренные в световой оптике.
В отечественных микроскопах достигаются увеличения порядка 000, но практически рабочим увеличением является 20 Особые требования в электронной микроскопии предъявляются к приготовлению препаратов. Объекты исследования должны быть очень тонкими, порядка 0,1 мкм для их приготовления требуются специальные микротомы и особые методы фиксирования ультратонких срезов. Как современный метод исследования ПЭМ
имеет два основных достоинства высокое разрешение визуального изображения (меньше или порядка 10 нм) и возможность регистрации электронной микродифракции (ЭМД) на выбранном участке объекта. Сочетание анализа светло- и темнопольного изображений с расчетом картин ЭМД позволяет получать детальную информацию о кристаллической структуре, включая морфологию надмолекулярных образований и кристаллографические параметры. В последнее время наблюдается заметный подъем в области микродифракционных исследований органических полимеров и модельных соединений в целях проведения полного структурного анализа с определением конформации цепи и упаковки макромолекул в кристалле.
По сравнению с рентгенографическим методом ЭМД имеет ряд принципиальных преимуществ. Так, особенности взаимодействия электронов с веществом приводят к тому, что электронограммы могут содержать значительно больше рефлексов, чем рентгенограммы, а интенсивности их враз выше. К препаративным преимуществам относится возможность исследования микроколи- чества вещества. Последнее особенно важно для тех полимеров,
которые неспособны к ориентационной вытяжке, в связи с чем исследования структуры рентгенографическим методом затруднены. Кроме того, электронограммы обладают более высоким разрешением рефлексов по сравнению с рентгенограммами, что позволяет точнее определять период идентичности макромолекулы и другие параметры.
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

В качестве примера успешного использования методов ПЭМ можно привести изучение новых кремнийорганических соединений (Незамещенный полидифенилсилоксан является термостойким высо- кокристаллическим полимером сочень низкой растворимостью в обычных органических растворителях. Он не обладает способностью к ориентации, в связи с чем его рентгеноструктурный анализ до сих пор не проведен. Структурные данные, полученные в результате всестороннего изучения представителей этого класса полимеров, были использованы не только для построения структурной модели макромолекулы, но и при создании технологии получения и переработки этого класса материалов.
При переходе в режим изображения объекта электронная микроскопия позволяет проводить визуальный структурный анализ,
строить качественные модели исследуемых объектов, позволяющие дать биохимическую интерпретацию их структуры. Целью изучения биомакромолекул с помощью ПЭМ является получение достоверного трехмерного распределения плотности объекта.
Несмотря на значительные преимущества (например возможность работать с некристаллизующими объектами, метод ПЭМ
не лишен недостатков. Одна из основных проблем применения
ПЭМ биомакромолекул — значительная сложность приготовления объектов исследования и их высокая радиационная неустойчивость объекты быстро разрушаются под электронным пучком.
Другая проблема — низкая контрастность изображений, обусловленная тем, что биологические объекты состоят преимущественно из легких атомов. Преодоление этих трудностей стимулировало разработку различных методов фиксации образцов и аппаратуры для повышения радиационной стойкости объектов. Так, были разработаны методы контрастирования образцов, замещения водного окружения объекта гидрофильными нелетучими молекулами и сверхбыстрого охлаждения образцов до низких температур. Установлено, что сопротивление облучению зависит от химической структуры образцов. Так, например, накопление ароматических фрагментов в мономерном звене повышает их устойчивость и позволяет эффективно применять метод ЭМД.
К особому классу задач, решаемых методом ПЭМ, можно отнести аналитический метод контроля размеров частиц латексных систем. В дополнение к оптической микроскопии ПЭМ позволяет разрешать наименьшие частицы латексов (размером 100 нм и меньше. Преимуществом ПЭМ является также и то, что с ее помощью определяется не только размер частиц, их распределение по размерам, но и форма частиц, что невозможно при других методах исследования 18.7. Микроскопический анализ

Для оценки диаметров коллоидных частиц и функции распределения размеров частиц часто используется растровая электронная микроскопия.
Точность электронной микроскопии как аналитического метода определения размеров частиц можно считать равной ±3 %, что соответствует ошибке в определении монодисперсионных латексов. При оценке точности измерений очень важной является техника препарирования, поскольку неправильное ее применение может давать погрешности, намного превышающие экспериментальные возможности метода. Как разновидность электронной микроскопии существует метод растровой электронной микроскопии (РЭМ), который позволяет по образцам небольшого размера изучать структурные характеристики в широком диапазоне увеличений (от оптических до электронно-оптических). Растровый электронный микроскоп при достаточно высоком разрешении дает возможность работать при уве- личениях 20—100 и увеличивать глубину фокуса враз. В последнее время метод РЭМ успешно применяется в биологии и химии.
С помощью специальных приставок (газовых микрокамер) и крио- методов можно изучать жидкие и газообразные объекты, неустойчивые к воздействию высокого вакуума, в частности влажные биологические препараты.
Метод РЭМ позволяет успешно решать следующие задачи проведение количественного анализа микростроения твердотельных объектов (таблеток, порошков, гранул и др исследование пористости объектов с размером от 20 нм до десятков микрометров изучение морфологии поверхности, то есть исследование роста синтетических и биологических кристаллов, выращиваемых из растворов выявление различных отложений (загрязнений) поверхности лекарственных препаратов и упаковок оценка размеров частиц полидисперсных систем. Метод РЭМ
достаточно информативен при изучении структурообразования волокнистых систем, которые используются в качестве мембран в процессах обратного осмоса и при ультрафильтрации в медицинской практике 18.8. ПОЛЯРИМЕТРИЯ
Поляриметрия — метод исследования, основанный на измерении угла поворота плоскости поляризации линейно-поляризован- ного света при его прохождении через оптически активные веще-
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

589
ства. Оптическая активность чрезвычайно чувствительна к любым изменениям строения вещества и к межмолекулярному взаимодействию, поэтому она может дать ценную информацию о природе заместителей в молекулах как органических, таки комплексных неорганических соединений. Измерение удельного вращения проводится либо для оценки чистоты оптически активного вещества, либо для определения его концентрации в растворе.
Еще более характерным свойством, дающим больше информации, чем удельное вращение при определенной длине волны, является дисперсия оптического вращения (изменение оптического вращения в зависимости от длины волны) соединения, для которого оптическое вращение может быть измерено в области не очень интенсивной полосы поглощения. Метод дисперсии оптического вращения широко используется при структурных и стереохимических исследованиях, часто в качестве «фингерпринтного» метода.
Физические основы метода. Электромагнитная волна (в частности свет) называется линейно- или плоскополяризованной, если колебания ее электрической компоненты — вектора напряженности поля


E
лежат водной плоскости, которая называется плоскостью поляризации. При прохождении поляризованного света через некоторые вещества, которые называют хиральными (их молекулы не имеют никаких элементов симметрии, кроме поворотной оси го порядка, наблюдается вращение плоскости поляризации.
Такие вещества называются оптически активными. Большинство органических веществ хиральны и, следовательно, оптически активны. Их оптическая активность обусловлена асимметричным строением молекул, существующих в двух формах — правой и «левой».
Молекулы правого и левого оптически активного вещества являются оптическими изомерами они представляют собой зеркальные отражения друг друга. Физические и химические свойства чистых оптических изомеров совершенно одинаковы при отсутствии какого-либо асимметричного агента, реагирующего на зеркальную асимметрию молекул. Продукт химической реакции безучастия такого агента — всегда смесь оптических изомеров в равных количествах — это так называемый рацемат. Физические свойства рацемата и чистых оптических изомеров часто различны.
Правые и левые молекулы можно различать, например, в химических реакциях с участием асимметричных агентов или микроби- ологически.
В зависимости от природы оптически активного вещества вращение плоскости поляризации может иметь различные направление и угол (левовращающее и правовращающее вещество. Угол вращения в растворах зависит от природы растворителя и концентрации. Поэтому поляриметрия в химикофармацевтической про 18.8. Поляриметрия

590
мышленности широко применяется для измерения концентрации растворов, особенно сахаров.
Чтобы понять природу поляризации света, в курсе физики изучается эффект двойного лучепреломления света, проходящего через кристаллические поляроиды. Для химиков полезно знать, что аналогичный эффект можно наблюдать и для текущих жидкостей,
состоящих из текстурированных молекул (например, нитевидных,
палочкообразных). Двойное лучепреломление при течении позволяет сделать выводы относительно формы, размеров молекул некоторых биологически важных соединений (например белков).
Физическая природа двойного лучепреломления обусловлена анизотропией структуры вещества относительно распространения света. При течении нитевидные частицы расположены параллельно в результате этой упорядоченности скорость распространения света зависит от плоскости его колебаний. Скорость света имеет одно значение, когда плоскость поляризации параллельна упорядоченным молекулами другое когда она перпендикулярна к ним. Колебания электромагнитных волн (света) могут быть представлены в виде двух компонент электрической


E и магнитной расположенных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Если эти две компоненты распространяются с различной скоростью то показатели преломления среды для них отличаются, и поэтому
«составляющие» света расходятся в ней естественный свет в среде разделяется на два перпендикулярных плоскополяризованных луча.
Двойное лучепреломление можно наблюдать также в тканях, имеющих волокнистую структуру или другое упорядоченное строение. Растворы или жидкие вещества, предназначенные для измерения угла вращения, должны быть прозрачными.
Технически более сложной, но и более информативной для изучения строения веществ является спектрополяриметрия: измерение вращательной дисперсии, то есть изменения угла вращения при изменении длины волны света. Физика процессов взаимодействия света с веществом остается той же, что и при использовании монохроматического излучения.
Для определенных соединений (например для кетонов) получают характерную кривую (эффект Коттона) с резко выраженными максимумами и минимумами. Однако число функциональных групп оптически активных соединений с практически измеримыми кривыми эффекта Коттона ограничены по ряду причин. Во- первых, для большинства соединений эффект обнаруживается при длинах волн, меньших 250 мкм, то есть в пределах возможностей доступных в настоящее время приборов во-вторых, эффектна- блюдается в максимуме поглощения света, то есть интенсивность измеряемого света может оказаться недостаточной для измерения оптического вращения.
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

И все жена основании кривых дисперсии оптического вращения получена важная информация о структурных соотношениях в кетонах и альдегидах, нитросоединениях, некоторых ароматических соединениях, эфирах и др. В ряде случаев кетонные и эфирные группы, не различаемые по спектрам поглощения, легко удается обнаружить по кривым дисперсии оптического вращения, поскольку кетоны в области мкм дают эффект Коттона, а эфиры — только плавные кривые дисперсии. Этот метод дает возможность определять относительные и абсолютные конфигурации молекул сформулировать предположения о структурных подобиях соединений по сути химически не коррели- руемых; изучать структурные особенности природных соединений,
родственных стероидам.
Определение оптического вращения. Для измерения угла вращения плоскости поляризации монохроматического света в оптически активном веществе используется прибор, называемый поляриметром (дисперсию оптической активности измеряют спектрополяри- метрами. Двумя важнейшими частями поляриметров являются поляризатор и анализатор, каждый из которых обычно представляет собой призму Николя николь соответствующим образом граненный, разрезанный и склеенный кристалл испанского шпата. Как видно из рис. 18.8.1, необыкновенный луч, пройдя через николь как через плоскопараллельную пластинку, распространяется в первоначальном направлении и его можно использовать в качестве плоскополяризованного света. Обыкновенный луч претерпевает полное внутреннее отражение и отклоняется в сторону.
Две такие призмы в приборе устанавливаются одна за другой
(поляризатор и анализатор при вращении анализатора вокруг падающего луча как вокруг оси интенсивность света, прошедшего через анализатор, периодически изменяется (закон Малюса). Если главные плоскости поляризации анализатора и поляризатора совпадают, свет проходит через эту оптическую систему, и поле зрения становится светлым. При повороте анализатора на 90
° вокруг направления падающего света — свет практически не проходит через него, и поле зрения становится темным.
Если поместить между скрещенными николями раствор оптически активного вещества, тотемное поле зрения посветлеет, а чтобы оно снова потемнело, анализатор необходимо повернуть на определенный угол. Угол поворота анализатора равен углу поворота плоскости поляризации раствором.
Рис. 18.8.1. Ход обыкновенного (о) и необыкновенного (е) лучей в призме Николя 18.8. Поляриметрия

В поляриметрах, построенных по схеме полутеневых приборов,
измерение сводится к визуальному уравниванию яркостей двух половин поля зрения прибора и последующему считыванию показаний по шкале вращений, снабженной нониусом. Подобная методика визуальной регистрации обладает достаточно высокой чувствительностью, что позволяет применять полутеневые поляриметры в различных целях.
При измерении угла вращения
? прежде всего устанавливают нулевую точку отсчета и определяют поправку прибора с трубкой,
заполненной чистым растворителем (при работе с растворами) или пустой трубкой (при работе с жидкими веществами, после чего проводят основное измерение, корректируя его с учетом поправки.
Угол вращения
? (или отклонения плоскости поляризации от начального положения) зависит от природы оптически активного вещества, длины пути поляризованного света в оптически активной среде и длины волны света. Для растворов угол
? зависит от
В обычно используемых в лабораторной практике полутеневых поляризаторах плоскости поляризации двух их половин Р и Р
2
составляют между собой малый угол 2
?. Если плоскость анализатора АА перпендикулярна биссектрисе 2
? (риса, обе половины и II поля зрения имеют одинаковую полутеневую освещенность. При малейшем повороте анализатора относительная освещенность I и II половины поля зрения резко изменяется
(рис. 18.8.2, б, в).
а
б
в
I
II
Р
1
Р
2
A
2a
A
2a
I
II
Р
1
Р
2
A
A
2a
I
II
Р
1
Р
2
A
A
Рис. 18.8.2. Полутеневые поляризаторы:
Р
1
и Р — плоскости поляризации двух половин поляризаторов 2? — малый угол между ними;
а — обе половины I и II поля зрения имеют одинаковую полутеневую освещенность припер- пендикулярном расположении плоскости анализатора АА и биссектрисы угла 2?;. б ив изменение относительной освещенности I и II половин поля зрения, вызванное поворотом анализатора
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

природы растворителя (поэтому, приводя значение удельного вращения, необходимо указывать растворитель) и концентрации оптически активного вещества.
Для сравнительной оценки способности различных веществ вращать плоскость поляризации света вычисляется удельное вращение это константа оптически активного вещества. Значение для растворов и жидких веществ вычисляется по известным из курса физики формулам, однако следует знать, что удельное вращение определяется либо в пересчете на сухое вещество, либо из высушенной навески, о чем должно быть соответствующее указание.
Измерение угла вращения проводят либо в целях оценки чистоты вещества в растворе или жидкого вещества, находя удельное вращение, либо для определения его концентрации в растворе. Поскольку величина [
?] постоянна в определенном интервале концентраций сто возможность использования формулы ]
?
=
c где l — толщина слоя, ограничивается этим интервалом.
Точность определения угла вращения на поляриметрах с визуальной регистрацией составляет ±0,02 град. Автоматические поляриметры с фотоэлектрической регистрацией сравнения интенсивностей поляризованного света и с использованием лазеров дают точность измерения порядка 10
–7
град.
Химикам-органикам давно известно, что оптическая активность вещества в молекулярном состоянии является его характеристикой. В современной химической литературе рассматриваются результаты исследований, позволяющих установить связь между оптической активностью и молекулярным строением и применить ее при решении структурных задач 18.9. ТЕРМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Термоаналитические методы служат для исследования химических реакций и физических превращений, происходящих под влиянием температуры в химических соединениях или в случае многокомпонентных систем, между отдельными соединениями. Термические процессы, будь это химические реакции, изменение состояния или фазовые переходы, сопровождаются всегда более или менее значительным изменением внутренней теплоемкости системы. Превращение влечет за собой поглощение теплоты (эндотермическое превра-
§ 18.9. Термический анализ ?1000

594
щение) или выделение теплоты (экзотермическое превращение. Эти тепловые эффекты могут быть с большой чувствительностью обнаружены методом дифференциально-термического анализа (ДТА). Превращение во многих случаях связано также с изменением массы,
которая, в свою очередь, может быть определена с большой точностью при помощи термогравиметрического метода. Эти два способа являются классическими и используются в химии, в частности при производстве лекарственных средств, уже более 50 лет.
Следует отметить, что практическое применение методов термического анализа почти не ограничено, и немногие методы инструментального анализа можно так многосторонне применять в научно- исследовательской работе и для промышленных анализов, как термический анализ За некоторыми редкими исключениями каждое соединение под влиянием температуры подвергается физическими химическим превращениям, а значит, может быть исследовано с помощью этого метода.
Термические методы позволяют ответить и на вопрос о значениях сил, связывающих ионы или молекулы в веществе, так как температура превращения какого-либо соединения является одновременно и мерой измерения сил, действующих между атомами и молекулами вещества, ведь превращение может произойти только в том случае, если данному материалу сообщить соответствующую тепловую энергию.
Современные приборы для измерения энтальпии исследуемого вещества основаны на принципе измерения температур с помощью термопар, включенных по так называемой дифференциальной схеме (рис. 18.9.1). Обычно в установках ДТА используются три термопары. Одной из термопар 1 измеряется температура печи, а остальными двумя термопарами и 3, включенными навстречу друг другу, измеряется разность температур между печью и испытуемым веществом при помощи градуированного по температуре милливольтметра и чувствительного гальваномет- ра.
Рабочие точки термопар 1,
2, измеряющие температуру печи, окружают инертным веществом, тождественным сточки зрения теплопередачи испытуемому веществу. С мо-
Рис. 18.9.1. Включение термопар по дифференциальной схеме — термопара для измерения температуры печи и 3 — термопары для измерения разности температур между печью и испытуемым веществом — милливольтметр, градуированный по температуре Г — гальванометр
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

мента начала реакции в исследуемом веществе разность потенциалов термопары 3, находящейся в нем, либо остается неизменной, либо начинает быстро расти, атак как эта разность уже не будет компенсироваться равномерно увеличивающимся напряжением термопары, то гальванометр даст показания, соответствующие направлению и значению разности температур.
Кривая ДТА имеет вид, изображенный на рис. 18.9.2. Горизонтальная пунктирная линия соответствует отсутствию вис- пытуемом веществе каких-либо термических превращений. Кривые ДТА условно строят так, что эндотермический максимум откладывается вниз, а экзотермический вверх от основной линии.
На кривую ДТА для градуировки по температуре обычно накладывается график (Т ) зависимости температуры печи (термопары 1 ) от времени. Площади, ограниченные пиками кривой ДТА и основной линией, используются для определения количественных соотношений, однако точность таких оценок невелика, примерно 5—10 Значительно большую точность дает другая ветвь термоаналитичес- ких методов — термогравиметрия.
Термогравиметрия (ТГ) развивалась на основе метода периодического нагревания до все более высоких температур и взвешивания. Сведя полученные результаты в координатную систему масса температура, по существу получим термогравиметрическую кривую (кривая ТГ). На практике для повышения точности метода используют термовесы. Испытуемое вещество помещают в тигле,
опирающемся на коромысло весов, и равномерно повышают температуру тигля с помощью электрической печи, температуру которой, в свою очередь, измеряют, используя находящиеся в ней термопары. Изменения веса регистрируются автоматически, и кривая
ТГ строится в зависимости от времени или от температуры печи (так как повышение температуры печи происходит равномерно. На основании кривой ТГ можно судить о том, каким образом изменяется при нагревании вес испытуемого вещества, то есть производить точные стехиометрические или процентные расчеты (рис. Следует отметить, что если две реакции следуют друг за другом или перекрываются, то метод ТГ оказывается неэффективным, посколь-
Рис. 18.9.2. Кривая ДТА (I ) и наложенный график зависимости температуры печи от времени (II )
§ 18.9. Термический анализ

ку оценка кривой ТГ становится затруднительной и неточной (на кривой ТГ не будет ярко выраженных ступенек).
Метод дифференциальной термогравиметрии позволяет устранить указанные трудности оценки кривой
ТГ. Для реализации его на концах коромысла весов укрепляется по одному тиглю для испытуемого вещества. В этих тиглях помещают одинаковое повесу количество вещества и нагревают их с помощью точно регулируемых печей так, чтобы температура одного тигля отставала от другой настрого фиксированный параметр например СВ результате этого тождественные реакции в тиглях смещаются относительно друг друга во времени. Таким образом,
метод дифференциальной термогравиметрии подобен методу ДТА.
Точность описанного метода во многом зависит от одинаковой степени уплотнения исследуемого вещества в обоих тиглях, от строгого соблюдения постоянной разницы температур между тиглями и ряда других факторов.
Метод деривативной термогравиметрии (ДТГ) лишен перечисленных недостатков. Дериват о граф прибор для термического анализа, позволяющий при изменении температуры с заданной скоростью одновременно регистрировать температуру вещества и его массу, а также скорость изменения обоих этих величин. Графическое дифференцирование является трудоемкими неточным, поэтому в современных дериватографах в основе определения дифференциальной кривой ТГ лежит явление электромагнитной индукции,
использование которого позволяет значительно увеличивать чувствительность, то есть регистрировать самые незначительные изменения массы, не фиксируемые с помощью простых термовесов (рис. На одном плече коромысла термовесов 2 находится помещенный в печь тигель с исследуемым веществом 1, а на другом — подвешена катушка 4 с большим числом витков. Катушка размещена в однородном поле двух подковообразных магнитов 5 и подключена к клеммам гальванометра 3. При отклонении от положения равновесия катушка приходит в движение относительно силовых линий магнита ив ней индуцируется ток, причем ЭДС индукции пропорциональна скорости движения. Практика показывает, что анализ кривой ТГ
значительно облегчается при одновременной записи кривой ДТГ и позволяет полностью оценить процессы, которые происходят вис- пытуемом образце при термических превращениях, так как процес-
Рис. 18.9.3. Термогравиметрическая кривая
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

597
сы, плотно идущие друг за другом и смешивающиеся на кривой ТГ, на дерива- тивной кривой четко раз- личимы.
При помощи дифференциального термического анализа легко установить направление и изменение энтальпии,
связанной с химическими реакциями, происходящими в исследуемом материале под влиянием температуры. С другой стороны, посредством тер- могравиметрических изменений можно точно определить ход изменения массы пробы при испытании. Одновременное применение обоих методов дает возможность получить дополнительную информацию о химических реакциях и полиморфных превращениях в исследуемом веществе.
Рассмотрим некоторые вопросы дериватографии, которые необходимо учитывать химику-фармацевту, использующему дерива- тограф при создании новых лекарственных препаратов.
Кривые, записанные в зависимости от времени, должны оцениваться с учетом изменения температуры пробы, то есть эксперимент будет проведен правильно, если наряду с кривыми ДТА,
ДТГ, ТГ будет записана и кривая Та дериватограммы рассматриваются по температурной шкале, установленной на основании кривой Т. Причем данное превращение характеризуется в случае эндотермической реакции температурой экстремума кривых ДТА
и ДТГ, а в случае экзотермических превращений — температурой начала взаимодействия.
Протекание термических реакций в пробе в значительной мере зависит от условий эксперимента и определяется в основном тремя факторами теплопроводностью исследуемых веществ, их теплоемкостью и равновесием химических реакций. Влияние остальных факторов либо незначительно, либо сводится к указанным трем факторам (например, влияние размеров частиц вещества, скорости нагревания и т. п.).
Если бы химические реакции (например реакция разложения)
происходили бы моментально и полностью, когда проба достигает температуры разложения, на кривых ДТА и ДТГ появлялись бы изменения в виде острых игольчатых пиков. А количество поглощенной
Рис. 18.9.4. Термовесы
§ 18.9. Термический анализ

или выделенной теплоты характеризовалось бы высотой пика и не приводило бык расширению пиков. Наличие определенной теплопроводности и теплоемкости исследуемого вещества приводит к расширению эндо- и экзотермических максимумов (рис. 18.9.5). При термоана- литических исследованиях часто встречаются соединения, разлагающиеся на твердые и газообразные составные части.
За редким исключением, сюда относятся все неорганические соединения. Поэтому следует учитывать, в какой степени влияют условия эксперимента на характеристические температуры и навесь ход реакций. Практика показывает, что существенное влияние оказывают следующие факторы атмосфера печи,
газовая атмосфера пробы, форма держателя пробы, степень уплотнения пробы, количество вещества в пробе, скорость повышения температуры печи и др.
Кривая ДТА используется в первую очередь при качественной оценке дериватограммы, и только в исключительных случаях с ее помощью вычисляют изменения энтальпии по площади, лежащей под максимумом кривой. Определение состава исследуемого материала по размерам этой площади нецелесообразно, так как по кривым
ТГ и ДТГ содержание составных частей можно определить на несколько порядков точнее. Однако нужно помнить, что кривая ДТА
обусловлена тепловыми эффектами не только химических взаимодействий, но и физических превращений. Таким образом, для идентификации какого-либо неизвестного соединения кривая ДТА дает значительно больше информации, чем кривые ТГ и ДТГ. Кроме того,
необходимо учитывать, что характеристические температуры с большей точностью определяются по кривым ДТГ, чем по кривым ДТА,
основная линия кривой ДТГ всегда хорошо определяется.
При сопоставлении кривых ДТА и ДТГ возможны три ситуации) если кривая ДТГ не изменяется, а изменяется только кривая ДТА,
то это значит, что в пробе произошло какое-то физическое превращение, изменение фазового состояния, перекристаллизация или химическая реакция, не сопровождающаяся изменением массы, то есть обменным разложением 2) в пробе приданной температуре происходит химическая реакция, не сопровождающаяся физическими превращениями 3) обе кривые показывают изменения по их форме, то есть их ход различен. Это означает, что данный участок кривой ДТА образуется в результате сложения процессов двух или
Рис. 18.9.5. Расширение эндо- и экзотермичеких максимумов Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

нескольких химических реакций или возможны физические превра- щения.
Кривая ТГ обычно применяется для количественной оценки де- риватограммы, то есть по кривой ТГ можно с высокой точностью определить изменение массы пробы.
В настоящее время дериватограф с успехом используется для исследования лекарственных препаратов. Например, поставлена задача, определить содержание воды в лекарственных порошках и гранулах. Известно, что если таблетируемый материал содержит количество воды меньше некоторого оптимального количества, то таблетки разрушаются а если же таблетируемый материал содержит больше оптимального количества воды, то таблетки прилипают к матрицам таблеточных машин. Простейшие методы контроля содержания воды не всегда эффективны, так как вода может быть связана в испытуемом материале различными силами связи.
Например, применяемый при таблетировании в виде наполнителя молочный сахар содержит, наряду с механически связанной водой, кристаллизационную воду. При определении этих фракций возникают трудности в установлении содержания механически и адсорбционно связанной воды. Использование сушильного шкафа неприемлемо, так как в зависимости от температуры и времени сушки из пробы не удаляется даже механически связанная вода либо проба теряет часть кристаллизационной воды вследствие распада кристаллов. Метод Карла Фишера в данном случае дает надежные и точные результаты, однако при этом регистрируется только общее содержание воды, а не содержание по фракциям. По кривой же ДТГ на дериватограмме молочного сахара быстро и точно можно установить, в каком диапазоне температур молочный сахар теряет свою механически связанную воду, а в каком диапазоне кристаллизационную воду. Причем можно точно вычислить температуру, при которой эти процессы идут с максимальной скоростью, и, получив информацию о том, что разложение происходит ступенчато, определить температуры разложения промежуточных продуктов карамелизации, установить типы реакций (экзо- или эндотермическая) и т. п. Таким образом, приведенный пример показывает широкие возможности метода дериватографии для анализа новых химических соединений.
Один из вариантов дифференциально-термического анализа получил название метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Принципиальное отличие ДСК от ДТА заключается в том, что метод ДСК позволяет измерять непосредственно изменение энергии (энтальпию) в процессе плавления. При этом методе образец и эталон нагреваются или охлаждаются с одинаковой скоростью, их температуры одинаковы. Экспериментальные 18.9. Термический анализ

кривые метода ДСК представляют собой зависимость изменения энергии теплового потока от температуры. В качестве эталона используются особо чистые вещества типа индия (99,9999 %), олова и свинца. Термограмма по методу ДСК дает возможность судить о разложении вещества вовремя плавления, и, следовательно, метод применим для изучения термостойкости и обнаружения полиморфизма лекарственных веществ, для исследования полиморфных фазовых переходов. Трудно предсказать, будет ли происходить переход полиморфных кристаллических форм вовремя или после приготовления лекарственной формы, поэтому температура и энергия перехода становятся очень важными параметрами в технологии и для контроля качества лекарств 18.10. РЕФРАКТОМЕТРИЯ
Рефрактометрия — совокупность методов исследования физи- ко-химических свойств твердых, жидких и газообразных веществ на основании измерения их показателей преломления света.
Рефрактометрия широко применяется в физической химии для определения концентрации растворов, состава и структуры вещества установления подлинности и чистоты вещества контроля качества и состава различных продуктов в химической и фармацевтической промышленности для проверки однородности твердых образцов и жидкостей. Приборы, применяемые для определения показателя преломления, называются рефрактометрами.
Физические основы метода. Для изучения основ метода рефрактометрии необходимо знание таких разделов курса общей физики, как геометрическая оптика, дисперсия и интерференция света.
На практике определяют так называемый относительный показатель преломления, то есть число, показывающее, во сколько раз скорость света в воздухе больше скорости света в испытуемом веществе. Показатель преломления зависит от длины волны (или частоты) света, при которой проводят его определение (дисперсия света, и от температуры. В растворах показатель преломления зависит также от концентрации вещества и природы растворителя.
На этих свойствах и базируется метод.
Основными методами рефрактометрии являются методы прямого измерения углов преломления света при прохождении им границы раздела двух сред методы, основанные на явлении полного внутреннего отражения света интерференционные методы.
Глава 18. Физические методы анализа лекарственных средств

Обычно измерения показателя преломления проводят на рефрактометрах типа Аббе, в основу которых положено явление полного внутреннего отражения при прохождении светом границы раздела двух сред с разными показателями преломления.
Для измерения показателя преломления п жидкости первым способом ее наливают в тонкостенную призматическую кювету или призматическую выемку в материале с известным показателем преломления n
0
(рис. При