Учебнометодическое пособие по дисциплинам Основы биотехнологии, Введение в биотехнологию
 Скачать 0.73 Mb.
|
|
2 ПРОИЗВОДСТВО БЕЛКОВ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМОВ 2.1 Целесообразность использования микроорганизмов для производства белка В соответствии с нормами питания человек должен ежедневно получать с пищей от 60 до 120 г полноценного белка. Для поддержания жизненных функций организма, построения клеток и тканей необходим постоянный синтез различных белковых соединений. Если растения и большинство микроорганизмов способны синтезировать все аминокислоты из углекислого газа, воды, аммиака и минеральных солей, то человек и животные не могут синтезировать некоторые аминокислоты (валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан и фенилаланин). Эти аминокислоты называются незаменимыми. Они должны поступать с пищей. Их недостаток вызы- вает тяжёлые заболевания человека и понижает продуктивность сель- скохозяйственных животных. В настоящее время мировой дефицит белка составляет около 15 млн.т. Наиболее перспективен микробиологический синтез. Если для крупного рогатого скота требуется 2 месяца для удвоения белковой массы, для свиней – 1,5 месяца, для цыплят – 1 месяц, то для бактерий и дрожжей – от 1 до 6 часов. Мировое производство пищевых белко- вых продуктов за счёт микробного синтеза составляет более 15 тыс. т в год. Рассмотрим пример: время удвоения кишечной палочки состав- ляет 20 мин, тогда через 20 мин из одной клетки образуется две дочер- них, через 40 мин – четыре «внучки», через 60 мин – восемь «правну- чек», через 80 мин – 16 «праправнучек». Через 10 ч 40 мин из одной бактерии будет образовано свыше 6 млрд. бактерий, что соответствует населению Земли, а через 44 ч из одной бактерии массой 1•10 -12 г обра- зуется биомасса в количестве 6•10 24 г, что соответствует массе Земли. Использование различных микроорганизмов в качестве источни- ков белка и витаминов обусловлено следующими факторами: а) возможностью использования для культивирования микро- организмов разнообразных химических соединений, в том числе отхо- дов производств; б) относительно несложной технологией производства микро- организмов, которое может осуществляться круглогодично; возможно- стью его автоматизации; 12 в) высоким содержанием белка (до 60-70 %) и витаминов, а также углеводов, липидов в микробиальных препаратах; г) повышенным содержанием незаменимых аминокислот по сравнению с растительными белками; д) возможностью направленного генетического влияния на хи- мический состав микроорганизмов в целях совершенствования белко- вой и витаминной ценности продукта. Для промышленного производства пищевых продуктов на основе микроорганизмов необходимы тщательные медико-биологические ис- следования. Такие продукты должны пройти всестороннюю проверку для выявления канцерогенного, мутагенного, эмбриотропного действия на организм человека и животных. Токсикологические исследования, усвояемость продуктов микробного синтеза – основные критерии це- лесообразности технологии их производства. Для получения белков используются дрожжи, бактерии, водо- росли и мицелиальные грибы. Преимуществом дрожжей перед другими микроорганизмами яв- ляется их технологичность: устойчивость к инфекциям, легкость отде- ления от среды благодаря крупным размерам клеток. Они способны накапливать до60 % белка, богатого лизином, треонином, валином и лейцином (этих аминокислот мало в растительных кормах). Массовая доля нуклеиновых кислот составляет до 10 %, что вредно действует на организм. В результате их гидролиза образуется много пуриновых ос- нований, превращающихся затем в мочевую кислоту и её соли, кото- рые являются причиной мочекаменной болезни, остеохондроза и дру- гих заболеваний. Оптимальная норма добавок дрожжевой массы в корм сельскохозяйственных животных составляет от 5 до 10 % от су- хих веществ. Дрожжи применяются для пищевых и кормовых целей. Преимуществами бактерий является высокая скорость роста и способность синтезировать до 80 % белка. Полученный белок содер- жит много дефицитных аминокислот: метионина и цистеина. Недос- татками являются маленькие размеры клеток и низкая их концентрация в культуральной среде, что затрудняет процесс выделения. В некото- рых бактериальных липидах могут содержаться токсины. Массовая доля нуклеиновых кислот до 16 %. Используются только для кормовых целей. Преимуществами водорослей являются высокое содержание полноценного по аминокислотному составу белка, накапливающегося в количестве 65 %, легкое выделение водорослей из культуральной среды, низкое содержание нуклеиновых кислот – 4 % (для сравнения – 13 у высших растений 1…2 %). Водоросли используются для пищевых и кормовых целей. Мицелиальные грибы традиционно используются в качестве пи- щевого продукта в странах Африки, в Индии, Индонезии, Китае и др. Накапливают до 50 % белка, по аминокислотному составу прибли- жающегося к белку животного происхождения, богаты витаминами группы В. Клеточные стенки тонкие и легко перевариваются в желу- дочно-кишечном тракте животных. Массовая доля нуклеиновых ки- слот составляет 2,5 %. С 1985 г микробиальный белок используется в пищевой про- мышленности для изготовления различных продуктов и полуфабрика- тов. В производстве пищевых продуктов рассматриваются три основ- ные формы использования микробного белка: 1) цельная масса (без разрушения клеточных стенок); 2) частично очищенная биомасса (предусматривается разруше- ние клеточных стенок и удаление нежелательных компонентов); 3) выделенные из биомассы белки (изоляты). ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) сделала заклю- чение, что белок микроорганизмов можно использовать в продуктах питания, но допустимое количество нуклеиновых кислот, вводимых вместе с белком в диету взрослого человека не должно превышать 2 г в сутки. Введение микробиального белка не вызывает отрицательных последствий, но встречается проявление аллергических реакций, желу- дочные заболевания и т.д. 2.2 Использование дрожжей В конце 19 века в Германии была разработана технология произ- водства хлебопекарных дрожжей, во время первой мировой войны дрожжи стали использоваться в качестве пищевой добавки в производ- стве супов и колбас, а также начала развиваться технология производ- ства кормовых дрожжей. До сих пор культивирование пивных дрожжей Saccharomyces serevisiae (carlsbergensis) остается важным резервом пищевого белка и витаминов. Организм человека усваивает свыше 90 % всех питатель- ных веществ, содержащихся в них. В составе этих дрожжей обнаруже- но 14 витаминов, особенно они богаты витаминами группы В. При переработке биомассы в пищевой белок ее тщательно очи- щают. Сначала разрушают стенки дрожжевых клеток путем механиче- ской, щелочной, кислотной или ферментативной обработки с после- 14 дующей экстракцией гомогенной дрожжевой массы подходящим орга- ническим растворителем. Затем щелочным раствором растворяют бел- ки, и белковый раствор отделяют от клеточной массы диализом. Очи- щенные от низкомолекулярных примесей белки осаждают и использу- ют в качестве белковых добавок в различные пищевые продукты – со- сиски, колбасы, паштеты, мясные начинки. Также сухой белок можно текстурировать. Некоторые дрожжевые клетки (родов Candida, Rhodotorula, Torulopsis, Trichosporon) в качестве источника углерода для роста спо- собны использовать неразветвленные углеводороды с числом от 10 до 30 углеродных атомов в молекуле. В основном они представлены жид- кими фракциями углеводородов нефти с температурой кипения от 200 до 320 ºС. Первоначально проект возник из необходимости утилизиро- вать парафины, остающиеся в количестве от 10 до 15 % после очистки газойля. В питательную среду добавляют макро- и микроэлементы, витамины и аминокислоты. В России завод по производству кормовых дрожжей на парафинах нефти был построен в 1971 г. (его продуктив- ность составила около 1 млн. т в год). Высушенная белковая масса гра- нулируется и используется как белково-витаминный концентрат в кор- мопроизводстве. Хорошим субстратом для выращивания кормовых дрожжей ро- дов Torula, Kluyveromyces является молочная сыворотка. В 1 т молоч- ной сыворотки содержится около 10 кг белка и 50 кг лактозы. Методом ультрафильтрации белки отделяют, а раствор лактозы используют для культивирования дрожжей. В качестве источников углерода дрожжевые клетки могут ис- пользовать и низшие спирты – метанол и этанол, получаемые из при- родного газа или растительных отходов. При этом дрожжевая масса содержит больше белков (56…62 % от сухой массы) и меньше вредных примесей (производных бензола, D-аминокислот, аномальных липи- дов, токсинов, канцерогенов), чем кормовые дрожжи, выращенные на парафинах нефти. Для выращивания дрожжей на гидролизатах растительного сы- рья используются Candida arboreaиCandida utilis, они применяются для пищевых целей и используются в качестве белковых добавок к различным продуктам. Например, в США на основе Candida utilis про- изводят торутеин, который добавляют в продукты питания, после чего они считаются диетическими с высоким содержанием протеина. 15 2.3 Использование бактерий Известно более 30 видов бактерий, которые могут быть приме- нены в качестве источников полноценного кормового белка. Источником углерода при культивировании бактерий могут слу- жить природный и попутный газы, водород, а также спирты – метанол, этанол, пропанол. Чаще всего на газовых питательных средах выращиваются бак- терии рода Methylococcus, способные утилизировать от 85 до 90 % ме- тана в специальных ферментерах. Однако производство кормового белка на газовых средах достаточно дорого. Более широко применяется технология выращивания бактерий на метаноле, который легко полу- чают путём окисления метана. Чаще всего используют бактерии родов Methylomonas, Methylophilus, Pseudomonas. Концерном ICI выпускает- ся кормовой препарат прутин. В России – меприн. В этом препарате содержится до 74 % белков (от сухого вещества), до 5 % липидов, 10 % минеральных веществ, от 10до 13 % нуклеиновых кислот. К числу бактерий с высокой интенсивностью синтеза белков сле- дует отнести водородокисляющие бактерии, способные накапливать до 80 % белка (в расчёте на сухое вещество). Для их культивирования в газовой среде должно содержаться от 70 до 80 % водорода, от 20 до 30 % кислорода, от 3 до 5 % углекислого газа. Производство может быть организовано вблизи химических предприятий. 2.4 Использование водорослей Уже в 1521 г, после завоевания Мексики, испанец Бернал Диаз дель Кастильо сообщал, что ацтеки употребляют в пищу диковинные пирожки, похожие на сыр. На озере Чад (Африка) туземцы племени канембу употребляют в пищу клубки сине-зеленых водорослей. Для получения кормового белка используют одноклеточные во- доросли Chlorella и Scenedesmus, сине-зеленые водоросли (цианобак- терии) Spirulina (Spirullina platensis, Spirullina getleri), способные синте- зировать белки из углекислого газа, воды и минеральных веществ за счёт энергии солнечного света. Для своего развития водоросли нужда- ются в определенных режимах освещения и температуры и в больших объёмах воды. Обычно их выращивают в естественных условиях юж- ных регионов и бассейнах открытого типа (Мексика, Чад, Нигерия, Камерун, Италия, Япония, Израиль, Узбекистан и др.). Водоросли хло- релла и сценедесмус нуждаются в нейтральной среде, их клетки имеют достаточно плотную целлюлозную стенку, в результате чего хуже пе- 16 ревариваются в организме животных, чем спирулина, которую выра- щивают в щелочных озёрах. С 1 га водной поверхности можно получать до 70 т сухой био- массы в год, что превышает выход биомассы при возделывании пше- ницы, риса, сои, кукурузы. Содержание белков в клетках хлореллы и сценедесмуса состав- ляет около 55 % (в пересчете на сухое вещество), а в клетках спирули- ны – 65 %. Водоросли хорошо сбалансированы по аминокислотному составу (кроме метиотина), в них содержится довольно много полине- насыщенных жирных кислот и β-каротина. При скармливании спирулины животным не обнаружено анома- лий и патологических эффектов, обеспечивается норма скорости роста. Белковая масса из клеток водорослей поступает в продажу в виде суспензии, сухого порошка или пастообразного препарата. Процесс отделения клеток водорослей от массы воды – наиболее трудоёмкая стадия. 2.5 Использование микроскопических грибов Микроскопические грибы рода Rhizopus sp. используют для твердофазной ферментизации соевых бобов. Через три дня мицелий гриба разрастается и связывает бобы в корж, содержащий до 40 % бел- ка. В Индонезии такой корж жарят и используют в супах как замени- тель мяса. Такой продукт называют «темпех». Подобным образом в странах Африки и Востока ферментизируют различные зернобобовые культуры. Преимуществом твердофазной ферментизации является сниже- ние энергетических затрат, недостатком – низкая продуктивность. Различные мицелиальные грибы выращивают на крахмальных (зерновых) материалах, кожуре цитрусовых, соломе, отрубях, шелухе. Используют их либо для обогащения белками кормов, либо из полу- ченной биомассы выделяют ферменты. Для получения пищевого продукта микопротеина культивируют гриб Fusarium graminearum. Его выращивают на дешевом глюкозном сиропе, полученном путём гидролиза пшеничного или кукурузного крахмала. Микопротеин хорошо переваривается. Ему придают конси- стенцию и аромат мяса, ветчины, кур, рыбы. Продукт долго сохраняет аромат и не даёт усушки в процессе кулинарной подготовки. Промыш- ленно выпускается в Великобритании. 17 3 МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСТРУИРОВАНИЯ IN VIVO 3.1 Регуляция метаболизма в микробной клетке Каждое из множества разнообразных веществ создаётся в клетке в строго необходимых для роста пропорциях в результате фермента- тивных реакций. Координация химических превращений, обеспечи- вающая экономичность метаболизма, осуществляется у микроорганиз- мов тремя отдельными механизмами: – регуляцией активности ферментов, в том числе ретроингиби- рованием; – регуляцией объёма синтеза ферментов (индукция и репрессия биосинтеза ферментов); – катаболитной репрессией. Ретроингибирование – это ингибирование по принципу обратной связи. При наличии в среде специфического субстрата начинает рабо- тать определенный фермент. Когда в результате многоступенчатых превращений накапливается конечный метаболит, то он тормозит ра- боту фермента. С помощью этого механизма конечные продукты само- регулируют свой биосинтез: Я В Б A Ю В Б А Ф Ф Ф Ф Если продуцент выращивать на среде, содержащей аналог мета- болита или антиметаболит, который не включаются в обмен веществ, то рост организмов будет подавляться. В этих условиях выживают лишь некоторые клетки. Выжившие мутанты будут обладать дефекта- ми в механизме регулирования активности фермента по принципу об- ратной связи, поэтому они не чувствительны к концентрации конечно- го продукта и способны к сверхсинтезу. Все биологические реакции осуществляются с помощью фермен- тов. Ферменты, содержащиеся в микроорганизмах, можно разделить на три группы: 1) конститутивные ферменты – ферменты, синтез которых не зависит от состава питательной среды (например, ферменты гликоли- за); 2) адаптивные или индуцибельные ферменты – ферменты, ко- торые синтезируются в ответ на появление в питательной среде индук- торов – субстратов или их структурных аналогов; 18 3) репрессибельные ферменты. Конечные продукты метабо- лизма могут вызывать замедление или остановку всех ферментов соот- ветствующего пути. Это явление называется репрессией. Я Ю В Б А Ю Э В Б А Ф Ф Ф Ф Ф Если концентрация конечного продукта снижается до опреде- ленного очень низкого уровня, то происходит дерепрессия ферментов, то есть скорость их биосинтеза увеличивается до необходимой величи- ны. Если в питательной среде присутствуют несколько различных источников углерода, то клетки микроорганизма вырабатывают фер- менты для усвоения только одного, более предпочтительного. После его полного исчерпания происходит экспрессия ферментов метаболиз- ма другого источника углерода. Это явление получило название ката- болитной репрессии. Таким образом, один источник углерода подавляет биосинтез ферментов, обеспечивающих метаболизм другого источника углерода. 3.2 Мутагенез и методы выделения мутантов В живой клетке одновременно синтезируется множество соеди- нений. В норме обмен веществ в клетке осуществляется в экономичном режиме. Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза од- ного из продуктов метаболизма. Сверхсинтез может быть осуществлен двумя путями: 1) путём спонтанного изменения генетической природы орга- низма in vivo. Селекция (то есть направленный отбор) из природных высокопродуктивных штаммов может занимать годы; 2) путём индуцированного мутагенеза. Метод основан на ис- пользовании мутагенного действия ряда химических соединений (та- ких как гидроксиламин, нитрозамины, азотистая кислота, бромурацил, алкилирующие агенты и др), ультрафиолетовых и рентгеновских лу- чей. Мутагены вызывают замены оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания инфор- мации. Проводят тотальную проверку (скрининг) полученных клонов (клон – генетически однородное потомство одной клетки). Отбирают наиболее продуктивные. В результате мутаций микроорганизма исчезает эффект ката- болитной репрессии, а индуцибельные ферменты становятся конститу- 19 тивными, то есть их экспрессия не зависит от присутствия в среде суб- страта. Если необходимо добиться накопления не конечного, а промежу- точного продукта биосинтетического пути, то это может быть достиг- нуто с помощью мутанта, у которого блокирован этап синтеза: Ф А Ф Б А Б В Такой мутант ауксотрофен, то есть растёт только при добавлении в среду вещества, служащего продуктом блокированной реакции: Ф А Ф Б Ф Г А Б В Г Д необходимо добавить в среду Однако, возможны компенсирующие мутации, ведущие к акти- визации альтернативных путей синтеза недостающих соединений: Ф А Ф Б Ф Г А Б В Г Д β γ Тогда микроорганизмы не нуждаются в добавлении вещества Г и накапливают вещество Д в сверхколичествах. На практике высокопродуктивные штаммы часто обладают дву- мя видами мутаций: в них ферменты становятся конститутивными, а они сами – ауксотрофными. |