уч пособие. Учебное пособие Общая микробиология. Великий новгород
 Скачать 0.68 Mb.
|
Тема 3Культивирование микроорганизмов. Питательные среды. Выделение чистых культур аэробных бактерий. СПОСОБЫ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ.Цель занятия: Ознакомление с правилами работы с бактериальными культурами и методами приготовления и применения питательных сред; изучение методов стерилизации и методики взятия материала из зева для бактериологического исследования. Основные вопросы темы 1. Условия необходимые для культивирования микроорганизмов. 2. Питательные среды, их классификация. 3. Методы выделения чистых культур аэробных бактерий. 4. Методы стерилизации. Химический и бактериологический контроль. 5. Дезинфекция. Механизм действия химических веществ. Понятие асептики и антисептики. Вопросы контроля исходного уровня 1. Составить перечень методов стерилизации с учетом режима стерилизации. 2 . Составить классификационную таблицу по питательным средам. 3 . Написать поэтапный протокол по выделению чистой культуры. БЛОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ИНФОРМАЦИИ. 1. Условия культивирования микробов. Получение культуры микробов проводится для изучения свойств возбудителей инфекционных заболеваний и постановки микробиологического диагноза, для производства биологических препаратов – вакцин, сывороток, антибиотиков, бактериофагов, изучения микрофлоры человека, микрофлоры окружающей среды. При получении культуры бактерий необходимы питательная среда и оптимальная температура. Культивирование микробов проводится на различных питательных средах. Большинство гетерофитных микробов развивается на простых питательных средах. Среды более сложного состава предназначаются для культивирования требовательных к питательному субстрату микробов, которые на простых средах не растут: гонококков, гемоглобинофильных бактерий, туберкулезных палочек и др. Общими требованиями к питательным средам являются: содержание в них веществ – источников углеродного и азотного питания, стерильность, изотоничность, нейтральная или слабощелочная реакция (рН 7.0 – 7,6). Сложные питательные среды по их составу могут быть разделены на элективные, дифференциально-диагностические и накопительные. Элективные среды имеют состав необходимый для определенного вида микроорганизмов. Например, желточно-солевой агар (ЖСА) содержит до 10% NaCl и куриный желток в мясо-пептонном агаре (МПА). При таком большом содержании соли большинство микроорганизмов не размножается и вырастает чистая культура стафилококка, у патогенных штаммов выявляется фермент лецитовителлаза, расщепляющий лецитин желтка питательной среды. Дифференциально-диагностические среды (например, среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гиса) содержат углевод и индикатор, что позволяет определить биохимические свойства бактерий.. 2. Методы выделения чистых культур Выделение чистой культуры проводится для выполнения любого бактериологического исследования, о также является обязательным этапом при получении вакцин и других биопрепаратов. Для этого применяют методы, основанные, прежде всего, на механическом разобщении бактериальных клеток (метод Дригальского), а также на избирательном подавлении размножения сопутствующей флоры химическими факторами (использование избирательных сред), на предварительной обработке (перед посевом) материала с помощью физических и химических факторов и на применении биопроб (в организме чувствительных животных). 3. Способы обеззараживания Стерилизация, т.е. полное уничтожение микробов и их спор, применяется для обеспложивания питательных сред, бактериологической посуды, перевязочных материалов и инструментария (Прил. 1). Асептика – мероприятия, предупреждающие внесение микроорганизмов из окружающей среды в ткани и полости человеческого тела. Антисептика – уничтожение микроорганизмов, способных вызвать инфекционный процесс на коже и слизистых оболочках с использованием йода, спирта, КмnО4 и др. Дезинфекция – обеззараживание, уничтожение патогенных бактерий с помощью химических веществ. По механизму действия их различают: а) денатурирующие белки – фенол, лизол, спирты, кислоты; б) омыляющие – растворяющие белки – гашеная известь, щелочи; в) окисляющие белки – хлорная известь, хлорамин, перманганат калия, пероксиды; г) реагирующие с фосфорнокислыми группами нуклеиновых кислот – акрифлавин, риванол и др. д) поверхностно-активные вещества, вызывающие повреждение клеточной стенки бактерий – мыла, детергенты, жирные кислоты. ТЕСТ ДЛЯ РЕЙТИНГОВОГО КОНТРОЛЯ. 1. Дифференциация бактерий на среде Эндо основана: 1 – на расщеплении глюкозы 2 – расщеплении лактозы 3 – ферментации пептона 4 – образовании кислых продуктов 5 - восстановлении основного фуксина 2. Требования, предъявляемые к питательным средам: 1 – оптимальная рН 2 – наличие ферментов 3 – стерильность 4 – наличие липидов 3. Дифференциально-диагностическими средами с углеводами являются: 1 – МПА 2 – среда Левина 3 – среда Эндо 4 – среда Гисса 5 – среда Леффлера 4. Оптимальный режим стерилизации в автоклаве предусматривает:
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ 1. Знакомство с работой бактериологической кухни и термостата (показывает и объясняет преподаватель). 2. Выделение чистой культуры Е.Coli из смеси бактерий. 1 этап: развести одну петлю исследуемого материала в 4 мл физиологического раствора; сделать посев разведенного материала на чашку с МПА (шпателем Дригальского). 3. Выделение культуры стафилококка из зева студентов. 1 этап: взять стерильным тампоном материал из зева; сделать посев на чашку с ЖСА (тампоном). Практические навыки Техника посева микробных культур и патологического материала на плотные питательные среды Техника взятия мазков из зева Использование дезинфекции при работе с патогенным материалом в лаборатории и в условиях больницы Демонстрационные препараты Агар-агар – продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. Применяется в бактериологии для создания плотности питательной среды. Расплавляется при температуре 80-86оС, застывает при 36-40оС. Желатин – вещество белковой природы животного происхождения. Применяется в качестве плотной питательной среды. Кровяной агар - МПА с добавлением 5 – 10 % дефибринированной крови. Используют для определения гемолитической способности микробов. Среда Леффлера -cмесь одной части лошадиной сыворотки и трех частей сахарного бульона, свернутая в аппарате Коха. Элективная среда для выделения дифтерийных палочек. Среда Гисса. Дифференциально-диагностические среды, содержащие 1% пептонную воду или МПА, 0,5% определенного углевода и индикатор Андреде. Среда при рН 7,2 – 7,4 бесцветная. При ферментации углеводов благодаря образованию кислых продуктов приобретает красный цвет. Среда Эндо. Дифференциально-диагностическая среда, содержащая МПА, 1% лактозы, и индикатор-фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна. При росте бактерий ферментирующих лактозу их колонии окрашиваются в красный цвет, что используется для дифференциации бактерий кишечной группы по ферментативной активности. Среда Плоскирева. Элективная и дифференциально-диагностическая среда, содержит МПА, лактозу, бриллиантовую зелень, соли желчных кислот, минеральные соли и индикатор нейтральный красный. На этой среде не растет воздушная микрофлора и Е. Coli. Патогенные бактерии кишечной группы не расщепляют лактозу и образуют неокрашенные колонии. Фильтры асбестовые, мембранные используются для стерилизации жидкости путем фильтрования в том случае, когда материал нельзя подвергать нагреванию. Фильтрование производится под повышенным давлением или при создании разряжения в приемнике. Автоклав используется для стерилизации паром под давлением (1,5 атм – 120 о С). В нем стерилизуются питательные среды, посуда, различный зараженный материал. Печь Пастера используется для стерилизации посуды сухим жаром. Основной режим стерилизации в печи Пастера 160оС – 1 час. Для контроля за режимом работы используют сахарозу. При температуре 150оС происходит ее керамилизация. Основной контроль стерильности материала – это посев на питательные среды. Термостат – прибор, в котором с помощью терморегуляторов поддерживается постоянная температура. Используется для выращивания микроорганизмов на искусственных питательных средах при оптимальной температуре +37оС. Тема 4 |