Учение об инфекции. Факторы патогенности бактерий. Роль микроорганизма, внешней среды и социальных условий в развитии инфекции. Формы инфекции
 Скачать 0.88 Mb.
|
|
6.Клиническая иммунология и ее задачи. Клиническая иммунология — раздел клинической медицины, изучающий патогенез, диагностику, лечение и профилактику заболеваний, в основе которых лежат расстройства функций иммунной системы или состояния, обусловившие выраженные нарушения иммунной реактивности, требующие особого лечения (коррекции). ЗАДАЧИ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ 1. Диагностика и лечение врождённой недостаточности иммунной системы (первичные иммунодефициты). 2. Выявление и лечение приобретённых иммунодефицитов (вторичные иммунодефициты). 3. Диагностика и лечение иммунопатологических проявлений соматической патологии. 4. Специфическая диагностика и лечение аллергии. 5. Диагностика и лечение аутоиммунной патологии. 6. Диагностика и лечение лимфопролиферативных заболеваний. 7. Подбор пары донор-реципиент. 8. Диагностика дефектов иммунной системы при опухолях и их лечение. 9. Выявление конкретного иммунного дефекта и адресная его коррекция. 10. Диагностика иммунных механизмов нарушений репродуктивной функции (беременность, бесплодие, лактация, климакс) и их устранение. За короткую, около 100 лет, историю научной иммунологии, она обусловила реализацию ряда крупных практических проблем. 1. Решена проблема вакцинации против оспы, бешенства, сибирской язвы, дифтерии, полиомиелита, коклюша, кори, столбняка, газовой гангрены и др., в том числе против особо опасных инфекций. К 1978 году ликвидирована оспа. 2. Решена проблема переливания крови путём определения Аг АВО групп крови, что имеет значение не только при переливании крови, но и для медицинской генетики, акушерства, судебной медицины и др. 3. Решена проблема резус-гемолитической болезни новорождённых. 4. Открытие иммунной толерантности и лекарственной иммуносупрессии сделало реальной пересадку чужеродных органов с процентом приживления до 80-90. 5. Усовершенствована диагностика многих инфекционных и неинфекционных заболеваний, иммунодефицитов, аллергии, аутоиммунной патологии, резус-несовместимости, лейкозов и др. за счёт разработки точных иммунных тестов и реакций. 7.Методы оценки иммунного статуса организма человека. Для выявления иммунодефицитных состояний возникает необходимость оценки показателей функциональной активности иммунной системы, т. е. иммунного статуса. Оценка иммунного статуса слагается из нескольких этапов: • Клинико-лабораторный этап, который включает в себя: • сбор и оценку иммунологического анамнеза (частота инфекционных заболеваний, характер их течения, выраженность температурной реакции, наличие очагов хронической инфекции, реакции на вакцинации или введение лекарственных средств); • оценку результатов общего клинического анализа крови (содержание гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов); • выявление с помощью бактериологических, вирусологических и/или серологических исследований бактерионосительства и вирусоносительства. • Лабораторно-иммунологический этап. На этом этапе в иммунологической лаборатории проводятся исследования, целью которых, собственно, и является качественная и количественная оценка функциональной активности иммунной системы (иммуннокомпетентных клеток). Для этого разработан ряд (набор) тестов, которые делят на тесты 1-го (ориентировочного) и 2-го (аналитического) уровней. Тесты 1-го уровня являются ориентировочными и позволяют выявить грубые нарушения деятельности иммунной системы. Они включают в себя определение: • общего и относительного числа лимфоцитов, • основных субпопуляций (Т- и В- клетки), • фагоцитарной активности лейкоцитов, • концентрации иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови. Общее (абсолютное) и относительное число лимфоцитов определяют по данным клинического анализа крови. Содержание Т- и В- лимфоцитов подсчитывают в реакции иммунофлюоресценции, используя меченые моноклональные флюоресцирующие сыворотки к специфическим поверхностным антигенным маркерам, обозначаемым символами CD (claster differentiation). Таких антигенных маркеров известно несколько десятков, но отдельные из них характерны для того или иного типа клеток: • рецептор CD3 — это рецептор всех Т-лимфоцитов, • рецепторы CD19, 20, 21, 72 — В-лимфоцитов, • рецепторы CD4 — Т-хелперы, • рецепторы CD8 — Т-супрессоры , • рецепторы CD16 — NK- клетки (натуральные киллеры). Более доступным и простым, но менее точным и устаревшим является метод розеткообразования. Он основан на том, что В-лимфоциты могут адсорбировать на своей поверхности эритроциты мышей, а Т-лимфоциты — эритроциты барана (их также могут образовывать NK-клетки). Лимфоцит с прилипшими к нему эритроцитами — это и есть розетка, их подсчитывают в окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках из смеси лимфоцитов и соответствующих эритроцитов. Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов крови определяют процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарный показатель (среднее количество микробных клеток, поглощенных одним лейкоцитом). Концентрацию (уровень) иммуноглобулинов разных классов G, М, А и Е в сыворотке крови определяют в реакции преципитации в геле (радиальная иммунодиффузия по Манчини) с антиглобулиновыми сыворотками к Ig G, Ig M, IgA, Ig E, но этот метод имеет достаточно большую ошибку при определении +,- 15 %. Тесты 2-го уровня позволяют провести более глубокий анализ состояния иммунной системы и уточнить характер дефектов, выявленных с помощью тестов 1-го уровня. К ним относятся, например, определение отдельных субклассов иммуноглобулинов (особенно Ig G, секреторного Ig A) и В-лимфоцитов, регуляторных и эффекторных клеток. Кроме того, с помощью иммуноферментных и радиоиммунных методов можно определить концентрации отдельных цитокинов — главных регуляторных молекул, определяющих тип иммунного ответа. Например, интерлейкин-2 является обязательным компонентом иммунного ответа на любые антигены, в том числе и микробные, так как обеспечивает пролиферацию и дифференцировку Т-лимфоцитов. 8.Реакция иммунофлюоресценции (прямая и непрямая) и ее практическое применение. Реакция иммунофлюоресценции- РИФ (метод Кунса). Различают три разновидности метода • прямой, • непрямой, • с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. Прямой метод РИФоснован на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощьюантиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентноммикроскопе, как и при прямом методе. 9. Радиоиммунный и иммуноферментные методы, их сущность и практическое использование. Иммуноблотинг. Радиоиммунный метод, является наиболее информативным, основан на исследованиихарактера взаимодействия антитела с антигеном с образованием иммунного комплекса, в один из компонентов которого (антиген или антитело) введена радиоактивная метка. Наибольшее распространение получил метод конкуренции за специфические антитела меченного радиоактивным изотопом антигена и такого же антигена, но свободного от радиоактивной метки, количество которого необходимо определить в исследуемой биологической среде. С этой целью в исследуемую жидкость, в которой предполагается наличие антигена, добавляют известное количество такого же меченного антигена и стандартное количество антисыворотки с соответствующими антителами. Если в исследуемой жидкости отсутствует искомый специфический антиген, то около 70– 80% меченного антигена связывается с антителами, обусловливая высокую радиоактивность образующегося преципитата. Если же в биологической среде присутствует искомый антиген, он конкурирует с меченным антигеном и связывает часть антител. В результате радиоактивность преципитата падает по сравнению с контролем. На этом принципе основано количественное определение антигенов или антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась не связанной в результате конкуренции с выявляемым не меченым антигеном. При определённых концентрациях количество меченого антигена, связавшегося с антителами, обратно пропорционально количеству определяемого антигена. После взаимодействия антигенов с антителами образовавшийся комплексы антиген – антитело отделяют от свободного меченого антигена. Способы отделения: 1.Электрофорез; 2. Гель – фильтрации; 3.Фракционного осаждения иммунного комплекса этанолом и др. Отделив меченый антиген от комплекса антиген – антитело определяют количество меченого антигена, связавшегося в комплексе по количеству импульсов (сцинтилляционным счетчиком). Уменьшение количества импульсов в единицу времени в сравнении с соответствующими контролями свидетельствует о присутствии гомологичного меченого антигена, связанного с антисывороткой, в результате чего антиген не вступил в реакцию и не определяется в комплексе антиген – антитело. В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях. На протяжении последних трех десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Наибольшее распространение получили гетерогенные методы иммуноферментного анализа, основанные на использовании полистироловых планшетов для иммобилизации антител или антигенов, специфическом связывании определяемого вещества на стенках лунок планшета и последующем выявлении образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов. Иммуноферментный метод основан на учете реакции антиген-антитело, причем в качестве метки, позволяющей обнаружить иммунный комплекс, используют ферменты, например пероксидазу, щелочную фосфатазу. Одним из распространенных вариантов таста ИФА является твердофазный метод «Сэндвич – метод»: вначале на стенках полистироловых пробирок сорбируют антитела против определенного антигена. В эту же пробирку вносят исследуемый биологический образец. Если там содержатся искомые антигены, они взаимодействуют с антителами и вместе с ними фиксируются на стенках пробирки. После этого в пробирку вводят антитела к данному антигену, меченные ферментом, которые также присоединяются к образовавшемуся иммунному комплексу и остаются на стенках пробирки. Для обнаружения и количественной оценки этих комплексов в пробирку добавляют перекись водорода (Н 2 О 2 ) и хромогены. Фермент (пероксидаза) разлагает Н 2 О 2 с выделением кислорода. Последний окисляет хромоген, который приобретает желтый цвет. Интенсивность окрашивания и, соответственно, количество искомого антигена оценивают фотометрически. Этапы проведения ИФА: 1. Инокуляция биоматериала и реактивов в лунки полистироловых планшетов микротест системы (на которых сорбированы Ат против определенного Аг и фермент). 2. Термостатирование и встряхивание на шейкере для равномерного перемешивания реакционной смеси в лунках планшета. 3. Промывка лунок планшета на вошере (автоматический промыватель планшетов) – для отмывки не связавшихся субстанций (Ат, конъюгата и др.). 4. Добавление окрашенного субстрата (хромогена). 5. Регистрация результата на ридере (спектрофотометре, фотоколориметре для определения оптической плотности исследуемого раствора в лунках планшета). В последние годы для количественного радиоиммунного и иммуноферментного определения различных антигенов и антител в биологических средах все чаще используют так называемые моноклональные антитела. Последние получают не путем иммунизации животных, а искусственно, путем синтеза так называемых моноклонов, т. е. культуры клеток, происходящих из одного сенсибилизированного лимфоцита. Моноклональные антитела отличаются от обычных антител, полученных с помощью классической иммунизации животных, очень высокой специфичностью и реагируют только на определенный антиген. Самым распространенным тестом обнаружения аутоантител в исследуемой сыворотке является реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - люминисценция в ультрафиолетовом свете микроскопа биологического объекта, содержащего излучаемый антиген после его предварительной обработки специфическими антителами, меченными флюорохромом. Суть метода заключается в том, что локализация антигена в препарате обнаруживается по специфической флюоресценции в месте реакции антиген – антитело. Метод основан на использовании явления люминисценции для выявления реакции антиген – антитело, происходящей на поверхности клеток или на срезах ткани. При этом антитела, связанны с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. Большое преимущество метода заключается в его простоте, высокой чувствительности, а так же в быстроте получения результатов. Метод был предложен в 1942 г. Кунсом. Специфический белок метят флюорохромами – это такие красители, которые способны поглощать свет и излучать его через короткий промежуток времени (10 -6 – 10 -9 сек). Интенсивность флюоресценции пропорциональна интенсивности возбуждающего излучения, и при малых концентрациях вещества возможно количественно определить флюоресцирующее вещество на микроскопическом или цитологическом препарате. Механизм реакции: происходит конъюгация белка с флюорохромом, которая является по своей сути химической реакцией, в результате чего образуется новое соединение, в котором краситель присоединяется к белку ковалентной связью. В реакции участвуют в основном ε – аминогруппы лизина и концевые аминогруппы белковой молекулы. Метод применяется в трёх основных модификациях: 1. При прямом методе (Кунс и Каплан) на препарат, содержащий искомый антиген, наносят специфическую люминисцентную сыворотку (антитело). После реакции препарат промывают и изучают в люминисцентном микроскопе. Таким образом, реакция протекает одноэтапно. 2. При непрямом варианте РИФ (Уэллер и Кунс). Раствор немеченных антител наносят на срез (ткань различных органов животных, содержащих известные антигены), а затем выявляют их при помощи меченных флюорохромом антииммуноглобулиновых антител. 3. Непрямой метод с комплементом (Гольдвассер, Шепард). Этот вариант метода разработан для определения комплемент – связывающих антител. После обработки среза антителами на него наносят в качестве источника комплемента свежую сыворотку. Комплемент связывается в участках, где фиксированы антитела. В результате эффекта усиления при активации комплемента по классическому пути одна молекула антител может вызывать связывание многих С3 – молекул на срезе; их выявляют, обрабатывая срез флюоресцентно меченными антителами анти-С3. Препараты изучают в люминисцентном микроскопе (ЛЮМАМ). В современной медицинской практике с каждым годом возрастает роль лабораторной диагностики как основного инструмента постановки диагноза и мониторинга терапии. Одним из бурно развивающихся и востребованных методов лабораторной диагностики является иммунохроматографический анализ (ИХА) - метод одноэтапного быстрого качественного определения наличия антител к возбудителям заболеваний in-vitro в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. ИХА - метод сухой иммунохимии, стрип-тест, экспресс-тест или экспресс- анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения этого метода анализа. Принцип действия ИХА с помощью полосок состоит в том, что при погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер), то происходит его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что является уже иммунологическим методом анализа. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы. Несвязавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют со вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса. Взаимодействие (и темная полоса) в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости. Результаты определяются визуально или компьютерной обработкой отсканированного изображения. В ИХА- тестах используется три типа антител: 1. Растворимые моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные ("сшитые") с коллоидным золотом - красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость (мочу, кровь). 2. Поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест-зоне полоски. 3. Вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски. Принцип действия ИХА с помощью |