Иммунология Хаитов. В. Н. Ярыгин профессор, академик рамн, ректорРоссийского государственного медицинского университета академик рамн, председатель Уральского отделения ран. Хаитов P. M., Игнатьева га, Сидорович И. Г
 Скачать 6.93 Mb.
|
|
4.4. Гены иммуноглобулинов Индивидуальный организм здорового человека в течение жизни создает несколько миллионов вариантов антител по способности связывать разные антигены (потенциально антигенов. Никакой геном физически не несет столько отдельных структурных генов. Наследуемое от родителей количество генетического материала (ДНК, предназначенного для программирования биосинтеза антител, не так ужи велико всего 120 структурных генов. Это наследуемое множество генов называют зародышевыми генами иммуноглобулинов, или зародышевой конфигурацией (germline Разнообразие генетических кодов для миллионов вариантов вариабельных участков молекул иммуноглобулинов формируется в течение всей жизни в процессе дифференцировки в каждом отдельном В-лимфоците осуществляется своя уникальная рекомбинация ДНК из зародышевых генов, и трансляция РНК, и последующий синтез белка уже идут с персонального для каждого В-лимфоцита генетического кода V-области. Феномен рекомбинации ДНК β соматических клетках по крайней мере насколько известно современной науке, строго уникален исключительно для лимфоцитов. Подобного никто не наблюдал не только при дифференцировке каких-либо других клеток млекопитающих, но даже и каких-либо клеток иных эукариот. Соматическая рекомбинация ДНК ниспослана только генам антигенраспознающих молекул лимфоцитов иммуноглобулинов в В-лимфоцитах и рецептора Т-кле- ток для антигена в Т-лимфоцитах. Этот уникальный процесс генерации разнообразия анти- генраспознающих молекул внутри организма понадобился для того, чтобы многоклеточные сумели выжить под инфекционным давлением разнообразных земных микроорганизмов. Млекопитающие эволюционируют так медленно, что человеку трудно это даже представить. Микроорганизмы, наоборот, эволюционируют в считанные дни — недели. Так вот лимфоциты — специальное уникальное творение природы внутри организма многоклеточных с неслучайной, но запрограммированной изменчивостью только в генах антигенсвязывающих молекул TCR) в количественном отношении хоть в ка- кой-то мере сопоставимы с разнообразием микробов. Разнообразие это столь велико (например, относительно общего числа клеток в организме млекопитающего, что механизм генерации разнообразия соответствующих структурных генов мог быть (и стал) в основе запрограммированно случайным. Свойство случайности при рекомбинации соответствующей ДНК объясняет тот широко известный факт, что иммунная система в лице лимфоцитов распознает разные вещества, а не только инфекционные микроорганизмы. В естественных природных условиях инфекционные микроорганизмы в большей мере, чем другие внешние объекты, способны прорываться сквозь барьерные ткани многоклеточных. Если покровные ткани подтекают, те. в силу каких-либо патологических причин, например, барьеры ЖКТ или слизистые оболочки дыхательной системы пропускают лишнее из пищи или вдыхаемого вещества, то лимфоциты распознают и реагируют на пищевые и ингаляционные антигены. Но вот к чему природа не готовила иммунную систему, так это к быстрому внедрению непосредственно во внутреннюю среду, минуя барьерные ткани, чужеродных веществ. Это чисто антропогенные деяния по парентеральным введениям, вливаниям чужой крови, трансплантациям органов. Мы разберем в дальнейшем, что, например, трансплантат чужого органа организм реципиента отторгает, как это не покажется странным, но по ошибке, которую совершают примерно % они они на ЧУЖИХ за свои а не 90 % Т-лимфоцитов никогда не ошибались, то чужая почка, печень, кожа, кровь и т.п. оставались бы невидимыми для иммунной системы Примерно 20 лет назад еще методами классической биохимии, а именно аналитическим электрофорезом фрагменти- рованной ДНК, обнаружили, что генетический материал для кодирования белков-иммуноглобулинов структурирован (разорван) на сегменты расположенные друг относительно друга на уловимом расстоянии. Во всех клетках тела, включая стволовую кроветворную, кроме начавших дифференцировку В-лимфоцитов, гены иммуноглобулинов навсегда остаются в «разорванном» состоянии, которое называют зародышевой конфигурацией. И только в В-лимфоцитах на самом раннем этапе их специальной дифференцировки начинается сложный генетический процесс объединения сегментов ДНК предназначенных для кодирования разных частей молекулы иммуноглобулина- и С-фрагментов, причем по отдельности для каждой из 3 типов полипептидных цепей — двух типов легких (кии тяжелой. Это и есть феномен рекомбинации ДНК в соматической клетке. Этот феномен открыли S.Tonegava и его коллеги (1975—1976) при электрофорезе ДНК, выявившем разницу во фрагментах рестрикции из антитело- продуцирующих В-лимфоцитов и из любых других не продуцирующих антитела клеток данного организма (зародышевая конфигурация). Структура генов иммуноглобулинов подробно изучена (рис и 4.4). Отдельные сегменты молекулярно клонированы, определено их число. Кодирующая ДНК для вариабельной части каждой из цепей иммуноглобулина собирается из L Перестройка ДНК Транскрипция: Зародышевая конфигурация ДНК генов Перестроенная Первичный -ААА РНК-транскрипт Сплайсинг первичного транскрипта РНК: Трансляция белка L-Цепь иммуноглобулинов 4.3. Структура генов легкой (L) цепи иммуноглобулинов (схема). У человека 1 - 2 7 1 - У мыши 4.4. Структура генов тяжелой (Н) цепи иммуноглобулинов (схема Сна Сна. Рекомбинация ДНК при переключении синтеза классов иммуноглобулинов в В-лимфоците. тов, извлекаемых из трех отдельных кластеров собственно вариабельный) (код для 95—101 аминокислоты, а также D (diversity — разнообразие) у тяжелых цепей и J (joining связующий) (код для нескольких аминокислот — до 13). Переключение синтеза изотипов иммуноглобулинов показано на рис. 4.5. Гены для локализованы в хромосоме для — в хромосоме 22, гены для тяжелых цепей всех изотипов — в хромосоме 14 (табл. Молекулярные генетики группируют сегменты в несколько семейств. Водно семейство включают в которых более 80 % последовательности нуклеотидов гомологич- ны. Выделяют 7 семейств 7 семейств 8 семейств Таблица. Число сегментов генов вариабельных областей иммуноглобулинов человека* Кластер сегментов V D J Легкие цепи 40 Нет 5 λ Нет 4 Тяжелая цепь 6 * Поскольку молекулярного клонирования трудоемок и его выполняют всякий раз для конкретного индивидуального генома, разумно допустить, что у отдельных индивидуумов конкретное число сегментов может варьировать, нов узких пределах также разным может быть число псевдо- генов. Считают, что члены одного семейства произошли от одного древнего гена путем дупликаций. Рекомбинацию ДНК иммуноглобулинов катализируют специальные ферменты — Эти же ферменты катализируют рекомбинацию ДНК генов TCR в Т-лимфоцитах, т.е. рекомбиназы — уникальные ферменты лимфоцитов. Нов В-лимфоцитах эти ферменты не трогают гены TCR, а в Т- лимфоцитах не трогают гены иммуноглобулинов. Следовательно, до начала процесса перестройки ДНК в клетке уже существуют генрегуляторные протеины — свои у Т-лимфоци- гпов и свои у Гены, кодирующие эти белки, называют мастер-генами. Они в большей степени воображаемые, чем изученные, но являются реальным объектом исследования фундаментальной науки. Субстратом для рекомбиназ служат определенные последовательности нуклеотидов в ДНК генов-мишеней (кстати, одинаковые у Т- и В-лимфоцитов). Эти последовательности фланкируют (те. расположены с ка- кого-либо края) каждый отдельный сегмент генов-мишеней и их называют сигнальными для рекомбинации (rss — recom- bination signal sequence). Rss расположены с З'-конца сегментов, с конца сегментов и с обеих сторон D-сегментов. Последовательность нуклеотидов в rss расшифрована консервативный гептамер CACAGTG, затем вариабельный спейсер из 12 или 23 нуклеотидов и консервативный нонамер ACAAAAACC/GGTTTTTGT. Самый первый акт расщепления цепи ДНК осуществляют два других специальных фермента лимфоцитов — гетеродимер- ные эндонуклеазы, кодируемые генами, называемыми RAG-1 и (recombination-activating genes). Последовательность нуклеотидов в гене RAG-1 подобна таковой в гене дрожжей ив генах топоизомераз бактерий, катализирующих разрывы и сшивки ДНК, что свидетельствует о «глубинном» единстве всего живого. Но среди клеток млекопитающих RAG-1 85 и RAG-2 только в лимфоцитах. Репарацию разрывов ДНК катализируют по крайней мере 3 ядерных фермента один называют аутоантигеном второй — ДНК- зависимой протеинкиназой, третий еще недостаточно охарак- теризован. У мышей с генетическим нокаутом по любому из генов ферментов, участвующих в перестройке ДНК антигенрецеп- торных молекул TCR), лимфоциты не развиваются совсем и имеется клинический синдром тяжелой комбинированной иммунной недостаточности — scid (severe combined В результате данной реакции рекомбинации в непрерывную последовательность ДНК соединяются по одному сегменту из, D- и областей — этот процесс называют нацией. Вся остальная ДНК D- и областей вырезается и выбрасывается из генома в виде кольцевых ДНК. Поэтому приобретение В-лимфоцитом вначале своей дифференцировки специфичности по потенциальному антигену происходит рази навсегда и строго необратимо на уровне ДНК. В каждом единичном В-лимфоците случается своя уникальная комбинация VDJ для тяжелой цепи и VJ — для каждой из легких цепей. Таким образом и подсчитали возможное число вариантов антител по антигенной специфичности, исходя из правил случайной комбинаторики. Для из 40 V- сегментов и 5 сегментов может получиться 40x5 = 200 вариантов области для — 30x4 = 120 вариантов всего для легких цепей 320 вариантов для тяжелой цепи 50V х 30D х 6J 9000 вариантов антигенсвязывающих областей тяжелых полипептидных цепей. В цельной молекуле иммуноглобулинов разные легкие и тяжелые цепи объединяются в тетрамер также случайным образом (по крайней мере теоретически. Число случайных сочетаний из 320 и 9000 около ЗХ10 Но это не все, что обеспечивает разнообразие антигенсвя- зывающих областей антител. Есть еще два молекулярных процесса запланированная неточность связи сегментов V-D-J и запланированный гипермутагенез именно в иммуноглобулинов. Последнее свойство — гипермутагенез — отличает иммуноглобулинов даже от генов TCR: уесть и комбинаторика сегментов, и неточность связи V-D-J, ноне выявлен гипермутагенез. Под неточностью связи V-D-J понимают тот факт, что при формировании этих связей происходит добавление лишних некодируемых наследуемым генетическим кодом нуклеотидов. Их два сорта Р-нуклеотиды и нуклеотиды. Нуклеотиды (от palindromic sequences) возникают на концах сегментов при вырезании одноцепочечных петлей ДНК и достройки хвостов ферментами репарации ДНК. Нуклеотиды N (от non- 86 template-encoded) пристраиваются к одноцепочечной ДНК после вырезания петли специальным ферментом лимфоцитов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой Этот фермент достраивает от 1 до 20 дополнительных нуклеотидов, а ферменты репарации подстраивают комплементарные пары и лигируют (ковалентно продольно состыковывают) двухцепочечную пристройку ДНК с двухцепочечными Р-нуклеотидами. TdT экспрессируется недолго и на ранних стадиях дифференцировки В-лимфоцитов. Поэтому нуклеотиды характерны для тяжелых цепей, поскольку гены тяжелых цепей перестраиваются в первую очередь. Гены легких цепей перестраиваются во вторую очередь ив них нуклеотидов уже не находят. «Платой» за эти попытки увеличить разнообразие антиген- связывающих областей антител, таким образом, является то, что в случаев добавление некодируемых нуклеотидов сдвигает рамку считывания в матричной (м) РНК так, что трансляция белка становится невозможной. Это называют непродуктивной рекомбинацией генов иммуноглобулинов. Зато с учетом присоединения N- и Р-нуклеотидов число пар генов от тяжелой и легкой цепей достигает около 3500 и число вариантов антигенсвязывающих областей цельных молекул иммуноглобулинов, получающихся только в результате комбинаторики сегментов при перестройке ДНК, оказывается порядка 13 . Если учесть врожденные варианты V-, D- и J-сегментов, то мыслимое разнообразие и составляет около 10 16 , но реально меньше, так как в организме нет такого количества лим- фоцитов. Гипермутагенез, процесс возникновения точечных мутаций, происходит не под случайным воздействием космических частиц. Он запланирован и имеет место не вовремя лимфопо- эза В-лимфоцитов в костном мозге, а вовремя иммуногене- за (те. после реально состоявшегося распознавания антигена и начавшегося иммунного ответа) и локализован в лимфоид- ных фолликулах периферических лимфоидных органов и тканей (лимфатических узлах, селезенке, NLT). (Мы вернемся к его рассмотрению в соответствующем разделе) Отметим только, что именно гипермутагенез генов области иммуноглобулинов и отбор В-лимфоцитов по силе связи с антигеном являются механизмом возрастания аффинности антител по мере прогрессивного развития так называемого вторичного иммунного ответа. Интенсивность гипермутаций в в В-лимфоцитах оценивают как замену одного нуклеотида из 1000 на один митоз каждый второй В-лимфоцит клона в зародышевом центре приобретает точечную мутацию в V-Ig. Для всей остальной ДНК явление точечной мутации реализуется с частотой на 9 порядков нижете. одна замена нуклеотида на 10 12 пар нуклеотидов на митоз Процессы перестройки генов иммуноглобулинов в В-лим- фоците отрегулированы так, что из двух родительских хромосом в конечном счете водном В-лимфоците будет использован только единственный вариант как легкой, таки тяжелой цепи. Это явление называют исключением А в организме в целом разнообразие удвоено — половина от «мамы», половина от «папы». Описанные генетические механизмы генерации разнообразия антигенсвязывающих областей антител имеются у человека и мышей. У животных других видов есть иные молекулярные механизмы. Например, у птица также у некоторых млекопитающих (кроликов, овец) нет разнообразия зародышевых сегментов в области. Поэтому первично перестроенные гены иммуноглобулинов одинаковы у всех незрелых В- лимфоцитов. Такие В-лимфоциты у птиц мигрируют из костного мозга в специализированный орган — сумку Фабрициу- са, где они интенсивно пролиферируют. В процессе митозов в уже перестроенных генах области создается разнообразие по механизму, называемому конверсией генов фрагменты ДНК из перестроенной области одной из гомологичных хромосом обмениваются на фрагменты из неперестроенной и ранее неиспользованной области второй из гомологичных хромосом. У овец, например, наибольший вклад в разнообразие антигенсвязывающих областей антител вносят соматические мутации, и процесс их накопления локализован в пейеровых бляшках подвздошной кишки. Структурные гены константных частей полипептидных цепей иммуноглобулинов расположены в тех же хромосомах, что и V-, D- и гены, ниже по течению, тек З'-концу от сегментов. Для легких и существует по одному С-гену - и CΑ. Стыковка нуклеотидного кода для V- и С-частей легких цепей происходит на уровне не ДНК, а РНК — по механизму сплайсинга первичного транскрипта Для каждого изотипа иммуноглобулинов есть свой отдельный У человека такие гены расположены в следующем порядке, считая от сегмента к З'-концу: (псевдоген е-цепи), у мыши Cμ, СуЗ, C α Завершившие лимфопоэз, В-лимфоциты любого клона по антигенной специфичности (специфичности области иммуноглобулина) экспрессируют иммуноглобулины только классов и D. При этом мРНК транскрибируется в виде непрерывного транскрипта с перестроенных генов и При этом ДНК остальных С-генов других изотипов цела и невредима В результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта РНК образуются мРНК отдельно для тяжелых цепей и которые и транслируются в белок. Этим процессом заканчивается полноценный лимфопоэз В-лимфо- Переключение жена синтез иммуноглобулинов других изо- типов (G, Е, А) происходит уже в процессе развития иммунного ответа, те. после распознавания антигена и подвоз- действием определенных (в значительной мере известных на сегодня) цитокинов Т-лимфоцитов и молекул клеточной мембраны Т-лимфоцитов (CD40L). Существенно, что такое переключение вдет опять по механизму рекомбинации ДНК в ДНК к ранее и единожды перестроенной комбинации присоединяется какой-либо один из С-генов тяжелой цепи (либо либо Су, либо СуЗ, либо Су, либо Се, либо 1, либо ДНК неиспользованных С-генов слева от использованного С-гена на этом этапе развития В-лимфоцита элиминируется в виде кольцевых структур. С этого момента судьба В-лимфо- цита определена как по единственной антигенной специфичности, таки изотипу тяжелой цепи. Если из окружений продолжают поступать регулирующие переключение изотипов сигналы, то возможен еще акт переключения на изотип, С-ген которого правее в ДНК от уже экспрессированных С-генов. Если с инструкциями покончено вступает в терминальный этап своего развития он становится плазматической клеткой — продуцентом больших количеств монокло- нального секретируемого иммуноглобулина. При переключении изотипа тяжелой цепи ДНК разрывается по так называемым областям переключения (switch region — расположенных вперед каждым С-ге- ном (за исключением С. SR перед Cμ состоит из 150 повторов последовательности (GGGGGT)]. SR перед другими С-генами отличаются в деталях, ново всех из них содержатся повторы GAGCT и GGGGGT. При переключении изотипов с ДНК работают физически другие ферменты, чем при рекомбинации VDJ (см. рис. Молекулы иммуноглобулина одной и той же специфичности по антигену присутствуют в организме в двух физических состояниях — в растворе и на мембране клеток ив в растворимой форме в крови и других биологических жидкостях клеткой иммуноглобулин); на мембране В-лимфоцита в составе рецептора В-лим- фоцитов для антигена — BCR мембранная форма иммуноглобулина. Трансмембранные формы всех классов иммуноглобулинов, включая и мономеры; в связи с клетками, ноне в трансмембранном варианте, а связанным за конец рецептором клетки. В свободном виде только иммуноглобулины класса Ε 89 ί способны быть связанными сна тучных клетках базофилах, дендритных клетках и некоторых других типах клеток. Для остальных изотипов иммуноглобулинов характерна фиксация на FcR на клетках только после связывания антитела с антигеном, те. фиксируется несвободное антитело, а комплекс антиген — антитело через конец молекулы иммуноглобулина (на макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах). Возвращаясь к трансмембранной и секретируемой формам иммуноглобулинов, отметим, что они различаются по своему С-концу тяжелых цепей в трансмембранной форме у тяжелых цепей молекулы есть лишние 25 остатков гидрофобных аминокислот, которые «заякоревают» молекулу в фосфолипид- ном бислое мембраны. Трансмембранная и секретируемые «версии» тяжелых цепей кодируются разными экзонами соответствующих С-генов. В данном случае экзонами называют структурные гены каждого из отдельных доменов полипептид- ной цепи. Последний экзон каждого С-гена содержит последовательности нуклеотидов для кодирования трансмембранно- го участка молекулы. Первичный транскрипт РНК дифференцирующего В-лимфоцита содержит все экзоны С-гена. Трансляция белка с полноразмерной мРНК обеспечивает биосинтез тяжелых цепей для трансмембранной формы. Но последний экзон может быть легко удален из первичного крипта РНК, и тогда будет транслироваться секретируемая форма иммуноглобулина. В зрелых плазмоцитах трансмембран- ная форма уже совсем не синтезируется, а только продуци- руется секретируемая форма. Изотипы, аллотипы и идиотипы иммуноглобулинов |