Учебнометодическое пособие по дисциплинам Основы биотехнологии, Введение в биотехнологию
 Скачать 0.73 Mb.
|
|
6 МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСТРУИРОВАНИЯ IN VITRO 6.1 Биотехнология рекомбинантных ДНК ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота, высокомолекулярное вещество, содержащееся в ядрах клеток организмов и вместе с белками гистонами образующее вещество хромосом. ДНК – носитель генетиче- ской информации, её отдельные участки соответствуют определённым генам. Молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, за- крученных одна вокруг другой в правовинтовую спираль. Цепи по- строены из большого числа мономеров четырёх типов нуклеотидов. Нуклеотид состоит из дезоксирибозы, остатка фосфорной кислоты и одного их четырёх азотистых оснований – аденина, гуанина – пурино- вые основания; цитозина, тимина (в РНК – урацила) – пиримидиновые основания. Азотистые основания нуклеотидов, будучи комплементарно свя- заны друг с другом (А – Т, Г – Ц), соединяют полинуклеотидные цепи в молекулу ДНК. Сочетания трёх рядом стоящих нуклеотидов в цепи (триплеты или кодоны) определяют генетический код, а их последова- тельность – характер генетической информации. Способность ДНК к самоудвоению (редупликация) обеспечивает генетическую преемст- венность между поколениями организмов в процессе размножения. Расстояния между парами комплементарных оснований по длине спирали равно 0,34 нм. В одном её витке размещается 10 пар основа- ний (3,4 нм). Диаметр спирали равен 2 нм. Макромолекула ДНК состо- ит из 10…15 тыс. и более дезоксирибонуклеотидов. У каждого вида организмов ДНК характеризуется специфическим распределением и количественным молярным соотношением азотистых оснований. Всё это даёт практически неисчерпаемое разнообразие вариантов, для раз- ных организмов оцениваемое феноменальным числом от 10 50 до 10 1000 , в крайних выражениях значительно превышающем число атомов во Вселенной. Генетическая инженерия – ветвь молекулярной генетики, иссле- дующая возможности и способы создания лабораторным путём (in vitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, то есть создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой орга- низм. 45 In vitro соединяют фрагменты ДНК, которые в естественных ус- ловиях не сочетаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинант- ные ДНК). Согласно определению национальных институтов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путём соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироватья в клет- ке». Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединен- ные вне клетки два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой (чужеродной) ДНК, содержащие интересующие исследователя генетические элемен- ты. К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК относят следующие: 1) специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нук- леазами, что ускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними; 2) быстрое секвенирование (установление последовательностей азотистых оснований в ДНК) всех нуклеотидов в очищенном фрагмен- те ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида; 3) гибридизацию нуклеиновых кислот, позволяющую с боль- шой точностью выявить специфические нуклеотидные последователь- ности на основе их способности связывать комплементарные основа- ния; 4) клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плаз- миду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий; 5) генетическую инженерию, позволяющую получать модифи- цированные версии генов и затем внедрять их в клетки или организмы. Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных по- следовательностей осуществляется особыми ферментами – рестрикци- рующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Все ферменты можно условно разделить на следующие группы: 1) используемые для получения фрагментов ДНК; 2) синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК; 3) соединяющие фрагменты ДНК; 46 4) позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК; 5) применяемые для приготовления гибридизационных проб. Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опо- знает в ней последовательность из 4…6 нуклеотидов. В настоящее время выпускается более 100 разнообразных рестриктаз. Каждый фер- мент опознает различные последовательности нуклеотидов и специ- фично разрывает их. При разрыве образуется серия фрагментов, назы- ваемая рестрикционной (рестрикта), с тупыми либо липкими концами. Преимущественно разрывается двунитевая ДНК. Рисунок 5 – Участки узнавания ДНК тремя рестриктазами из Haemophilus parainfluenzae (HpaI); Escherichia coli (EcoRI) и Haemophilus influenzae (HindIII) Многие рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смеще- нием на несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагментов коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать ком- плементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным уча- стком, полученным с помощью того же фрагмента (липкие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК можно встроить в очищен- ную ДНК плазмиды или бактериального вируса. 47 Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соответ- ствующего участка генома набором рестриктаз позволяет построить рестрикционную карту, отражающую расположение определенной по- следовательности нуклеотидов в данном участке. Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии между отдельными генами без определения их нуклеотидной последовательности. Рестрикционные карты важны для клонирования ДНК, решения эволюционных и фило- генетических задач. В генной инженерии важно быстро секвенировать (определить последовательность нуклеотидов) любые очищенные фрагменты ДНК. В настоящее время такую информацию обрабатывают с помощью ком- пьютерных программ. В биотехнологии рекомбинантных ДНК исполь- зуют химический и ферментативный методы секвенирования. Оба ме- тода быстры и результативны. 6.2 Конструирование рекомбинантных ДНК Сущность генетической инженерии сводится к целенаправлен- ному конструированию генетических систем вне организма и после- дующему введению их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиент- ного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетиче- ские и физико-биотехнологические свойства. Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК – лиги- рование (или сшивание) генов с помощью фрагмента ДНК – лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» концам; б) с помощью искусственно достроенных «липких» концов (ферментативным путём). «Липкие» концы – взаимнокомплементар- ные участки, длиной из 4…6 пар нуклеотидов. После того, как рекомбинантная ДНК сшита, её вводят в живые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, её раз- рушают внутриклеточные нуклеазы. Для того, чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в её геном и реплициро- ваться за его счёт, либо быть способной к автономной репликации. Молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и авто- номно реплицироваться, называют векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями: 48 1) иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции; 2) иметь свойства репликона; 3) содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придают ей фенотип, свиде- тельствующий о присутствии вектора. В частности, для бактериальных векторов в качестве маркерных генов чаще всего используются гены, вызывающие устойчивость кле- ток к некоторым антибиотикам. Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроен- ных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д. Рисунок 6 – Встраивание изолированного гена в генетический вектор Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов ис- пользуют плазмиды. Первый плазмидный вектор был получен С. Коэном (1973 г). Его источником была плазмида E.coli R 6-5 c молекулярной массой 65 кDa. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур. Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида, относящаяся к группе колициногенных плазмид Е.coli, Col E1, которая реплицируется независимо от хромосомы и присутствует в количестве, примерно, 24 копий на клетку. Её широко используют благодаря се- лективному маркеру в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в E.coli. Плазмидные векторы в настоящее время чрезвычайно разнооб- разны за счёт следующих свойств: – уменьшения размеров плазмиды вследствие изъятия участков, не обязательных для репликации (чем больше плазмида содержит уни- кальных участков узнавания для рестриктаз, тем они универсальнее); 49 – гибридизации векторов одного рода с другими векторами или природными плазмидами (например, получены гибридные векторы комбинацией плазмиды и фага-λ), при этом вновь сконструированная рекомбинантная ДНК должна сохранить репликационные свойства исходной плазмиды; – использования новых плазмид; – применения транспозонов; – создания векторов с генетическими маркерами, позволяющи- ми вести отбор рекомбинантных клонов. Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чуже- родными генами часто называют гибридными или химерными плазми- дами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактери- альную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу (на- пример, в среду с определенным антибиотиком). Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией, то есть вирусные частицы развиваются в клетке, при этом она приобретает новые свойства. При обработке клеток бактерий хлористым кальцием их клеточ- ные стенки становятся проницаемыми для ДНК. Однако эффектив- ность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низкая, трансформируется небольшая часть клеток. Из общей массы их отде- ляют клонированием. Для этого бактериальную суспензию высевают в чашки Петри из расчёта от 5 до 10 бактерий на 1 см 3 поверхности. Од- на клетка образует на поверхности маленькую колонию, называемую клоном. Из одной клетки образуется один клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника. 6.3 Идентификация клеток-реципиентов, содержащих рекомбинантные гены Необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. После трансплантации генов лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии. Первая стадия – поиск клеток, несущих вектор, например, по приобретенной способности быть устойчивыми к антибиотикам. 50 Вторая стадия – поиск клеток, несущих и вектор, и ген-мишень. Для этого используют две группы методов: а) методы, основанные на непосредственном анализе ДНК кле- ток-реципиентов: – определение нуклеотидной последовательности ДНК, когда из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, затем проводят секвенирование; – гибридизация выделенной ДНК с зондом, который может быть интересующим геном или соответствующей ему м-РНК; б) методы, основанные на определении признака, кодируемого геном: – непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени; – использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень, например, клетки, несущие ген β-галактозидазы культивируют на среде с лактозой; – иммунологическая детекция, например, при поиске в бакте- риях α-интерферона человека его связывают с антителами, то есть ген идентифицируют с помощью специфических антител к его белковому продукту. 6.4 Экспрессия чужеродных генов Эффективность функционирования бактериальных генов не оди- накова. Бактериальные гены, включенные в геном, экспрессируются достаточно легко, так как в процессах транскрипции и трансляции всех прокариот много общего. Экспрессия генов эукариот у бактерий происходит крайне редко, так как регуляторные участки эукариот не узнаются бактериальными ДНК – полимеразами, поэтому разработаны следующие методы защи- ты: а) использование ингибиторов протеаз, например, выход чело- веческого интерферона увеличивается примерно в четыре раза при введении гена, отвечающего за синтез ингибиторов протеаз; б) встраивание гена в подходящий вектор экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы; в) амплификация (увеличение числа копий). Суммарная актив- ность экспрессируемого гена увеличивается с ростом числа копий ре- комбинантной ДНК в расчёте на клетку. Используя многокопийные плазмиды, можно получить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Получены температурно-чувствительные мутантные плазмиды, спо- 51 собные накопить до 1…2 тыс. копий на клетку без нарушения жизнен- но важных функций бактерий (обычно в клетке от 20 до 50 копий). В настоящее время разработаны системы клонирования в бакте- риях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. 6.4.1 Клонирование в бактериях Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в клетке E.coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид E.coli и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей). Bacillus subtilis – непатогенный почвенный микроорганизм; ис- пользуется для производства белков и ферментов. В этих бактериях обнаружены плазмиды и фаги, генетика которых хорошо изучена. Клонирование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов, которые способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев: Bacillus subtilis, E.coli, Staphylococcus aureus. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов плазмид Staphylococcus aureus, E.coli и хромосомных фрагментв Bacillus subtilis. Полученные рекомбинантные штаммы несут признаки устойчивости к антибиоти- кам. Стрептомицеты широко применяются в биотехнологии. С помо- щью клонирования получены штаммы, устойчивые к антибиотикам. 6.4.2 Клонирование в дрожжах Среди дрожжей наиболее изучены S.serevisiae. Дрожжевая плаз- мида Scp1 содержит около 6300 пар оснований и имеет от 50 до 100 копий на клетку. Её гибриды с плазмидами обычно используют в каче- стве векторов. Работа с дрожжами облегчается тем, что они могут рас- ти в жидкой среде и давать колонии на твёрдой среде, имеют короткое время регенерации. Процедура внедрения ДНК в клетки дрожжей достаточно проста. Целлюлозную стенку удаляют обработкой ферментами, получая сфе- ропласты. Их инкубируют с ДНК в присутствии хлорида кальция и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкубация сферопластов на твёрдой среде восста- навливает клеточную стенку. Последующая селекция заключается в выращивании клонов на среде, в которой отсутствует тот или иной компонент. При этом трансформаты легко отбираются. Применяя 52 приёмы, аналогичные использовавшимся при клонировании бактерий, удается достичь синтеза чужеродных белков в клетках дрожжей, на- пример, интерферона человека. 6.4.3 Клонирование в клетках животных В целях исследования функционирования генов высших эукари- от занимаются проблемой введения генов в клетки млекопитающих. Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных раз- личными путями. Например, метод маркера. Метод служит для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК. Пример: предварительно получали рекомбинантную плазмиду E.coli с геном тимидинкиназы из вируса герпеса. Затем с помощью по- лученной плазмиды трансформировали животные клетки, дефектные по синтезу тимидинкиназы, после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде. Также сконструировано большое количество челночных векто- ров, способных к репликации в животной и бактериальной клетках. Разработана технология микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Трансформация соматических клеток млекопитающих даёт возможность изучать механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки жи- вотных, в том числе человека. Культуры клеток млекопитающих могут быть эффективным источником выделения ряда вирусных антигенов с целью получения вакцин для человека и животных. В настоящее время разработаны способы введения генов в эм- бриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений с це- лью изменения свойств организмов, таких как скорость роста, устой- чивость к заболеваниям и внешним воздействиям. Такие работы были начаты на крупных яйцах амфибий, теперь продолжены с яйцеклетка- ми и эмбрионами мышей. Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приёмной матери или дают развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку. Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген глобулина кролика, ген тими- динкиназного вируса герпеса. Выживает от 10 до 30 % яйцеклеток, доля трансгенных мышей составляет от нескольких до 40 %. |