Иммунология Хаитов. В. Н. Ярыгин профессор, академик рамн, ректорРоссийского государственного медицинского университета академик рамн, председатель Уральского отделения ран. Хаитов P. M., Игнатьева га, Сидорович И. Г
 Скачать 6.93 Mb.
|
|
В классической серологии для характеристики иммуноглобулинов используют не только понятие изотипа, но и такие понятия, как аллотипы и идиотипы конкретных молекул иммуноглобулинов. Эти понятия обусловлены различиями между молекулами иммуноглобулинов, которые можно выявить поре- акции данных белков с антителами к ним. Для этого лабораторных животных иммунизируют так или иначе выделенными препаратами иммуноглобулинов и получают антисыворотки. Во-первых, существует легко выявляемая с помощью ан- тисывороток общность иммуноглобулинов одного изотипа у всех особей данного вида животных (видовая антиклассовая/ субклассовая или антиизотипическая специфичность, те изо- типами иммуноглобулинов называют варианты классов и подклассов (вместе взятые) иммуноглобулинов по тяжелым цепям. У человека есть 9 изотипов: М G2, G3, G4, Е, D. Но отдельные особи одного вида продуцируют несколько отличающиеся варианты иммуноглобулинов в пределах одноименного изотипа — это аллельные варианты, или аллотипы, иммуноглобулинов Факт существования свидетельствует о некотором генетическом полиморфизме внутри вида поло- кусам С-генов как легких, таки тяжелых цепей Антисыворотки против уникальных вариабельных участков молекул иммуноглобулинов называют антиидиотипическими, а эпитопы в молекуле антител — идиотопом — — уникальный, не такой, как другие). Таким образом идиотип антитела — это вариант уникального участка молекулы иммуноглобулина. Перечислим свойства человеческих иммуноглобулинов раз- ых классов (табл. 4.2). 4.2. Свойства человеческих Свойство Молекулярная массах Концентрация в сыворотке крови, Время полураспада в крови, сут Активация комп- лемента по классическому пути Связывание с Fc-рецептором фагоцитов Связывание с тучных клеток и базофилов Способность нейтрализовать инфекционность вирусов и бактерий Экзосекреция через эпителий оболочек Проникновение через плаценту lgG2 146 9 21 ++ +++ — ++ — +++ 146 3 20 + — — ++ — +++ IgG3 IgG4 иммуноглобулинов Тяжелая 165 1 7 +++ ++ — ++ +++ 146 0,5 21 — — — ++ _ +++ μ 970 1,5 цепь 3 6 — — — ++ +++ — 160 0,5 6 — — — + + + + + — δ 184 0,03 3 — — — — — — e 188 0,00003- 0,00005 2 — +++ — ++ — Количественная выраженность того или иного свойства в данном случае представлена в условных знаках «—» — отсутствие «+» немного «++» — больше, чем «+»; — больше, чем «++». 91 Низкие концентрации, например в крови не означают, что организм продуцирует IgA меньше, чем Скорее наоборот суточная продукция IgA возможно максимальна среди прочих изотипов и составляет около 3 г, но его физиологическое место не в крови, он секретируется из внутренней среды во внешнюю — в слизистые экзосекреты и таким образом является фактором специфической иммунной защиты внутренней среды, вынесенным во внешнюю за пределы покровных тканей. Кстати, в работах последних лет появились данные, свидетельствующие о том, что и иммуноглобулины другого изотипа — более чем на 90 % секретируются в слизистый экзосекрет ЖКТ. (Подробнее о функциональных свойствах антител разных классов рассказано в главе 8.) 4.6. Дифференцировка В-лимфоцитов Дифференцировка В-лимфоцитов из общей лимфоидной клет- ки-предшественницы — потомка стволовой кроветворной клетки состоит из следующих этапов и процессов развитие молекулярно-генетического аппарата, обеспечивающего биосинтез иммуноглобулинов — это перестройка генов иммуноглобулинов (обеспечивающая разнообразие антигенсвязывающих областей иммуноглобулинов) и настройка этих генов на продуктивную интеграцию в клеточный метаболизм экспрессия генов молекул, обеспечивающих проведение сигнала с иммуноглобулинового рецептора для антигена внутрь клетки экспрессия генов мембранных молекул, необходимых для участия В-лимфоцита во взаимодействиях с другими клетками, в первую очередь с Т-лимфоцитами и фолликулярными дендритными клетками. Это молекулы CD40, МНС-И, CD45, рецепторы для роста вовремя лимфрпоэза, IL-2 вовремя иммуногенеза); • для эффективного функционирования В-лимфоцитов "существенна экспрессия на мембране корецепторов 19, CD20 и CD21. Неслучайно именно эти мембранные молекулы используются как маркеры для определения содержания В-лимфоцитов лабораторными методами идентификации клеток. Прежде чем описать последовательность событий дифференцировки В-лимфоцитов, скажем о существовании двух известных на настоящее время субпопуляций В-лимфоцитов — и В — это те лимфоциты, про которые знали стали известны относительно недавно и проявили они себя при детальных анализах определенных клинических случаев лейкозов. 92 циты несут мембранный маркер, которого нет на фоцитах, — это Та же молекула экспрессиру- ется и на части поддерживают свою физиологическую регенерацию в течение всей жизни из отдельной клетки-пред- шественницы, пул за счет общей Эта отселяется из кроветворной ткани на свою анатомическую территорию — в ную и плевральную полости — еще в эмбриональном периоде полости В-1-лимфоциты значительно отличаются от В-2-лим- фоцитов по способностям проду- цируемых антител. Антитела, синтезированные тами, не имеют значительного разнообразия вариабельных участков молекул иммуноглобулинов, но, напротив, ограничены в репертуаре распознаваемых антигенов, и эти антигены наиболее распространенные соединения клеточных стенок бактерий. Все В-1-лимфоциты представляют собой как бы один не слишком но определенно ентированный клон продуци- руемые почти исключительно переключение классов не Таким образом, В-1-лимфоциты — «отряд» противобактериальных пограничников в прибарьерных полостях, предназначенных для быстрой реакции на просачивающиеся через барьеры инфекционные микроорганизмы из числа широко распространенных. В сыворотке крови здорового человека часть иммуноглобулинов — продукт синтеза как раз те. это относительно полиспе- цифичные иммуноглобулины антибактериального назначения — это лимфоциты, характеризующиеся широким разнообразием антигенраспознающих участков молекул продуцируемых ими иммуноглобулинов. Они проходят свой лимфопоэз в раннем эмбриогенезе на территории печени, затем исключительно на территории костного мозга, а свой иммуногенез — строго в фолликулах периферических J лимфоидных органов. В лимфопоэзе В-2-лимфоцитов выделяют этапов общая лимфоидная клетка-предшественник] ранняя поздняя про-В-клетка большая пре-В-клетка малая пре-В-клетка незрелая В-клетка зрелая неиммунная В-клетка (выходит из костного мозга в периферическую лимфоидную ткань). Клетки стромы костного мозга обеспечивают оседлость развивающихся за счет взаимодействия определенных молекул межклеточной адгезии и факторы роста для необходимого числа циклов пролиферации. Как и во всех случаях клеточной дифференцировки, самые ранние механизмы комитации к данному пути, а не к другому, неизвестны. Но ряд маркеров движения по пути В-лимфопоэза известны. На ранней лимфоидной клетке-предшественнице экспрес- сируются несколько молекул адгезии, обеспечивающих оседлость в течение необходимого периода времени в костном мозге, среди них VLA-4 (very late antigen-4 — очень поздний антиген 4), лигандом которого на клетках стромы является (vascular cell adhesion — молекула адгезии к стенке сосуда. На ранней про-В-клетке, кроме молекул адгезии, экспрессируется рецептор, называемый для первого фактора роста — мембранной молекулы клеток стромы SCF (stem-cell factor) — стволовоклеточного фактора. Это взаимодействие обеспечивает надлежащее число митозов еще неподеленных наклоны по рецепторам для антигенов предшественников В-лимфоцитов. На следующей стадии — поздней про-В-клетке — экспрес- сируется рецептор для IL-7, воспринимающий секретируемый теми же клетками стромы цитокин IL-7. Выявлен и еще один цитокин, продуцируемый клетками стромы костного мозга, нокаут гена которого полностью отменяет развитие В-лимфо- цитов — это PBSF/SDF-1. Данные взаимодействия поддерживают пролиферацию про-В- и больших пре-В-клеток, в которых уже произошла перестройка генов тяжелой цепи, но еще не было перестройки генов легкой цепи. Таким образом накапливаются «полуклоны» В-лимфоцитов с уже известной специфичностью по тяжелой цепи, но еще неизвестной — по легкой. Это тоже механизм приумножения разнообразия ан- тигенсвязывающего репертуара цельных молекул иммуноглобулинов с одной и той же тяжелой цепью будут сочетаться в пары разные варианты легких цепей. Главные события дифференцировки В-лимфоцитов — перестройка генов иммуноглобулинов — начинаются на стадии ранней про-В-клетки с перестройки D-J в генах тяжелых цепей, причем на обеих гомологичных хромосомах. В поздней про-В-клетке происходит рекомбинация ДНК V-DJ сначала на одной из гомологичных хромосом. Если она окажется непродуктивной, то та же попытка делается на второй гомологичной хромосоме. В случае продуктивной перестройки на первой хромосоме вторая использована не будет. На следующей стадии в пре-В-клетке происходит перестройка легких цепей, причем сначала одной из цепей кили, на одной из гомологичных хромосом. Если не получится продуктивная перестройка с первой попытки в случае легких цепей, предпринимаются следующие. Клетки, в которых не получилось ни одной продуктивной перестройки в генах тяжелых и легких цепей погибают по механизму апоптоза — явления, весьма распространенного для лимфоцитов 4.7. Рецептор В-лимфоцитов для антигена Экспрессия на поверхности клетки продуктов перестроенных генов иммуноглобулинов, кроме того, что является главным «опорным» параметром конечной цели всей дифференцировки В-лимфоцитов, в динамике служит еще и решающими ориентирами процесса развития этих клеток. Собственно связывание антигена — функция вариабельных доменов димера из тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина во всех физических состояниях молекулы этого белка, но чтобы быть рецептором для антигена на клетке чистой молекулы иммуноглобулина мало. Кроме того, что мембранная форма иммуноглобулина имеет дополнительный гидрофобный трансмембранный участок полипептида в тяжелых цепях, в формировании BCR участвуют еще два обязательных полипеп- тида, называемые (неудачно) (рис. 4.6). Дело в том, что участок трансмембранной формы тяжелых цепей состоит из остатков всего 3 аминокислот. Этого мало, чтобы иметь эффективные связи с внутриклеточной метаболической машиной. Рецептор же по определению не только воспринимает сигнал (физически связывает лиганд, но и проводит его внутрь клетки Так вот компоненты BCR и своими цитоплазматическими участками молекулы связаны с внутриклеточными тирозинкиназами, что и обеспечивает проведение сигнала от связывания антигена внутрь клетки, чтобы та могла изменить свой метаболизм в соответствии с внешними запросами. В цитоплазматических участках и присутствуют характерные последовательности остатков аминокис- A - / 4.6. Строение рецептора В-лимфоцита для антигена (схема). 95 лот, называемые активирующими последовательностями (ГТАМ — immunorecep- tor tyrosine-based activation motifs). Такие же последовательности присутствуют в проводящих сигнал компонентах рецептора Т-клеток для антигена. Таким образом известно, что первой биохимической реакцией активации внутриклеточных процессов после связывания рецептором антигена является фосфорилирование остатков тирозина в ITAM. Iga и имеют по одному внеклеточному домену, которым они прочно нековалентно связаны с тяжелыми цепями иммуноглобулинового компонента Экспрессия и начинается на стадии про-В-клетки и поддерживается в течение всего онтогенеза В-лимфоцита до самой терминальной стадии — плазмоцита, на котором экспрессия BCR прогрессивно уменьшается до полного исчезновения. Для того чтобы произошла эффективная активация В-клет- ки через BCR, необходима перекрестная сшивка антигеном нескольких Для этого молекула антигена должна иметь повторяющиеся эпитопы на своей поверхности. Дальнейшие события активации В-лимфоцита показаны на рис. Выявлены 4 тирозинкиназы, ассоциированные си. Сначала первые 3 обеспечивают фосфорилирование двух остатков тирозина в ITAM Iga и К фосфорилированным присоединяется и тем активируется к действию Syk, продолжающая активационный каскад. Тирозинкиназы активируются в результате фосфорилирования водном месте и ингибируются в результате тоже фосфорилирования, нов другом месте молекулы так устроено, чтобы процесс активации клетки не принимал характера вразнос Для активации необходимо дефосфорилирование ингиби- ционных участков молекул тирозинкиназ. Такое дефосфори- лирование катализирует мембранная тирозинспецифичная фосфатаза CD45. Эта молекула имеет несколько изоформ, экспрессирована на всех белых клетках крови, поэтому у нее есть второе название — общий антиген лейкоцитов. Внутри клетки действует еще одна фосфатаза — SHP, торая дефосфорилирует активационные тирозины, чем ограничивает процесс активации лимфоцита. Мыши, у которых этот фермент отсутствует по причине мутации, реагируют на существенно меньшие дозы антигенов, чем нормальные мыши, у них необыкновенно повышен уровень пролиферации лимфоцитов, и эти мыши умирают через несколько недель после рождения с клиническими признаками разлитой аутоиммунной патологии. Тирозинкиназа Syk активирует фосфолипазу (ив свою очередь активирует Raf— киназу, которая фосфорилирует внутриклеточные белки по Тирозинкиназа Syk Syk связывается с фосфорилированными участками молекул и и при этом становится активной Тирозинкиназы Fyn, Связывание BCR с антигеном вызывает активацию ассоциированных с рецептором Активированные киназы фосфорилируют по остатку тирозина кие участки молекул Активированные киназы фосфорилируют и тем "активируют фосфолипазу и Ras. Тирозинфосфатаза отщепляет ингибирующие фосфаты от ных с BCR чем способствует их активации расщепляет фосфатидил-инозитолди - фосфат с образованием диацилглицерола (DAG) и инозитолтрифосфата DAG активирует С Фосфорилирование белков клетки по остаткам серина и треонина способствует повышению концентрации внутри клетки Активация ферментов активирует серин- треонинкиназу Активная Raf фосфорили - рует белки клетки по остаткам серина или треонина Активация белков, взаимодействующих с ДНК. В результате происходит транскрипция с определенных генов 4.7. Активация В-лимфоцита: внутриклеточная передача «сигнала». остаткам серина или треонина, что вносит свой вклад в активацию ДНК-связывающих белков и тем самым способно инициировать транскрипцию с генов. Фосфолипаза катализирует расщепление фосфатидил- инозитола бифосфата на диацилглицерол (DAG) и инозитол трифосфат DAG активирует протеинкиназу С — серии/ треонин киназу, которая начинает фосфорилировать белки по остаткам серина или треонина, что, как и при работе заканчивается активацией транскрипции с генов. Инозитол 4-544 97 трифосфат стимулирует повышение в клетке концентрации свободных ионов Са. В результате активируются кальцийзави- ферменты, что также действует в направлении активации транскрипции с генов. На клеточном уровне активация представляет собой сочетание двух феноменов — пролиферации и/или биосинтеза специфических белков. О том, что проведение сигнала внутрь клетки — не только конечная цельно и необходимо для самого процесса дифференцировки, свидетельствует тот факт, что генетический дефект в тирозинкиназе Btk (Bruton's tyrosine kinase) имеет следствием иммунодефицитную патологию с полным отсутствием у человека В-лимфоцитов — Х-сцепленную агамма- Брутона (Bruton's agammaglobuline- mia — XLA). 4.8. Стадии лимфопоэза В-лимфоцитов Введение в зародышевые клетки перестроенного трансгена тяжелой цепи полностью подавляет перестройку одноименных собственных генов клетки. Но если трансген не содержит кода для трансмембранного участка тяжелой цепи, то трансген не мешает перестройке собственного одноименного гена. Следовательно, для того чтобы в конечном счете дифференцированный имел строго один вариант тяжелой цепи и один вариант легкой, еще в процессе дифференцировки необходима экспрессия тяжелой цепи на мембране. Так оно и есть. Как только в клетке произошла трансляция полипеп- тида тяжелой цепи, он экспрессируется на мембране в составе так называемого пре-В-рецептора. Чтобы это могло случиться, в про-В-клетке синтезируются два специальных по- липептида, которые нековалентно соединяются друг с другом и это соединение называют суррогатной легкой цепью Один из этих полипептидов — второй — VpreB. Таким образом, пре-В-клеточный рецептор состоит из 5 + VpreB + + + + Его экспрессия транзиторна, но абсолютно необходима для правильной дифференцировки В-лимфоцитов. После экспрессии пре-В-рецептора временно инактивируют- ся белки RAG, и клетки вступают в процесс интенсивной пролиферации, которая прекращается с исчезновением этого рецептора. После завершения этой волны пролиферации вновь экспрессируются и RAG2 и начинается перестройка генов легкой цепи. Как только это произойдет, на развивающемся В-лимфоците будет экспрессироваться дефинитивный состава цепь + μ -цепь + + Эту стадию развития называют незрелым Маркером завершения В-лимфопоэза — образования зрелого неиммунного В-лимфоцита, готового к выходу из кост- 98 мозга в периферическую лимфоидную ткань, — является коэкспрессия на мембране двух типов BCR — си альтернативный сплайсинг РНК-транскрипта с тяжелой цепи). Прежде чем произойдет экспрессия на мембране IgD, но после того как произошла экспрессия BcR с полноценным в развитии В-лимфоцитов предусмотрен существенный и обязательный этап дифференцировки — селекция (апоптоз) аутореактивных клонов в местах прохождения лимфопоэза, т.е. па территории костного мозга. В природе устроено так, что связывание антигена незрелой В-клеткой, на которой есть антигенраспознающий рецептор с IgM, но еще нет рецептора с IgD, является сигналом для апоптоза, те. запрограммированной гибели клетки. Таким образом, из случайного репертуара по антигенсвязывающим рецепторам на исходе лим- фопоэза убираются В-лимфоциты, несущие рецепторы, способные с высокой аффинностью связывать белки собственных клеток и растворимые белки, присутствующие в достаточных количествах на территории костного мозга. Такой механизм толерантности к своему называют делецией клона (clonal Толерантностью в иммунологии называют отсутствие иммунного ответа конкретной особи на тот или иной (те или иные) антигены, на который(ые) другие особи либо та же особь, но при иных конкретных условиях онтогенеза, потенциально способны развивать иммунный ответ Делеция клона не единственный механизм установления толерантности к конкретному антигену со стороны В-лимфоцитов. Известно еще два механизма развитие состояния ареактивности (или анергии) и рецептора по антигенной специфичности. Эти два механизма действуют в периферических лимфо- идных тканях. Реальность механизма делеции клона, специфичного к мультивалентному антигену, который экспрессирован на мембранах собственных клеток, хорошо видна в экспериментах с трансгенными мышами. Например, в таком эксперименте, в котором трансгены — легкой и тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, специфичного к молекулам главного комплекса гистосовместимости I класса У таких мышей благодаря описанным выше закономерностям все В-лимфоциты имеют один и тот же BcR с иммуноглобулином, кодируемым трансгеном. Если мыши-реципиенты такого трансгена в собственном организме не имеют антигена-мишени (т.е. у них имеется нормальное количество В-лимфоцитов в периферических лимфоидных тканях, только все они с одними тем же рецептором. Но если мыши-реципиенты сами имеют ген/антиген то у них находят нормальное количество пре-В-клеток, которые, однако, все погибают на территории 99 костного мозга апоптозом ив периферических лимфоидных тканях В-лимфоцитов совсем нет. Потому же механизму кло- нальной делеции погибают и В-лимфоциты на периферии, если они несут рецептор, способный связывать молекулы мембран клеток, которые представлены в большом количестве в тех или иных тканях (например, в печени). Если незрелый В-лимфоцит (с но без связывает растворимый антиген (например, в организме дважды генных мышей один трансген кодирует синтез растворимого белка, второй — антитела к нему, то лимфоцит не элими- нируется апоптозом, а остается в организме, но приобретает состояние анергии: в результате связывания антигена с рецептором не наступает активация лимфоцита к иммунному ответу, наоборот, развивается блок проведения сигнала. У зрелых в лимфоидных тканях на большие дозы растворимых антигенов и особенно при отсутствии адекватного взаимодействия с Т-хелпе- рами также развивается состояние анергии.. Такие клетки долго не живут ив течение нескольких дней все равно поги- бают. Для полноценной реакции на антиген лимфоциту мало только рецептора для антигена. У лимфоцитов есть еще такой обязательный фактор, как корецепторный комплекс мембранных молекул, связанных с внутриклеточными системами проведения сигналов. Не на каждом антигене есть повторяющиеся эпитопы, следовательно, не каждый антиген способен вызвать перекрестную сшивку (или агрегацию) BCR. Вот 4.8. Корецепторный комплекс В-лимфоцита. Связывание рецептора для компле- мента с лигандом приводит к фосфорилированию молекулы. Фосфорилированная молекула связывает (из семейства) и PI-3 (фосфатидилинозитол- 3-киназу), которые вносят свой вклад в ITAM последовательностей в цитоплазматическом участке обеспечивающих передачу сигнала, что усиливает активацию В-лимфоцита. (от Target of proliferative antibody) — ранная молекула, структурно ассоциированная с рецептором В-лим- фоцита для антигена ее функции точно еще не охарактеризованы в этих случаях и нужны дополнительные сигналы. В торный комплекс входят по крайней мере такие мембранные молекулы, как CD19/CR2 (рис. Молекула 19 экспрессирована на всех В-клетках, начиная с ранних стадий лимфопоэза. Генетический нокаут мышей приводит к выраженному дефициту В-клеточ- ного иммунного ответа на любой антиген. Точные механизмы участия 19 в активации антигеном неизвестны. В мембране 19 физически ассоциирована с рецептором го типа для компонентов комплемента — CR2 (Связывание CR2 с компонентами комплемента имеет следствием фосфорилирование молекулы 19 ассоциированными с BCR киназами. Фосфорилированная молекула 19 связывает фосфатидилинозитол-3-киназу и молекулу vav (многофункциональная молекула проведения внутриклеточных сигналов), которые усиливают активационные реакции, инициированные с BCR. Физически в мембране к CD19 и CR2 примыкает (CD81), но роль этой молекулы неизвестна. В результате только совместной работы и корецептор- комплекса возможен запуск в клетке таких процессов, как пролиферация, экспрессия на мембране молекул, необходимых для взаимодействия с Т-лимфоцитами, экспрессия на В-лимфо- цитах молекул МНС-П, необходимых для представления В-лим- фоцитом антигена Т-лимфоциту для распознавания. Приведем краткие суммированные сведения о динамике приобретения признаков дифференцировки вовремя развития В-лимфоцитов (лимфопоэза) (табл. После распознавания антигена и вступления в иммунный ответ в периферических лимфоидных органах и тканях В-лим- фоцит пройдет еще две стадии додифференцировки, которые называют иммуногенезом. На второй из этих стадий произойдет дихотомия В-лимфоцит станет либо В-лимфоцитом памяти (уйдет в дифференцированный резерв на случай, если тот же антиген попадет во внутреннюю среду организма повторно, либо плазматической клеткой — терминальным продуцентом больших количеств секретируемого иммуноглобулина заданной специфичности. Собственно иммуногенез мы будем разбирать ниже, здесь, забегая вперед, приведем признаки дифференцировки В-лимфоцитов на разных стадиях им- муногенеза в В-лимфоциты памяти и плазматические клетки (табл. Третий механизм избегания аутореактивности В-лимфоци- тов, редакция рецептора, — используется, по-видимому, в небольшом проценте незрелых В-клеток, в которых еще активны гены перестройки RAG-1 и RAG-2. В этих клетках связывание в составе BcR на поверхности незрелого фоцита с антигеном является сигналом для запуска нового Таблица Стадии (признаки) дифференцировки |