Учебнометодическое пособие по дисциплинам Основы биотехнологии, Введение в биотехнологию
 Скачать 0.73 Mb.
|
|
4.4 Биотехнология получения вторичных метаболитов Принципы получения вторичных метаболитов основаны на осо- бенностях их образования клетками микроорганизмов. Биосинтез вто- ричных метаболитов фазоспецифичен и происходит после завершения стадии роста, в идиофазе, благодаря чему их и называют идиолитами. 33 4.4.1 Получение антибиотиков Антибиотики – самый большой класс фармацевтических соеди- нений, синтез которых осуществляется микробными клетками. К этому же классу относятся противогрибковые агенты, противоопухолевые лекарства и алкалоиды. В мире ежегодно производится антибиотиков на 20 млрд. долларов. Ещё более широко, чем в медицине, они исполь- зуются в растениеводстве, животноводстве, ветеринарии, пищевой промышленности. В 1928 г. английский микробиолог Флеминг установил способ- ность зелёной плесени Penicillum notanum вызывать гибель микроорга- низмов, а во время 2-ой Мировой войны был начат промышленный выпуск антибиотиков. Следует отметить, что в 1871 г. лечебные свой- ства плесени были описаны русским дерматологом А.Г. Полотебно- вым. К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы изна- чально природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. В настоящее время описано 12000 антибиотичных препаратов, из которых в клинике применяется около 200. Около 97 % известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. В хими- ческом отношении они представляют собой сборную группу органиче- ских веществ. По типу действия антибиотики делят на бактерицидные, вызы- вающие гибель микроорганизмов и бактериостатические, нарушающие способность микроорганизмов делиться. По спектру действия разли- чают антибиотики узкого и широкого действия. К последним относят тетрациклины, макролиды, амилогликозиды, которые назначают в слу- чае неидентифицируемых возбудителей болезней, при длительном применении они вызывают дисбактериоз. Особенностью антибиотиков является специфичность их дейст- вия. Эти эффекторы подавляют один или несколько процессов лишь у некоторых микроорганизмов. В зависимости от специфики действия антибиотиков на молекулярном уровне различают следующие группы соединений, вызывающие у бактерий: 1) нарушение биосинтеза пептидогликанов клеточной стенки; 2) нарушение отдельных этапов процесса трансляции (транс- ляция – реализация генетической информации); 3) повреждение цитоплазматической мембраны; 4) нарушение биосинтеза нуклеиновых кислот; 5) нарушение энергетического обмена. 34 Антибиотики широко используются для расшифровки механиз- мов биосинтеза белка, нуклеиновых кислот и структуры клеточных стенок бактерий. Изыскание новых антибиотиков обусловлено и потребностями практики, и накоплением резистентных форм микроорганизмов по от- ношению ко многим антибиотикам. Устойчивость микроорганизмам придаёт фермент лактамаза, превращающий пенициллин в пеницилли- новую кислоту. Поэтому новые аналоги антибиотиков получают при использовании природных ингибиторов β-лактамаз – клавулановой и оливановой кислот. Химические методы получения антибиотиков очень сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Существует несколько способов получения как природных, так и полусинтетических антибиотиков: 1) ферментация микроорганизма-продуцента с подходящим предшественником, что индуцирует синтез антибиотиков в идиофазе; 2) использование для биосинтеза блокированных мутантов. У таких мутантов блокирован синтез нужного антибиотика. Используя низкую субстратную специфичность ферментов вторичного метабо- лизма и вводя аналоги предшественников антибиотика, их переводят в аналоги самого антибиотика. Этот процесс называется биосинтез, или мутасинтез: а) предполагается последовательность реакций, ведущая к син- тезу антибиотика антибиотик фермент E D С B A ; б) отсутствие синтеза антибиотика у «блокированного» мутан- та фермент В А D C ; блокированное звено метаболизма в) синтез модифицированного антибиотика после введения аналога предшественника ( D * ) * * фермент E D B A – модифицированный антибиотик. Антибиотики продуцируются плесневыми грибами, актинамице- тами, эубактериями и другими микроорганизмами. Шесть родов фила- ментозных грибов производят около 1000 различных антибиотиков, в том числе пенициллин и цефаллоспорин, а три рода актиномицетов – 3000 антибиотиков. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces, один из видов которого – S. griseus синтезирует бо- лее 50 антибиотиков. 35 Процесс культивирования идиолитов проходит две фазы (двух- ступенчатое культивирование). На первой фазе происходит накопление достаточного количества биомассы, которая выращивается на подхо- дящей для роста микроорганизма среде. Эта фаза должна быть быст- рой, а питательная среда дешёвой. На второй фазе осуществляется за- пуск и активный синтез антибиотика. На этой фазе ферментацию ведут на продуктивной среде. Образование антибиотиков регулируется усло- виями культивирования микроорганизмов. Поэтому оптимизация пита- тельной среды является главным фактором в повышении выхода про- дукта. Большинство антибиотиков получают при глубинной аэробной ферментации периодического действия в асептических условиях. 4.4.2 Получение промышленно важных стероидов К стероидам относится большая группа биологически важных соединений, среди которых – половые гормоны, сердечные гликозиды, желчные кислоты, витамины, алкалоиды, регуляторы роста растений. В основе стероидов лежит скелет пергидроциклопентанофенантрена. Процессами биотрансформации называют реакции превращения исходных органических соединений (предшественников) в целевой продукт с помощью клеток живых организмов или ферментов, выде- ленных из них. Способность клеток микроорганизмов к высокоспеци- фичной биотрансформации используется в производстве стероидов. Использование абсолютной стереоспецифичности и субстратной спе- цифичности ферментов клеток позволило разработать условия осуще- ствления множества химических реакций для структурных перестроек стероидов. В результате были получены новые соединения с лучшими фармакологическими свойствами. Биотрансформация стероидов обыч- но заключается в селективном воздействии на одно из положений сте- роидного скелета. Значимость разработанной микробной трансформации определя- ется тем, что процессы гидроксилирования прогестерона и его произ- водных лежат в основе промышленного синтеза многих ценных про- дуктов: противовоспалительных и противоопухолевых препаратов, транквилизаторов, анестезирующих средств, половых гормонов и др. Кроме биотрансформации, стероидные гормоны можно получать с помощью культур клеток растений. Например, культура клеток корня растения диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea) продуцирует фитостерин, диосгенин и его гликозидные производные (сапонины). Существенно, что способность к сверхсинтезу фуростаноловых глико- 36 зидов ряда штаммов диоскореи, например, штамма ДМ-ОГ, стабильно поддерживалась в течение 27 лет. Таким образом, культивирование клеток растений in vitro представляет собой новое решение проблемы промышленного получения вторичных метаболитов. В дальнейшем для производства стероидных гормонов прогнози- руется применение иммобилизованных клеток, использование опти- мального сочетания биологических и химических превращений, а так- же совершенствование технологии очистки получаемых соединений. 37 5 БИОИНДУСТРИЯ ФЕРМЕНТОВ 5.1 Область применения и источники ферментов Производство ферментных препаратов занимает одно из веду- щих мест в современной биотехнологии. Постоянно увеличивается объём их выпуска и расширяется сфера применения. Ферменты явля- ются высокоактивными нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения. Их преимуществом перед химическими катализатора- ми является действие при нормальном давлении, температуре от 20 до 70 ºС, рН от 4 до 9. Они имеют высокую субстратную специфичность, что позволяет в сложной смеси субстратов направленно воздействовать только на определенные соединения. Согласно принятой классификации и номенклатуре сейчас иден- тифицировано около 2000 ферментов. Промышленно выпускается око- ло 250 наименований, причём 99 % общей суммы реализации фер- ментных препаратов приходится только на 18 ферментов. Наибольший удельный вес среди выпускаемых препаратов зани- мают протеиназы, широко используемые в синтетических моющих средствах, и амилазы для переработки крахмала. Эти два вида препара- тов составляют 60 % общего объёма выпуска ферментных препаратов за рубежом. Другими крупными отраслями – потребителями ферментов, яв- ляются – производство вин и соков 10 %; – производство спирта 8 %; – сыроделие 5 %; – хлебопечение 5 %; – пивоварение 6 %; – прочие отрасли 6 %. В России, кроме того, ферменты внедряются в кормопроизводст- во. Особое место в общем объеме производства ферментов занимают высокоочищенные ферментные препараты. Их доля в общем объёме очень мала, так как технология сложна, требует больших материаль- ных затрат и времени. Эти препараты очень важны для медицины, ана- литических целей и научных исследований. Ферменты присущи всем живым существам, однако для их выде- ления используют только те природные объекты, в которых содержа- ние используемого энзима составляет не менее 1 %. Источниками ферментов могут быть: 38 1) проросшее зерно различных злаков (солод) – для получения амилаз, латекс фикусовых, дынного дерева – для получения протеиназ; 2) отдельные ткани и органы животных (поджелудочная желе- за, слизистые оболочки желудков и тонких кишок, сырный сычуг крупного рогатого скота); 3) микроорганизмы. В специфических условиях микроорга- низмы способны синтезировать огромное количество ферментов. Они легко переключаются с синтеза одного фермента на другой, имеют короткий цикл роста (от 16 до 100 ч). Для промышленного получения ферментов используют как естественные штаммы, так и полученные с помощью мутагенеза, селекции и индукции биосинтеза. Ферменты способны синтезировать бактерии, грибы, дрожжи, актиномицеты; микроорганизмы могут быть моно- или полифермента- ми. 5.2 Выбор штамма и условий культивирования Целесообразность применения микроорганизмов для производ- ства ферментов заключается в следующем: 1) генетическими манипуляциями удаётся в тысячу и более раз увеличить уровень катаболитных и в несколько сот раз уровень био- синтетических ферментов; 2) энергетически оправдано выращивание микробных клеток в больших масштабах в связи с применением недорогих сред и быстрого роста микроорганизмов; 3) огромное разнообразие реакций, к которым способны мик- роорганизмы. Это особенно касается вторичного метаболизма; 4) микроорганизмы служат источником не только таких фер- ментов, которые встречаются у животных и растений, но и ряда уни- кальных ферментов, нигде более не обнаруженных. Например, целлю- лоза, танназа, гидрогеназа и др. Среди микроорганизмов есть виды, развивающиеся при экстремально высоких температурах (87 ºС), в свя- зи с чем потенциально возможно создание термостабильных штаммов; 5) способность микроорганизмов адаптироваться к различным окружающим условиям, что позволяет переносить культуру на произ- водство, где она растёт на дешёвых субстратах. Промышленное производство и применение ферментов основано на двух важных факторах: во-первых, ферменты образуются в живых клетках; во-вторых, они могут проявлять свое специфическое действие в среде независимо от живых клеток. 39 При первоначальном выделении штамма исходят из того, что микроорганизмы адаптируются к утилизации субстрата, находящегося в изобилии в местах их обитания, и, следовательно, образуют фермен- ты, реагирующие с этим субстратом. Поэтому продуценты целлюлаз и лигнолитических ферментов выделяются из лесных почв, продуценты пектиназ – из фруктов и рас- тений, деструкторы мочевой кислоты – из птичьего загона и т.д. Ферменты близкородственных штаммов имеют сходные свойст- ва, а у дальнеродственных – могут сильно отличаться. Первая ступень производства ферментов состоит в селекции организма, образующего желаемый фермент в наибольшем количестве. При этом учитывают следующие общие требования к продуценту: 1) желательно образование внеклеточных ферментов, так как их легче выделить; 2) высокий выход фермента за короткое время; 3) очистка фермента от культуральной жидкости должна быть лёгкой; 4) штаммы не должны продуцировать антибиотики, токсичные вещества и не должны быть родственниками штаммов, образующих токсины. Чтобы вызвать сверхсинтез ферментов используют ряд методов, связанных с изменением окружающих условий роста и ведущих к из- менению генетики организма. 5.3 Технология культивирования микроорганизмов – продуцентов ферментов и выделение ферментов Технологический процесс можно разбить на три стадии: 1) получение посевного материала; 2) получение производственной культуры методами поверхно- стного или глубинного культивирования; 3) выделение из готовой производственной культуры техниче- ских или очищенных ферментных препаратов. Поверхностный метод состоит в культивировании микроорга- низмов на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей, раз- мещённых в кюветах. Инкубацию ведут в специальном термостати- руемом цехе при постоянном контроле в нём температуры, влажности и подачи воздуха. Глубинный метод более экономичен. Для его реализации приме- няются ферментеры из нержавеющей стали, снабженные устройствами 40 для перемешивания и подачи в жидкую питательную среду стерильно- го воздуха. Наиболее прогрессивен проточный метод, который обеспечивает непрерывную подачу в ферментер питательной среды и посевного ма- териала и непрерывный отбор продуктов жизнедеятельности и микро- биальной массы. Достоинством метода является возможность длитель- ное время поддерживать в автоматическом режиме рост культуры мик- роорганизмов (до 200 суток). Выделение и очистка фермента из культуры микроорганизмов – достаточно трудоёмкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенного препарата, его не очищают. В промышленности широко используют коммерческие пре- параты, чистота которых составляет всего 0,1 % (то есть 99,9 % состав- ляют примеси). К таким отраслям относят спиртовую, кожевенную, текстильную промышленность, сельское хозяйство, производство бы- товой химии. Неочищенные препараты получают в мягком режиме высушива- ния культуры микроорганизмов вместе с остатками питательной сре- ды. Такие препараты получают или из экстракта культуры продуцента, выращенного поверхностным способом, или из фильтрата культурной жидкости продуцента, выращенного глубинным способом. Для большинства отраслей пищевой промышленности, научных исследований и медицины требуются очищенные ферментные препа- раты. Источником выделения фермента может быть биомасса микро- организмов, экстракт или фильтрат культуральной жидкости. Биомассу микроорганизмов необходимо тщательно измельчить, вплоть до раз- рушения субклеточных структур: лисозом, митохондрий, ядер и т.д. Затем препараты очищают осаждением органическими раствори- телями, солями, после чего диализом, аффинной хроматографией, пе- реосаждением, гель-фильтрацией, сорбцией, кристаллизацией и пр. Так как ферменты имеют белковую природу, то особое значение придают соблюдению режимов, сохраняющих их активность при инак- тивации сопутствующих балластных белков. Очищенные ферменты хранят при низкой температуре (до минус 80 ºС). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты. 5.4 Инженерная энзимология и её задачи Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использования. Прин- 41 ципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимоло- гией в 60-е года ХХ века в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли – инженерной энзимологии. Её задачи заклю- чаются в развитии прогрессивных методов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации, конструировании катализаторов с нужными свойствами и разработке научных основ их применения. Важным этапом развития инженерной энзимологии стала разра- ботка способов получения и использования иммобилизованных фер- ментов. Иммобилизованными называют ферменты, искусственно связан- ные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитиче- ские свойства. Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравне- нии со свободными молекулами: 1) они представляют собой гетерогенные катализаторы, кото- рые легко отделяются от реактивной среды; 2) могут использоваться многократно; 3) обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Иммобилизация ведёт к изменению свойств фермента: субстрат- ной специфичности, устойчивости, зависимости активности от пара- метров среды. Иммобилизованные ферменты долговечнее и в тысячи раз стабильнее свободных энзимов. Это обеспечивает высокую эконо- мическую эффективность и конкурентоспособность технологий, ис- пользующих иммобилизованные ферменты. Все носители, используемые для иммобилизации ферментов, можно разделить на две группы: органические полимерные и неорга- нические. К носителям предъявляются следующие требования: они должны быть нерастворимы в реакционной среде, быть разно заряжен- ными с ферментом, иметь высокую гидрофильность, механическую прочность, химическую и биологическую стойкость, не вызывать не- специфической адсорбции и сильных конформационных изменений белка, легко активироваться. Способы иммобилизации делятся на две группы: химические (то есть с образованием ковалентной связи) и физические. К физическому способу относят адсорбцию, когда фермент удерживается на носителе с помощью электростатических, водородных связей, а также в силу дисперсности взаимодействий. Этот способ осуществляется на нерастворимых носителях любой природы. Другим физическим способом является механический способ, при котором ферменты включаются в гели, сшитые поперечными свя- зями, заключаются в капсулы, волокна, мембраны и т.д. 42 К химическому способу относится ковалентное связывание, ко- торое осуществляется путем ковалентного сшивания с полимерным носителем и поперечного сшивания ковалентными связями молекул белка без носителя. Химический способ является основным в получе- нии иммобилизованных ферментов. Такие препараты стабильны, фер- менты из них не вымываются, уменьшается отрицательное влияние матрицы. Существенным недостатком является значительная инакти- вация ферментов. Рисунок 4 – Методы иммобилизации ферментов Кроме иммобилизованных ферментов используют также иммо- билизованные клетки. При использовании иммобилизованных клеток отпадает необхо- димость выделения и очистки ферментных препаратов, применения кофакторов, создается возможность получения полиферментных сис- тем. В промышленных производствах используют покоящиеся клет- ки, так как: 1) многие хозяйственно-ценные продукты синтезируются в стационарной фазе; 2) растущие клетки нарушают структуру носителя; 3) образующиеся дочерние клетки, покидая носитель, загряз- няют целевой продукт. Для подавления роста иммобилизованных клеток используют дефицит фитогормонов, а рост клеток бактерий тормозят добавлением антибиотиков. В настоящее время с использованием иммобилизованных фер- ментов и клеток проводятся следующие промышленные процессы: 1) получение глюкозофруктозных сиропов; 43 2) получение оптически активных L-аминокислот из их раце- мических смесей; 3) синтез L-аспарагиновой кислоты (подсластитель и подкис- литель) из фумарата аммония; 4) синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты; 5) синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты; 6) получение безлактозного молока; 7) получение сахаров из молочной сыворотки; 8) получение 6-аминопенициллановой кислоты (аналог пени- циллина). |