Учебнометодическое пособие по дисциплинам Основы биотехнологии, Введение в биотехнологию
 Скачать 0.73 Mb.
|
|
6.5 Использование генетической инженерии в животноводстве Генетическую инженерию предполагают использовать с целью изменения ряда свойств организма: повышения продуктивности, рези- стентности к заболеваниям, увеличения скорости роста, улучшения качества продукции и других. Животных, несущих в своём геноме ре- комбинантный ген, принято называть трансгенными, а ген, интегриро- ванный в геном реципиента – трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трасгенным. Получение трансгенных животных предусматривает ряд этапов: приготовление раствора ДНК для микроинъекции, извлечение эмбрио- нов из донорных организмов, микроинъекция ДНК и пересадка инъе- цированных эмбрионов в яйцеводы или, после культивирования, в матку синхронизированных реципиентов. У родившегося потомства исследуют экспрессию трансгена на уровне транскрипции и трансля- ции. Для трансформирования генов используют следующие приёмы: – микроинъекцию ДНК в пронуклеус зигот или в два пронук- леуса; – введение ДНК с помощью ретровирусных векторов; – получение трансгенных химер из генетически трансформи- рованных клеток. Наиболее распространена микроинъекция. Её осуществляют с помощью специальной пипетки (внутренний диаметр около 1 мкм), количество инъецируемого раствора ДНК около 1…2 пкл (10 -9 ). После инъекции ДНК эмбрионы культивируют до момента пересадки реци- пиентам. Затем хирургическим путём эмбрионы переносят в яйцеводы. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи обычно пересаживают от 20 до 30 инъецированных зигот, причём у свиней все эмбрионы транс плантируют в один яйцевод, у мышей и кроликов – раздельно по яйцеводам. Реципиенту овец, коз и крупного рогатого скота пересажи- вают по 2…4 эмбриона раздельно по яйцеводам. Генетический анализ родившихся трансгенных животных и по- лученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появляться так назы- ваемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из од- 54 ной зиготы, но имеющих разные генотипы. Помимо клеточных линий, содержащих трансген, они имеют ещё и нетрансгенные клеточные ли- нии. Около 30 % первичных трансгенных животных – мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных. Часть мо- заик вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству. Одной из задач сельскохозяйственной биотехнологии является создание животных-биореакторов – продуцентов биологически актив- ных веществ. Интерес представляют гены, кодирующие белки каскада гормона роста: непосредственно гормон роста (ГР), релизинг-фактор гормона роста (РФ), инсулиноподобный фактор гормона роста (ИФГР). В конце 70-х годов ХХ века на основе технологии рекомбинант- ной ДНК получили гормон роста микробного происхождения. Было показано, что гормон роста ГР оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животного, как и гипофизарный ГР. Мик- робный ГР вызывал увеличение удоев на 23…31 % при дозе 13 мг в день. Инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, свиней и овец увеличивали суточный привес на 20…30 % при сокращении расхода кормов, кроме того, у свиней уменьшалось содержание жира и увели- чивалось содержание белка в тканях, что повышало качество мясопро- дуктов. Первые трансгенные мыши с геном ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конечной живой массы. Однако, у трансгенных свиней с геном ГР (1989 г.) уве- личение роста не наблюдалось. По данным Л.К. Эрнста (1996 г) у трансгенных свиней с геном релизинг-фактора ГР конечная живая масса была на 15,7 % выше по сравнению с контрольными животными. У трансгенных овец с генами ГР и РФ, несмотря на повышенный уровень ГР, скорость роста не по- вышалась. И у овец, и у свиней понижалось содержание жира. Расширяется возможность создания животных, у которых после синтеза лактозы она будет разлагаться β-галактозидазой, таким обра- зом возможно получение безлактозного молока. Другая задача сельскохозяйственной биотехнологии – создание трансгенных животных, устойчивых к заболеваниям. Ведутся работы в этом направлении, показано, что защитные механизмы от инфекцион- ных заболеваний обусловлены либо препятствием вторжению возбуди- теля, либо изменением рецепторов. В медицине трансгенные животные используются для получения биологически активных соединений, за счёт включения в клетки орга- низма генов, вызывающих у них синтез новых белков. 55 Для молочной промышленности ведётся целенаправленная трансгенная экспрессия в эпителиальные клетки молочной железы с целью выхода белков с молоком. Молочная железа – хороший проду- цент чужеродных белков, которые можно получать из молока и ис- пользовать в фармацевтической промышленности. Из молока транс- генных животных извлекают следующие рекомбинантные белки: чело- веческий белок С, антигемофильный фактор IX, α-1-антитрипсин, тка- невой плазменный антиватор, лактоферрин, сывороточный альбумин, урокиназу и химозин. Исследования проводятся на мышах. Создание клеточных культур и их выращивание в промышлен- ных реакторах, а также выведение трансгенных животных и их обслу- живание – дорогие и сложные процедуры. Однако, трансгенные жи- вотные легко размножаются, содержание их сравнительно дёшево, что делает их хорошими продуцентами разнообразных белков с низкой стоимостью. В России группой учёных под руководством Л.К. Эрнста полу- чены трансгенные овцы с геном химозина (фермент для получения сыра). В 1 л молока содержится от 200 до 300 мг химозина (3 л молока достаточно для производства 1 т сыра из коровьего молока). Стоимость трансгенного химозина будет в несколько раз ниже, чем традиционно- го, получаемого из сычугов молочных телят и ягнят. 6.6 Генная инженерия растений Генетическая трансформация заключается в переносе чужерод- ных или модифицированных генов в эукариотические клетки. В каче- стве векторов используются плазмиды почвенной бактерии рода Agro- bacteria. Методами генной инженерии улучшают аминокислотный состав запасных белков растений; повышают эффективность фотосинтеза; улучшают процессы усвоения азота; повышают устойчивость растений к фитопатогенам, гербицидам, насекомым, к абиотичным стрессам. 56 7 ОСНОВЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ 7.1 История предмета Клеточная инженерия – важное направление в биотехнологии. Оно основано на использовании принципиально нового объекта – изо- лированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности – уникальном свойстве растительных кле- ток. С помощью клеточной инженерии в области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких проблем, как взаимо- действие клеток в тканях, клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизм появления раковых кле- ток и др. На практике клеточная инженерия используется при селекции, получении ценных метаболитов растительного происхождения, напри- мер, дешёвых лекарств, безвирусных растений, их клональное размно- жение и др. Тотипотентность – способность любой соматической клетки полностью использовать свой потенциал развития, то есть способность каждой растительной клетки давать начало целому организму. В 1922 г американец В. Роббинс и немец В. Котте независимо друг от друга показали возможность выращивания меристем кончиков корней томатов и кукурузы на синтетических питательных средах. (Меристема, от греч. меристос – делимый, образовательная ткань рас- тений, долго сохраняющая способность к делению клеток) С этого момента начались массовые исследования, и к 1959 г. на- считывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в сте- рильных условиях на специально подобранной культуральной среде. В 1955 г. Ф. Скуг и С. Миллер открыли новый класс фитогормо- нов – цитокинины. При их совместном действии с другими фитогор- монами – ауксинами – появилась возможность стимулировать деление клеток, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в контролирумых условиях. В 1960 г. Коккинг (Великобритания) разработал метод получения изолированных протопластов. Это послужило толчком к получению соматических гибридов, введению в протопласты вирусных РНК, кле- точных органелл, клеток прокариот. В это же время Дж. Морел и Р.Г. Бутенко предложили метод клонального микроразмножения, кото- рый сразу широко стал использоваться на практике. Под руководством 57 Р.Г. Бутенко в 1969 г. была разработана технология культивирования одиночной клетки с помощью ткани-«няньки». 7.2 Методы и условия культивирования изолированных тканей и клеток растений Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получило назва- ние метода культуры изолированных тканей. Общие требования к выращиванию следующие: – Асептика. Фрагменты ткани или органы растения – эксплан- ты – могут быть ингибированы токсинами микроорганизмов, поэтому все операции должны проводиться в асептических условиях. Для этого чистую посуду стерилизуют в автоклавах, питатель- ную среду – в автоклавах или через бактериальные фильтры. Комнаты обрабатывают хлорамином, а затем ультрафиолетовыми лампами. Сами растительные клетки могут быть источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация. Растение промыва- ют водой с мылом, споласкивают чистой водой, затем промывают в растворах дезинфицирующих веществ (диацида сулемы, перекиси во- дорода) в течение от 1 до 40 мин. После выдерживания эксплантантов в дезинфицирующем растворе, их несколько раз промывают в дистил- лированной воде и скальпелем удаляют наружный слой клеток на сре- зах эксплантантов, так как он мог быть поврежден стерилизацией. – Питательные среды. Изолированные клетки и ткани куль- тивируют на многокомпонентных питательных средах. В состав сред входят макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы в концентрации от 2 до 3 % вхо- дят в состав любой питательной среды, так как большинство каллус- ных тканей лишено хлорофилла и не способно к автотрофному пита- нию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного света или в тем- ноте. В среды обязательно вводят ауксины, вызывающие дедифферен- цировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. Добавление этих фитогормонов в различных соотношениях вызывает разные типы морфогенеза. При приготовлении твердых питательных сред для поверхност- ного выращивания каллусных тканей используют агар-агар – полиса- харид, получаемый из морских водорослей. 58 Универсальной является среда Мурасиге и Скуга, она пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусно- го роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. 7.3 Дедифференцировка на основе каллусогенеза Культура изолированных тканей обычно представлена каллус- ными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань образу- ется в результате повреждения на целых растениях, а также в стериль- ной культуре на эксплантах – фрагментах ткани или органа, исполь- зуемых для получения первичного каллуса. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением (пролиферацией) дедифферен- цированных клеток. Дедифференцировка – основа для создания кал- лусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способ- ность делиться. Дедифференцировка – это возвращение клеток в мери- стематическое состояние, при котором они сохраняют способность к делению. У интактных растений дедифференцировка и индукция кал- лусогенеза возникают вследствие образования раневых гормонов (травматиновая кислота) при механических повреждениях; кроме того, необходимо присутствие ауксинов и цитокининов. Среди ауксинов чаще всего используют: 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту), ИУК (индолил-3-уксусную кислоту), НУК (α-нафтилуксусную кислоту), Из цитокининов вносят: кинетин, 6-БАП (6-бензиламинопурин), зеатин. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, под- готавливают её к делению. Затем цитокинины инициируют деление клеток. То есть действие этих гормонов проявляется только при после- довательном или одновременном внесении их в среду. Во время процесса дедифференциации, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные черты исходной ткани. Сначала они теряют запасные вещества, затем специализированные клеточные органеллы. Через несколько часов после перенесения экспланта в условия in virto начинается новый синтез белка. При культивировании клеток на питательной среде начинается каллусогенез, то есть в результате де- дифференцировки и деления клеток будет образовываться первичный каллус. Таким образом, специализированная клетка растущей ткани 59 становится каллусной в результате дедифференцировки, то есть вос- становления у неё способности к делению. 7.4 Типы культур клеток и тканей В зависимости от способов, условий и происхождения можно выделить несколько типов культур клеток и тканей. С помощью обработки ферментами суспензии можно получить и из плотных тканей, и из тканей средней плотности. 7.5 Общая характеристика каллусных клеток Каллусная клетка имеет свой цикл развития, аналогичный циклу всех других клеток: деление, растяжение, дифференцировку, старение и отмирание. Культивируемые каллусные клетки и ткани сохраняют многие физиологические особенности, свойственные клеткам растения, из ко- торого они были получены. Сохраняются, например, такие свойства, как морозоустойчивость, устойчивость к абиотическим факторам (тем- пература, засоленение, фотопериодическая реакция), а главное, спо- собность к синтезу вторичных метаболитов. Наряду с общими у каллусных клеток появляются свои, харак- терные для них, особенности. Например, длительно культивируемые in vitro клетки высших растений образуют специфическую популяцию, относящуюся к типу неполовых – популяции соматических клеток. Культуры Каллусная (поверхностное культивирование) Суспензионная (глубинное культивирование) Ткани средней плотности с хорошо выраженными меристематичес- кими очагами (органогенез) Рыхлые ткани, сильно обводненные, легко распадаются на отдельные клетки Плотные ткани с зонами редуцированного камбия и сосудов 60 Наиболее характерные свойства этой популяции: физиологическая асинхронность, генетическая гетерогенность, гормоннезависимость. – Физиологическая асинхронность заключается в том, что в каждый данный момент времени клетки находятся в разных фазах рос- та: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Общее физиоло- гическое состояние такой популяции принято оценивать по состоянию большинства клеток. – Генетическая гетерогенность– нестабильность генома. Ге- нетически стабильными считаются только клетки меристематических тканей. В клетках остальных тканей при культивировании могут воз- никать полиплодия, анеуплодия, хромосомные изменения, генные му- тации. Полиплодия– наследственное изменение, заключается в кратном увеличении числа наборов хромосом в клетках организма (часто встре- чается у растений, редко – у животных). Полиплоды могут содержать в клетке три основных набора хромосом (триплоид), четыре набора (тет- раплоид). Анеуплодия– различные формы аномалий в числе хромосом. Однако генетическую гетерогенность нельзя рассматривать как недостаток, так как она является необходимым условием следующей популяции клеток и служит основой для их адаптации. Это свойство имеет важное значение для селекции. – Гормоннезависимость.Хотя гормоны и вызывают мутации, каллусные ткани от большинства растений образуются только в при- сутствии в питательной среде и ауксинов, и цитоксинов. Однако, при длительном культивировании практически у всех тканей может воз- никнуть специфическое свойство гормоннезависимости, то есть авто- номности по отношению к ауксинам и цитокининам. Эти ткани могут расти на среде без гормонов, что делает их похожими на раковые клет- ки и резко отличает от нормальных каллусных тканей. Клетки, которые в процессе культивирования приобрели свойст- во автономности от присутствия гормонов, называют «привыкшими». Ткани, образованные такими «привыкшими» клетками, называют «хи- мическими» опухолями, в отличие от растительных или генетических опухолей. Генетические опухоли возникают на межвидовых гибридах растений, растительные опухоли имеют бактериальное или вирусное происхождение, чаще всего вызываются у растений агробактериями. 61 7.6 Морфогенез в каллусных тканях как проявление тотипотентности растительной клетки 7.6.1 Дифференцировка каллусных тканей После завершения дедифференцировки дальнейшее развитие каллусной клетки может идти в нескольких направлениях: 1) вторичная дифференцировка разной степени сложности; 2) в клетках может сформироваться состояние стойкой дедиф- ференцировки («привыкание»); 3) каллусная клетка проходит свой путь развития, завершаю- щийся её старением и отмиранием. Наиболее интересен первый путь (морфогенез). Морфогенез – возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток. Также могут образовываться отдельные ткани или органы (то- гда это органогенез). Все типы дифференцировки базируются на свойстве тотипотент- ности: любая растительная клетка содержит полный набор генов, ха- рактерный для того организма, из которого она была выделена. Потенциальные возможности всех клеток растения одинаковы: каждая может дать в определенных условиях начало целому организ- му. На практике детерминируется одна из 400…1000 клеток. Все каллусные клетки, готовые ко вторичной дифференцировке, то есть детерминированные, характеризуются общими чертами. Эти клетки образуют утолщенную клеточную стенку, обособляясь от ос- тальных каллусных клеток. Для них характерно более крупное ядро, большее количество запасных веществ, меньшие размеры вакуолей. 7.6.2 Гистогенез (образование тканей) Главную роль в преобразовании каллусных клеток в сосудистые элементы играют фитогормоны, в основном, ауксины. Например, гис- тогенез соблюдается при нанесении на куллус ауксина с сахарозой. |