эпизотология. Учебное пособие к лабораторным занятиям (Часть I) для студентов высших учебных заведений по специальности 36. 05. 01 Ветеринария
 Скачать 2.16 Mb.
|
|
Тема 6: Виды серологических реакций. Техника постановки серологических реакций. Цель занятия: ознакомиться с принципами постановки серологических реакций и оформлением документации по результатам исследований. Оборудование: Пробирки пипетки, планшеты, диагностические наборы Место проведения занятий: лаборатория и практикум кафедры эпизоотологии. Для диагностики инфекционных болезней широко используют серологические реакции. С помощью серологических реакций можно обнаружить как антитела, образовавшиеся в организме животного на внедрение возбудителя, так и антигены патогенных микроорганизмов. Существует целый ряд серологических реакций и реакция преципитации, реакция агглютинации, реакция связывания комплементом и т.д. Наиболее часто для диагностики инфекционных болезней применяют следующие серологические реакции: Реакция преципитации (РП). Существует несколько способов постановки реакции. Кольцепреципитация предложена Асколи в 1910 г. Используется для диагностики сибирской язвы. Для постановки реакции используют преципитирующую сыворотку и АГ полученный из патматериала, а также в качестве контроля используют стандартный АГ, полученный из культуры сибиреязвенных бацилл на биофабрике. АГ из патматериала готовят следующим образом. Вначале патматериал автоклавируют, затем его разводят физраствором в соотношении 1:10 для экстрагирования. Существует 2 способа выделения АГ.: 1-й: горячий способ-кипячение в течение 10-15 мин. 2-й: холодный - выдерживание экстракта в течение 16-20 часов при 8-10°С. Затем экстракты полученные одним из способов фильтруют через асбестовый фильтр. Полученный фильтрат наслаивают на преципитирующую сыворотку, внесенную в уленгутовские пробирки. Одновременно ставят контроль со стандартным АГ. При положительной реакции в течение 1-2-х мин., но не позже чем через 5 мин. после соединения компонентов на границе их соприкосновения появляется тонкое беловатое кольцо. Положительная реакция должна быть и при постановке со стандартным сибиреязвенным АГ. Реакция диффузионной преципитации (РДП) и ее разновидность реакция иммунной диффузии (РИД) ставятся на чашках Петри или на стекле, куда предварительно был внесен расплавленный гель агара или агарозы и были сделаны пробойником отверстия, для внесения в них АГ и АТ. РИД широко применяется для диагностики лейкоза и бруцеллѐза. Реакция агглютинации (РА) основана на склеивании (скучивании) микробов в присутствии сыворотки, которое видно невооруженным глазом. РА применяется при диагностике бруцеллеза. РА характеризуется высокой специфичностью. Ее можно использовать как при диагностике, выявляя АТ в сыворотке крови, так и для идентификации микроорганизмов при помощи наборов стандартных сывороток, в которых есть специфические АТ. В данном случае еѐ очень часто используют для диагностики паратифа. РА может быть пробирочной и на плоском стекле. Одна из разновидностей РА носит название кровекапельной (КРА), которая широко применяется в птицеводстве для диагностики пуллороза. Другая – реакция микроагглютинации (РМА) применяется для диагностики лептоспироза. Реакция связывания коплемента (РСК) состоит из 2 отдельных реакций. На 1-м этапе в реакции участвуют АГ и АТ (один из этих ингредиентов заранее известен), а также определенное количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии АГ и АТ их комплекс связывает комплемент, что и выявляется на 2-м этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним). Если комплемент связался при взаимодействии АГ и АТ, то лизис бараньих эритроцитов не происходит (положительная РСК). При отрицательной РСК комплемент способствует гемолизу эритроцитов. РСК применяют при диагностике бруцеллеза, лептоспироза, сапа и др. болезней. Реакция нейтрализации (РН), основана на способности специфических АТ прочно соединятся с вирусной частицей. РН основная серологическая реакция для диагностики большинства вирусных болезней. РН позволяет идентифицировать, а затем определить типовую принадлежность выделенного вируса, а также для исследования, так называемых парных сывороток болевших или вакцинированных животных по изменению титра АТ. Результаты РН становятся очевидными после того, как смесь вируса и гомологичных ему АТ после определенной по времени экспозиции будет внесена в чувствительную биологическую систему (тканевая культура клеток, куриный эмбрион), где вирус может размножаться и вызывать поддающиеся учету изменения, которые будут подавлены частично или полностью в присутствии АТ. Метод флюоресцирующих антител (МФА). Метод основан на визуальном учете специфического взаимодействия флюоресцирующих АТ с гомологичными АГ. Образующийся при этом комплекс АГ-АТ, меченый флюорохромом, легко обнаруживается по характерному свечению в сине- фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа. Применяют при диагностике многих вирусных и бактериальных болезней. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА), (РПГА). Для ее постановки используют тонированные или формализированные эритроциты барана, на которые искусственно предварительно адсорбированы АГ или АТ. Такие эритроциты приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (АГ). Учет реакции проводят визуально по характеру сформировавшегося осадка или агглютинатов. По чувствительности РНГА превосходит все ранее перечисленные реакции и приближается к иммуноферментному анализу. В настоящее время используется для диагностики многих вирусных и бактериальных болезней, в том числе и сибирской язвы. Иммуноферментный анализ (ИФА). Принцип иммуноферментного анализа заключается в специфическом взаимодействии АТ, «меченых» ферментом - пероксидазой хрена, с АТ к испытуемому АГ-ну, а также цветного индикатора, в результате чего достигается визуальная возможность обнаружения иммунного комплекса АГ-АТ. В настоящее время ИФА широко используется при диагностике практически всех инфекционных болезней как по обнаружению АТ в сыворотке к возбудителю болезни, так и АГ микроорганизмов при помощи диагностических сывороток (глобулинов). Оформление документов для отправки проб крови в лабораторию. Пробы крови направляют в ветеринарную лабораторию вместе с сопроводительным документом и ведомостью в двух экземплярах. ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ 1. Принцип постановки серологических реакций. Что выявляют серологическими реакциями. 2. Компоненты и особенности постановки реакции преципитации (РП). Для диагностики каких инфекционных болезней применяют РП. 3. Компоненты и особенности постановки реакции агглютинации (РА). Для диагностики каких инфекционных болезней применяют РА. 4. Компоненты и особенности постановки реакции агглютинации (РСК). Для диагностики каких инфекционных болезней применяют РСК. 5. Компоненты и особенности постановки реакции нейтрализации (РН). Для диагностики каких инфекционных болезней применяют РН. 6. Компоненты и особенности постановки реакции флюоресценции (МФА). Для диагностики каких инфекционных болезней применяют МФА. 7. Компоненты и особенности постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Для диагностики каких инфекционных болезней применяют РНГА. 8. Компоненты и особенности постановки иммуноферментного анализа (ИФА). Для диагностики каких инфекционных болезней применяют ИФА. 9. Оформление сопроводительной документации на взятую для лабораторных исследований кровь. Тема 7: Аллергическая диагностика. Организация проведения аллергических исследований. Цель занятия: освоить технику аллергического диагностического исследования животных разных видов, приобрести навыки оценки аллергических реакций и оформления документов. Материалы и оборудование: инструменты для постановки аллергических проб, набор аллергенов. Место проведения занятий: лаборатория и практикум кафедры эпизоотологии, также факультетская клиника. Разновидностью иммунологического метода диагностики является - аллергический. Этот метод диагностики основан на явлении, которое называется сенсибилизация. Сенсибилизация – приобретение организмом повышенной чувствительности к чужеродным веществам – аллергенам. Так же, как и серологическим методом, аллергическим исследуют животных в благополучных хозяйствах для контроля благополучия, а в неблагополучных по болезням хозяйствах для выявления «скрытых» больных и зараженных животных. При некоторых болезнях — их иногда называют инфекционно-аллергическими больными животными. Фактор аллергизации организма имеет важное патогенетическое и диагностическое значение. Указанные болезни диагностируют с помощью аллергических проб (сап, туберкулез, паратуберкулез, бруцеллез, туляремия и др.). Аллергическая проба — это диагностическая реакция (при инфекционных и паразитарных болезнях), выявляющая состояние аллергии, проявляющейся повышенной чувствительностью клеток и тканей организма после введения аллергена: в кожу, на кожу (при еѐ скарификации), на конъюнктиву глаза (реже подкожно и внутривенно). Результаты обычно учитывают через 1-3 суток. Аллергия проявляется в виде местной реакции (воспаления, отека, гиперемии, болезненности); при сенсибилизации организма она может развиться быстро (в течение 3-7 дней), иногда раньше, чем выработаются антитела, и сохраняться долго (месяцы или годы). Аллергическая проба очень проста в выполнении, а еѐ результаты наглядны. Возможны и неспецифические, т.е. ложные реакции (парааллергия и псевдоаллергия), также анергия - отсутствие реакции у больных и ослабленных животных. В ветеринарии аллергический метод диагностики применяют в основном при туберкулѐзе, бруцеллѐзе, сапе, реже листериозе, туляремии сибирской язве (только у свиней), и др. Способы введения аллергенов: 1) внутрикожный (основной); 2) конъюнктивальный; 3) интрапальпепбральный (в веко); 4) подкожный; 5) внутривенный. Для диагностики туберкулѐза применяют ППД-туберкулин для млекопитающих и ППД-туберкулин для птиц, а также КАМ (комплексный аллерген, приготовленный из атипичных микобактерий). При внутрикожной туберкулинизации (т.е. введении туберкулинов), в зависимости от вида, возраста и даже пола используют различные места инъецирования. Крупному рогатому скоту, буйволам, зебу, оленям – в область средней трети шеи, а быкам-производителям – в одну из подхвостовых складок. Мелкому рогатому скоту – в подхвостовую складку, веко, в область внутренней поверхности бедра или локтевой складки. Свиньям – в область наружной поверхности уха на расстоянии 2 см от его основания (в одно ухо ППД для млекопитающих, в другое ППД для птиц). Пушным зверям, собакам, обезьянам – в область внутренней поверхности бедра или локтевой складки. Исключение составляют норки – им вводят в верхнее веко (интрапальпебрально), курам – в бородку, индейкам в подчелюстную складку, кошкам наносят на внутреннюю поверхность уха. Для введения аллергенов используют тонкие специальные иглы для внутрикожных инъекций и шприцы на 1-2 мл с бегунком или безыгольные инъекторы типа «Овод» (БИ-7). Рис.2. Безыгольный инъектор: 1 – рабочее сопло; 2 – флакон с аллергеном; 3 – винт для фиксации флакона; 4 – спусковой рычаг; 5 – рукоятка. Инструментами, предназначенными для туберкулинизации, не разрешается вводить другие препараты. Шприцы и иглы до и после использования стерилизуют в течение 10 мин в дистиллированной или кипячѐной воде, без добавления дезинфицирующих веществ. Шерсть на месте инъекции предварительно выстригают и выбривают, кожу обрабатывают 70% этиловым спиртом. О правильности внутрикожного введения аллергена судят по появлению на месте инъекции бугорка размером с горошину. Объѐм вводимого аллергена обычно равен 0,2 мл. Реакцию на внутрикожно введѐнный туберкулин учитывают: - у КРС, буйволов, зебу, верблюдов и оленей через 72 час; - у коз, овец, свиней, собак, обезьян и пушных зверей через 48 час; - у птиц через 36 час. При учѐте внутрикожной реакции место инъекции пальпируют и определяют размер утолщения по сравнению с соседним участком кожи при помощи кутиметра. При интрапальпебральном способе сравнивают величину век левого (куда вводился аллерген) и правого глаза (контроль). Рис.3. Определение размера утолщения кожной складки с помощью кутиметра при постановке внутрикожной пробы на туберкулез: вверху - кожная складка до введения ППД-туберкулина; внизу - через 72 ч после введения ППД-туберкулина Животных считают положительно реагирующими на ППД-туберкулин в следующих случаях: - у КРС, буйволов, зебу, верблюдов и оленей при утолщении кожной складки на 3 мм и более (независимо от характера реакции); - у свиней, коз, овец, собак, обезьян, птиц по образованию припухлости в месте введения туберкулина; - у норок – при опухании века. Измерений кутиметром у этих видов животных и птиц не проводят. Офтальмопробу (нанесение глазной пипеткой аллергена), применяют при исследовании лошадей на сап, у КРС на туберкулѐз, но только одновременно и с внутрикожной пробой. При постановке офтальмопробы на конъюнктиву глаза наносят 3-5 капель аллергена. Результаты офтальмопробы с туберкулином учитывают у КРС через: 3,6,9,12,24 часа. Положительная реакция на нанесение туберкулина характеризуется выделением из внутреннего угла глаза слизисто-гнойного секрета, накапливающегося, в начале, в конъюнктивальном мешке, а затем вытекающего в виде гнойного шнура. Результаты офтальмопробы на сап учитывают через 3,6,9,12,24 часа после введения малеина. По степени проявления реакции на малеин лошадей подразделяют на: - положительных; - сомнительных; - отрицательных. Положительная реакция характеризуется гиперемией и отѐком конъюнктивы, выделением из внутреннего угла глаза слизисто-гнойного секрета, накапливающегося в конъюнктивальном мешке, а затем вытекающего в виде шнура. Сомнительная реакция характеризуется небольшим слѐзотечением или скоплением гноя в виде шнура. Отрицательная реакция характеризуется слабым покраснением конъюнктивы, незначительным слѐзотечением или полным отсутствием реакции. Для аллергической диагностики бруцеллѐза у свиней применяют аллерген - бруцеллин ВИЭВ. Бруцеллин вводят в тоже место и в той же дозе как и ППД - туберкулин. Реакцию на введение бруцеллина учитывают дважды: через 24 и 48 час путѐм осмотра, а при неясно выраженной реакции пальпацией места инъекции. При обнаружении припухлости – реакцию оценивают как положительную. Для диагностики сибирской язвы у свиней используют сибиреязвенный аллерген-ВНИИВВиМ. Организация массовых аллергических исследований 1) Накануне аллергического исследования осматривают поголовье, обращая внимание на состояние кожи (конъюнктивы). На месте инъекции кожа должна быть без ран, язв, ссадин, узлов, утолщений и отѐков. 2) Оценивают качество аллергического препарата (внешний вид, наличие посторонних включений, этикеток). Срок годности и условия хранения, наличие наставлений по применению. 3) Продумывают способы фиксации животных (расколы, повалы). 4) Обеспечивают проведение данных мероприятий необходимыми трудовыми ресурсами и соблюдение правил техники безопасности. 5) Обеспечивают необходимое количество шприцев и игл, безыгольных инъекторов, дезраствора, кутиметров. 6) Перед внутрикожным введением аллергенов обязательно обрабатывают место инъекции. После окончания аллергического исследования и учѐта реакции составляют Акт, с описью исследованных животных аналогично акту на проведение вакцинации. ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ 1. Принцип аллергической диагностики. 2. Особенности введения и дозы аллергенов различным видам животных и птицам. 3. Какие инструменты и приспособления применяют при постановке аллергических проб. 4. Особенности и сроки учѐта реакции на введение аллергенов различным видам животных и птиц. 5. Организация массовых аллергических исследований. 6. Составить акт аллергического исследования крупного рогатого скота на туберкулѐз. Тема 8: Методика изучения эпизоотической обстановки в районе. Цель занятия: Изучить эпизоотическую обстановку в районе. Составление карты эпизоотического состояния в районе. Материалы и оборудование: журналы учѐта, формы №1-Вет; №2-Вет; №3-Вет, карты эпизоотического состояния района. Место проведения занятий: лаборатория и практикум кафедры эпизоотологии. Изучение эпизоотической обстановки в районе Эпизоотическую обстановку в районе, области, крае, республике характеризует совокупность инфекционных болезней, зарегистрированных на этих территориях за определѐнный период времени или по состоянию на день оценки. Для еѐ оценки на основании количества неблагополучных пунктов по разным болезням и мест их расположения, числа заболевших и павших животных разных видов (по каждой болезни отдельно) определяют нозологический профиль (структуру) инфекционных болезней и удельный вес (долю) каждой болезни в общей заболеваемости животных всеми инфекционными болезнями, а также составляют эпизоотическую карту. Исходные данные для оценки эпизоотической обстановки берутся из трех журналов: «Журнал для регистрации больных животных» формы №1-Вет, «Журнал для записи противоэпизоотических мероприятий» формы №2-Вет, «Журнал для записи эпизоотического состояния района» формы №3-Вет. Нозологический профиль (структура болезней) – это перечень болезней, зарегистрированных на анализируемой территории за определѐнный период времени. Его выражают в виде таблицы, в которой приводится перечень болезней, данные о неблагополучных пунктах, заболевших и павших животных в абсолютных цифрах и удельный вес каждой болезни в %-тах. Удельный вес (Ув) - это доля отдельной болезни в общей заболеваемости животных всеми инфекционными болезнями по количеству неблагополучных пунктов и числу заболевших животных. Удельный вес определяют по формуле: Ув = А * 100 / Б (в %), где: А – количество неблагополучных пунктов (или число заболевших животных) по отдельной болезни; Б – общее количество неблагополучных пунктов (или число заболевших животных) по всем болезням. Карта эпизоотического состояния района предназначена для наглядной регистрации на ней: 1. неблагополучных пунктов (эпизоотических очагов) по инфекционным болезням таких как – сибирская язва, бруцеллѐз, туберкулѐз, ящур, лептоспироз и др., с указанием времени их регистрации на исследуемой территории. 2. мест расположения ветеринарных учреждений, предприятий биологической промышленности, мясокомбинатов, биотермических ям, скотомогильников. Составляют еѐ в два этапа: 1. создание географической основы, включая обозначение административных границ района, крупных рек и озѐр, основных шоссейных и железных, месторасположения центральной усадьбы животноводческих хозяйств, а также населѐнные пункты района, где расположены крупные животноводческие фермы. 2. нанесение условных обозначений специального назначения (условные знаки болезней, ветеринарные учреждения и т.д.) и даты. ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ 1. Показатели для изучения эпизоотической обстановки в районе. 2. Дать определение нозологического профиля и удельного веса инфекционных болезней. 3. Принцип, этапы и исходные данные для составления карты эпизоотического состояния района. |