Учебнометодическое пособие по дисциплинам Основы биотехнологии, Введение в биотехнологию
 Скачать 0.73 Mb.
|
|
3.3 Плазмиды и конъюгация у бактерий Плазмидами называют бактериальные репликоны (внехромосом- ные элементы наследственности), стабильно наследуемые. Они пред- ставляют собой двуцепочные кольцевые молекулы ДНК с вариабель- ными молекулярными массами. Их размеры составляют от 1 до 3 % генома бактериальной клетки. Плазмиды разделяют на конъюгативные, способные самостоя- тельно перенестись в реципиентные клетки с помощью конъюгации, и неконъюгативные, не обладающие этим свойством. Они детерминиру- ют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды), биодеградацию (D-плазмиды) и др. 20 Например, плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути. Гены устойчивости к тяжелым ме- таллам обнаружены также в составе R-плазмид E. coli. У кишечной палочки, сальмонелл и ряда других бактерий обнаружены Col- плазмиды, обеспечивающие синтез разных колицинов – высокоспеци- фичных антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность других штаммов микроорганизмов того же вида или родственных видов. Ко- личество плазмид в клетке может колебаться от 1 до 100. В целом, чем крупнее плазмида, тем меньше количество её копий в клетке. 3.4 Фаги и трансдукция Трансдукция – перенос генетической информации от клетки до- нора к клетке реципиента, который осуществляется фагом. Почти каждый известный в настоящее время вид бактерий явля- ется хозяином одного или нескольких фагов. Фаги могут быть вирулентными – лизирующими зараженные ими бактерии – или умеренными – образующими с клеткой-хозяином своеобразный симбиоз. Такие фаги передаются по наследству, могут находиться в клетке в виде автономной плазмиды или интегрироваться в бактериальную хромосому. Фаги могут нарушать процессы ферментации в результате фаго- лиза производственных культур бактерий. Также фаги являются важ- ным инструментом генетического анализа и конструирования штаммов бактерий. Явление трансдукции описали в 1952 г. Н. Циндер и Дж. Ледерберг. Оно основано на том, что в процессе размножения фа- гов в бактериях иногда образуются частицы, которые наряду с фаговой ДНК или вместо неё содержат фрагменты бактериальной ДНК. При заражении новых бактериальных клеток они передают им генетические детерминанты предыдущего хозяина. 3.5 Гибридизация эукариотических организмов Образование гибридов у дрожжей, грибов и водорослей проис- ходит в результате слияния клеток. Если исходные клетки были гапло- идными, то есть содержали только один набор хромосом, то в резуль- тате слияния ядер появится диплоидная клетка (зигота), несущая два набора хромосом в одном ядре. У некоторых микроорганизмов диплоидное ядро сразу подверга- ется мейозу. У аспергилл, дрожжей, водорослей диплоидное ядро на- 21 чинает делиться с образованием диплоидных вегетативных клеток. Промышленные штаммы дрожжей часто полиплоидны. Совмещение ценных качеств родителей при гибридизации эука- риотических организмов может происходить также вследствие реком- бинации, к которой приводит мейоз и митотическое расщепление. 3.6 Слияние протопластов или фузия клеток Термин «протопласты» применяют для обозначения структур, которые образуются после полного удаления клеточной стенки у кле- ток растений, микроорганизмов, животных. Когда нет уверенности в том, что клеточная стенка целиком отсутствует, то говорят о «сферо- пластах» и о слиянии и трасформации сферопластов. Таким образом, сферопласты – это частичные протопласты. Протопласты позволяют исследовать различные свойства мем- бран, транспорт веществ через плазмоллему. Для получения протопластов используют несколько методов: 1) выращивание клеток на средах с антибиотиками, высокими концентрациями аминокислот. В результате нарушаются процессы биосинтеза клеточной стенки; 2) основной метод – ферментный лизис клеточной стенки, на- пример, лизоцимом. С помощью слияния протопластов можно получать генетические рекомбинанты у тех видов и штаммов микроорганизмов, у которых не обнаружены собственные системы обмена наследственной информа- цией и которые в естественных условиях никогда не скрещиваются между собой. Следует подчеркнуть, что речь идёт об объединении соматиче- ских (неполовых) клеток. В настоящее время методом фузии получают гибриды клеток человека и животных, млекопитающих и растений или дрожжей, хотя долгоживущих гибридов не получено. Фузия – универ- сальный метод для клеток любых микроорганизмов. После разрушения клеточной стенки протопласты сшивают. Ра- нее для этого использовался вирус Сендай, в настоящее время исполь- зуется водорастворимый полимер – полиэтиленгликоль. Протопласты сшиваются, в местах слипания мембран происходит разрыв, и содер- жимое двух соседних протопластов объединяется. Образующиеся структуры сохраняют способность к восстановлению клеточной стен- ки. В результате появляются гибридные клетки. Однако слияния недостаточно для получения гибридных клеток, так как гибриды обладают меньшей способностью к росту и размноже- 22 нию, чем оставшиеся в культуре родительские клетки. Поэтому для получения культуры гибридных клеток используют специальные приёмы. Чаще всего применяют селективные среды. Подбираются клетки, обладающие различными генетическими дефектами, и создаёт- ся специальная среда для культивирования. На этой среде смогут расти только гибридные клетки, обладающие восполненными свойствами за счёт обеих родительских клеток. Таким образом производят отбор гиб- ридных клеток, то есть гибридная клетка содержит оба родительских хромосомных набора. Хромосомы обеих родительских клеток могут функционировать одновременно, при этом происходит дополнение (на языке генетики – комплементация) признаков. Исследование гибридов позволяет установить, какая из хромосом ответственна за синтез того или иного белка. С помощью гибридных клеток, полученных слиянием клетки опухоли костного мозга мыши или крысы (так называемой миеломы) с иммунным лимфоцитом, син- тезирующим определённые антитела, получают гибридомы. На гибри- домах изучают механизмы клеточного размножения, с их помощью получают моноклональные антитела, используют в медицинской диаг- ностике. 23 4 ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА МЕТАБОЛИТОВ 4.1 Классификация продуктов биотехнологических производств Биотехнологические производства основаны на использовании жизнедеятельности микроорганизмов. Чтобы управлять микробиоло- гическим процессом, необходимо знать физиологию применяемых культур микроорганизмов. Это позволит контролировать процессы, протекающие в клетке, условия культивирования и влияние основных факторов окружающей среды на направленный биосинтез. Продуктами биотехнологических производств являются природ- ные макромолекулы – белки, ферменты, полисахариды, полиэфиры, выделенные из клеток микроорганизмов, тканей и органов растений и животных. 1 – биомасса; 2 – продукт Рисунок 2 – Динамика изменения биомассы и образования первичных (А) и вторичных (Б) метаболитов в процессе роста организма По отношению к процессам роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся на первичные и вторичные метабо- литы. Первичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения (молекулярная масса менее 1500 Да), необходимые для роста микроор- ганизмов. Одни из них являются строительными блоками макромоле- кул, другие участвуют в синтезе коферментов. Среди наиболее важных для промышленности метаболитов можно выделить аминокислоты, органические кислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, рас- творители и витамины. 24 Вторичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста в чистой культуре. Ко вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токси- ны. 4.2 Общая схема биотехнологического производствапродуктов микробного синтеза Процессы биотехнологических производств разнообразны, но все они имеют пять основных стадий: 1) приготовление питательной среды; 2) подготовка посевного материала; 3) культивирование микроорганизмов; 4) выделение целевого продукта; 5) очистка целевого продукта. Принципиальная биотехнологическая схема производства про- дуктов микробного синтеза показана на рисунке 3. Приготовление питательных сред. Среда должна отвечать двум основным требованиям. Во-первых, она должна быть полноценной для питания и недорогой. Углерод и азот в усвояемой форме требуются для биосинтеза белка; фосфор необходим для синтеза ДНК и АТФ; микро- элементы требуются для образования ферментов, также для нормаль- ной жизнедеятельности нужны факторы роста и витамины. Во-вторых, среда должна быть стерильной, что достигается температурной, ульт- рафиолетовой, ультразвуковой и другими видами обработки. Получение посевного материала (инокулята) проводится по сле- дующей схеме: пробирка получение культуры в микробиологической лаборатории выращивание микроорганизмов в малом инокуляторе выращивание микроорганизмов в большом инокуляторе Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования. 25 приготовление питательной среды подготовка посевного материала культивирование разделение биомасса убитых клеток биомасса живых клеток клетки культуральная жидкость дезинтеграция убитых клеток выделение и очистка метаболитов концентрирование стабилизация продукта обезвоживание сухой продукт жидкий продукт хранение применение продуцент Рисунок 3 – Принципиальная биотехнологическая схема производства продуктов микробного синтеза 26 Культивирование (ферментация) представляет собой совокуп- ность последовательных операций от внесения в заранее приготовлен- ную питательную среду посевного материала до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпания питательных веществ сре- ды. Существует два основных типа ферментаций: получение биомассы микроорганизмов и получение метаболитов. 4.3 Биотехнология получения первичных метаболитов 4.3.1 Производство аминокислот В промышленности аминокислоты получают: 1) гидролизом природного белоксодержащего сырья; 2) химическим синтезом; 3) микробиологическим синтезом; 4) биотрансформацией предшественников аминокислот с по- мощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико- микробиологический метод). Для гидролиза могут быть использованы отходы мясоперераба- тывающей промышленности (отходы обработки животного сырья, кровь и т.д.), яичный белок, казеин молока, клейковина пшеницы, со- евый шрот и т.д. При гидролизе белоксодержащее сырьё нагревают с растворами кислот и щелочей, при температуре от 100 до 105 ºС в те- чение 20…48 часов. При этом аминокислоты переходят в гидролизат, и для выделения отдельных аминокислот необходима сложная многоста- дийная очистка. Кроме того, само сырье считается дефицитным и до- рогим, поэтому аминокислоты имеют высокую себестоимость. Кроме того, может разрушиться часть аминокислот, таких как триптофан, цистеин, метионин, тирозин, а также происходит рацемизация. Химический синтез аминокислот достаточно эффективен, однако его недостатком является то, что в процессе синтеза образуется смесь из биологически активной L-формы и D-изомера аминокислоты. D- форма является балластом, так как не усваивается животными и чело- веком, а некоторые D-формы аминокислот обладают токсическими свойствами. Разделение изомеров – дорогая и трудоемкая процедура. Синтетически производится незаменимая аминокислота метионин. Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологи- ческий синтез аминокислот; 60 % высокоочищенных препаратов ами- нокислот получают именно этим способом. Преимущество его состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья. 27 В последние годы широко используется биотрансформация предшественников аминокислот, полученных химическим синтезом с помощью клеток микроорганизмов или иммобилизированных фермен- тов. Среди продуцентов аминокислот используются дрожжи (30 %), актиномицеты (30 %), бактерии (20 %). Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum более трети сахаров превращают в лизин. Для селекции продуцентов используются микроорганизмы, отно- сящиеся к родам Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter. Глутаминовая кислота – первая аминокислота, полученная мик- робным синтезом. Глутаминовая кислота относится к заменимым ки- слотам, обладает приятными органолептическими свойствами и нахо- дит самое широкое применение. Ее продуцентами являются бактерии Corinebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum и др. Лизин образуют многие микроорганизмы: бактерии, актиноми- цеты, сине-зеленые водоросли, некоторые виды микроскопических грибов. В нашей стране в качестве продуцентов лизина используют бактерии родов Corinebacterium (С. glutamicum), Micrococcus, Brevibacterium. Триптофан образуют микроорганизмы бактериального и грибно- го происхождения: родов Micrococcus sp., Candida utilis, Bacillus subtilis. Основными потребителями аминокислот являются сельское хо- зяйство и пищевая промышленность. Аминокислоты, чаще всего ли- зин, используют в качестве обогатителей кормов и пищевых продуктов растительного происхождения для повышения их питательной ценно- сти и для сбалансирования пищи по незаменимым аминокислотам. Ис- пользование 1 т лизина в комбикормовой промышленности позволяет экономить от 40 до 50 т фуражного зерна. Некоторые аминокислоты используют в качестве приправ, так как они обладают определенными вкусовыми свойствами и могут со- общать продукту приятные аромат и вкус. Большое распространение имеет глутаминовая кислота и ее натриевая соль (глутамат натрия), которая является эффективным усилителем вкуса мясных и овощных блюд. Данную аминокислоту добавляют во многие продукты при кон- сервировании, замораживании и длительном хранении. Для улучшения органолептических показателей мясных продук- тов, придания им специфического приятного вкуса и аромата исполь- зуют цистин, лизин, гистидин. Цистеин и цистин с глутаматом натрия 28 создают имитацию запаха и вкуса мяса, что используется при приго- товлении приправ. Многие аминокислоты: лизин, аланин, пролин, валин и другие могут снимать неприятные запахи и используются в качестве дезодо- рантов пищевых продуктов. Аминокислоты обладают оригинальным вкусом и участвуют в образовании вкусовых особенностей пищевых продуктов. Например, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, кислые на вкус, в нейтральных растворах имеют очень приятный оригинальный вкус, глицин обладает характерным вкусом «освежающей» сладости, которая по интенсивно- сти близка к сахарозе. Особый интерес представляет подсластитель аспартам, молекулу которого образуют две аминокислоты – фенилаланин и аспарагиновая кислота. Эти аминокислоты синтезируются микробиологическим пу- тем, а аспартам из этих мономеров – с помощью ферментов. Сладость аспартама в 200 раз превышает сладость сахарозы. 4.3.2 Производство витаминов Витамины представляют собой группу незаменимых органиче- ских соединений различной химической природы, необходимых лю- бому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нём каталитические и регуляторные функции. Витамины не образуются у гетеротрофов. Способностью к синтезу витаминов обладают лишь ав- тотрофные организмы. Микробиологическим способом можно получить практически все известные витамины. Однако экономически более целесообразно получать витамины выделением из природных источников или с по- мощью химического синтеза. С помощью микроорганизмов целесооб- разно получать сложные по строению витамины: β-каротин (провита- мин А), В 2 , В 12 и предшественники витамина D. Витамин В 12 (цианокобаламин). В тканях животных концентра- ция витамина очень низкая (в печени быка 1 мг/кг) для того, чтобы использовать этот источник для промышленных целей. Химический синтез очень сложен. Синтезировать витамин В 12 способны уксусно- кислые бактерии, грибы и пропионовокислые бактерии. Наибольшее промышленное значение имеют Рго-pionibacterium и Pseudomonas (P. denitrificans). Концентрат витамина B 12 предназначен для обогащения кормов животных. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином B 12 29 используют пропионовокислые бактерии, как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке. Витамин В 2 (рибофлавин) можно в небольших количествах вы- делять из природного сырья. В наибольшем количестве он содержится в моркови и печени трески. Наиболее активными продуцентами вита- мина B 2 являются дрожжеподобные грибы рода Eremothecium ashbyii, входящие в класс аскомицетов, а также бактерии Bacillus subtilis. Ви- тамином В 2 обогащают некоторые сорта белого хлеба, его используют для окраски пищевых продуктов в оранжево-желтый цвет. Каротиноиды – это предшественники витамина А, среди которых наиболее активен β-каротин. В организме человека каротиноиды не синтезируются, поэтому должны поступать извне. В печени каротин превращается в витамин А. Продуцентами каротиноидов могут быть грибы и дрожжи. В промышленности β-каротин чаще всего получают с помощью микроскопического гриба рода Blakeslea trispora. β-Каротин используют при изготовлении пищевых продуктов как краситель. Его применяют при изготовлении колбас с целью замены нитрита натрия и обеспечения высокой интенсивности и устойчивости цвета. Используют при производстве леденцов, пищевых паст, кексов и других кондитерских изделий. Во многих странах β-каротин применя- ют для подкрашивания сливочного масла. Кроме того, он обладает ан- тиокислительными свойствами, которые используются для продления срока хранения продукта. Витамин D 2 промышленно синтезируют с помощью дрожжей Saccharomyces serevisiae. Витамин используется для лечения и профи- лактики рахита человека и животных. 4.3.3 Производство органических кислот В настоящее время биотехнологическими способами получают в промышленных масштабах ряд органических кислот. Из них лимон- ную, глюконовую, кетоглюконовую и итаконовую кислоты получают лишь микробиологическим способом, молочную, салициловую и ук- сусную – как химическим, так и микробиологическим, яблочную – хи- мическим и энзиматическим путём. Уксусную кислоту продуцируют Aсеtobacter и Gluconobacter, лимонную – Aspergillus niger, Aspergillus wentii, молочную – Lactobacillus delbrueckii. В качестве сырья для получения пищевого уксуса используют виноградное вино, пивное сусло, мед, соки различных фруктов и ягод после спиртового брожения или водный раствор этилового спирта для получения белого уксуса. Кроме спирта среда содержит уксусную ки- 30 слоту и минеральные соли, в состав которых входят азот, фосфор, сера, марганец, калий. Иногда добавляют источники витаминов в виде раз- личных экстрактов. Спирт служит источником углерода и энергии для бактерий. Уксусная кислота стала первым микробиологическим продуктом, полученным с помощью иммобилизованных клеток. Этот способ мо- жет быть непрерывным и периодическим. В течение длительного вре- мени применяется адсорбирование уксуснокислых бактерий на древес- ной стружке, древесном угле, коксе и других субстратах, Пропуская раствор этанола через генераторы с иммобилизованными бактериями, получают 10…15%-ный раствор уксусной кислоты. При этом из 100 л безводного спирта теоретически должно быть получено 103 л уксусной кислоты. На практике выход уксуса из 100 л этанола редко превышает 90 л, что связано с переокислением и неполным окислением этанола бактериями, а также с его испарением. Уксус, полученный при брожении, имеет приятные аромат и вкус, которые обусловливают побочные продукты брожения: сложные эфиры (этилацетат и другие), высшие спирты, органические кислоты. В столовом уксусе содержится от 5 до 9 % уксусной кислоты. Уксус с концентрацией кислоты от 20 до 30 % получают путем вымо- раживания исходного раствора. Путем перегонки получают 70…80%- ную уксусную кислоту, называемую уксусной эссенцией. Ледяная ук- сусная кислота содержит от 98,0 до 99,8 % кислоты. Уксусную кислоту или уксус широко используют в пищевой промышленности. Уксус, полученный микробиологическим путем (пищевая уксусная кислота, столовый уксус), различается по сортам в зависимости от характера сбраживаемого субстрата. Известен яблоч- ный, виноградный, грушевый и другие сорта уксуса. Уксус также при- меняют для растворения органических красителей, при получении ме- дикаментов, пластмасс и т.д. Лимонная кислота широко распространена в природе, относи- тельно много ее содержится в некоторых ягодах, фруктах, особенно в цитрусовых (в лимоне от 5 до 10 %), в листьях и стеблях некоторых растений. Ранее лимонную кислоту выделяли в виде лимоннокислого каль- ция из продуктов переработки листьев хлопчатника, стеблей махорки, хвои ели и в значительных количествах из плодов лимонов. Однако это производство является крайне дорогим и небольшим по объему. По- этому лимонная кислота была дефицитным и дорогим продуктом. 31 В настоящее время лимонная кислота по объему производства является одним из главных продуктов микробного синтеза, ее общий выпуск в разных странах достигает 400 тыс. тонн в год. Для получения лимонной кислоты используют микроскопиче- ские грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Ustina и др. В на- стоящее время основными продуцентами лимонной кислоты являются различные штаммы гриба Aspergillus niger. Сверхсинтез лимонной кислоты происходит при лимитировании роста грибов-продуцентов минеральными компонентами среды и од- новременном избыточном содержании источника углерода. В условиях лимитирования роста гриба недостатком железа и марганца после пол- ного поглощения из среды дефицитного элемента он прекращает расти, однако продолжает потреблять имеющийся в среде источник углерода. При этом в клетках гриба начинает накапливаться лимонная кислота, которая в дальнейшем выделяется в среду. Посевной материал в виде спор (конидий) выращивают на ме- лассной среде поверхностным или глубинным способом. Лимонную кислоту выделяют из культуральной жидкости в виде плохо растворимой соли – цитрата кальция, которая образуется при добавлении мела. Перевод лимонной кислоты в свободное состояние достигается при добавлении строго определенного количества серной кислоты: Цитрат кальция + Н 2 SO 4 = Цитрат + Гипс. Гипс удаляют фильтрованием. Раствор лимонной кислоты освет- ляют активным углем, упаривают, кристаллизуют. Лимонная кислота используется в кондитерской промышленно- сти для подкисления карамели, пастилы, вафель, так как она хорошо подчеркивает фруктовый вкус. Данную органическую кислоту в целях подкисления добавляют в мороженое, пищевые концентраты, марга- рин, некоторые сорта колбас и сыра. Лимонную кислоту применяют для торможения образования ме- ланоидинов в сгущенном молоке с сахаром, раствором ее промывают и дезодорируют жировое сырье, обрабатывают перед холодным хране- нием свежее мясо, рыбу, фрукты с целью стабилизации их цвета, вкуса и запаха. Соли лимонной кислоты используют для изготовления шам- пуней и других моющих средств, так как они стимулируют вспенива- ние и обеспечивают механическую устойчивость пен. Молочная кислота с 1881 г. производится промышленным спо- собом с помощью молочнокислых бактерий. Для промышленного из- 32 готовления молочной кислоты пригодны только гомоферментативные молочнокислые бактерии, образующие до 98 % молочной кислоты. Применяются штаммы Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus bulgaricus. Молочнокислые бактерии преобразуют в молочную кислоту са- мые разные углеводы, поэтому для промышленного получения этой кислоты используют мелассу, молочную сыворотку, глюкозу, мальто- зу, сахарозу, лактозу, осахаренный крахмал и пр. Молочную кислоту в промышленных условиях получают мето- дом анаэробной глубинной ферментации. Во время ферментации рН среды поддерживают, добавляя мел. Через 6…7 суток культивирования в среде остается от 0,5 до 0,1 % сахаров и от 11 до 14 % лактата каль- ция. Из 100 г сахаров получают от 80 до 90 г лактата кальция. Осадок мела и коллоиды отделяют фильтрацией. Фильтрат упа- ривают, охлаждают и кристаллизуют. Кристаллы лактата отделяют центрифугированием. Молочную кислоту из лактата получают разло- жением серной кислотой. Реакция идет при температуре от 60 до 70 °С в соответствии с уравнением: Ca(C 3 H 5 O 3 ) 2 + H 2 SO 4 2C 3 H 6 O 3 + CaSO 4 Молочную кислоту обрабатывают активированным углем, фильтруют и фасуют. Конечный продукт – в виде жидкого концентрата молочной кислоты. Молочную кислоту применяют для приготовления джемов, в ко- торых она способствует хорошей консистенции. Молочная кислота как регулятор рН, улучшитель вкуса применяется в производстве многих сыров, квашении капусты, в сухом концентрате кваса. В хлебобулоч- ном производстве молочная кислота и лактаты увеличивают объем мякиша и улучшают корку хлеба при использовании муки низкого ка- чества. Способность лактатов удерживать влагу применяют в произ- водстве колбас, сыров, детского питания. Молочную кислоту также используют для ускорения получения молочно-белкового сгустка при производстве творога. |