уч пособие. Учебное пособие Общая микробиология. Великий новгород
 Скачать 0.68 Mb.
|
Выделение чистой культуры аэробов, методы идентификации. Культивирование анаэробов.Цель занятия: выделение чистой культуры стафилококка, знакомство с методами идентификации; освоение методов культивирования анаэробов, приготовления специальных питательных сред; выделение чистых культур анаэробов. Основные вопросы темы Этапы выделения чистой культуры аэробов и ее идентификации. Анаэробные микроорганизмы. Способы создания их условий культивирования. Питательные среды для культивирования анаэробов. Принципы выделения чистых культур. Блок дополнительной информации. Выделение чистой культуры аэробов и ее идентификация. Получение чистой культуры микроорганизмов происходит в несколько этапов: сначала производят механическое разобщение для посева исследуемого материала на питательную среду. При посеве необходимо получить рост отдельных колоний. При выделении культуры бактерий из зева посев производят тампоном, втирая материал в питательную среду (ЖСА). В этом конкретном случае для выделения чистой культуры стафилококка используют разобщение микробов и применение элективной питательной среды – желточно-солевого агара Чистовича, на котором вырастают в основном только колонии стафилококков. Изучают рост колоний (второй день исследования) и делают высев на скошенный МПА. Колония – это потомство одной микробной клетки. У каждого вида бактерий колонии обладают характерными признаками. Учитывают размеры колоний, их число, форму, характер края, поверхность, структуру, прозрачность, наличие пигмента, выделение фермента патогенности – лецитовителлазы (расщепление лецитина питательной среды до диглицерида, который дает образование ореола вокруг колоний). Например, колонии патогенного стафилококка могут быть круглые выпуклые, с ровным краем, гладкой поверхностью, имеют золотисто-желтый пигмент, выделяют лецитовителлазу. Для идентификации культуры применяют методы: изучение морфологии при окраске по Грамму; определение биохимических свойств бактерий (спектр расщепления углеводов по средам Гисса); выявление образования ферментов патогенности, токсинов и антигенной структуры по реакциям со специфической иммунной сывороткой; определение чувствительности культуры к антибиотикам. Методы культивирования анаэробов. По характеру биологического окисления и получению энергии все микроорганизмы подразделяют: - Строгие аэробы (растут в присутствии кислорода) - Микроаэрофилы (растут при малом содержании кислорода). - Факультативные анаэробы (могут расти при аэробных и анаэробных условиях). - Строгие анаэробы (кислород для них не является конечным акцептором электронов и может оказывать угнетающее действие на их рост). Ферментация глюкозы в анаэробных условиях дает значительно меньше энергии, чем при расщеплении ее аэробами. Питательные среды, применяемые для культивирования анаэробов - тиогликолевая жидкая питательная среда, 10 % молоко по Тукаеву, сахарный агар и сахарный бульон (высоким столбиком), среда Китта-Тароцци, (содержит глюкозу, кусочки паренхиматозной ткани, сверху залита вазелиновым маслом). Среда Вильсона-Блера (МПА, содержит хлорное железо и сульфит натрия), при росте анаэробов образуется сернистое железо, колонии окрашиваются в черный цвет. В этих средах достигается создание анаэробных условий, однако, для выделения чистой культуры и идентификации микробов необходимо помещать чашки и пробирки с посевами в особые условия, при отсутствии кислорода, для чего применяют биологический, физический и химический методы. Биологический метод Фортнера. На чашку с питательной средой (кровяной агар с глюкозой) делают посев; на одну половину - аэробной культуры, на другую – анаэробов; крышку чашки парафинируют и ставят в термостат. Сначала растут аэробы, поглощающие кислород, затем – анаэробы Физический метод: применение анаэростата (герметически закрытый металлический прибор с манометром), из которого откачивается воздух или заменяется индифферентным газом. Возможно использование химических веществ, поглощающих кислород в герметически закрытых приборах. Так как большинство патогенных анаэробов относится к роду Clostridium, и образуют споры, перед посевом материал прогревают для уничтожения других бактерий. Для получения чистой культуры анаэробов сначала делают посев материала на тиогликолевую среду, и затем высев по Цейсслеру на чашки с сахарно-кровяным агаром, которые культивируют в анаэробных условиях, или рассев по Вейнбергу в высоких столбиках расплавленного сахарного агара. При росте колоний делают распил на нужном уровне и высев из одной колонии на тиогликолевую среду. Тесты для рейтингового контроля. 1.Для идентификации чистой культуры бактерий используют: 1). простой метод окраски препаратов. 2). характеристику колоний. 3). окраску по Граму. 4). определение размеров бактерий. 2.Для создания анаэробных условий культивирования используют: 1). посев на чашки с МПА. 2). биологический метод Фортнера. 3). применение бактериофага. 4). тиогликолевую среду. 5). анаэростат. 3.По типу дыхания микроорганизмы могут быть: 1). гетеротрофы. 2). аэробы. 3). имеющие капсулу. 4). анаэробы. Самостоятельная работа студентов. 1.Просмотреть чашки с посевом материала из зева для выделения стафилококка. Сделать описание характера выросших колоний: число колоний, размер, форма, край, поверхность, наличие пигмента, лецитовителлазы (ореол вокруг колонии). Сделать мазок из колонии, окрасить по Граму, зарисовать. Для выделения чистой культуры из одной колонии произвести высев на скошенный МПА. 2.Просмотреть демонстрационный препарат анаэробов в посеве почвы на тиогликолевую среду. Обратить внимание на наличие в препарате Грам-положительных палочек. 3.Записать в протокол среды для культивирования, способы создания анаэробных условий культивирования и методы выделения чистых культур анаэробов. Практические навыки 1.Умение выделять чистую культуру микробов. 2. Освоение методов идентификации чистой культуры. 3.Знание методов культивирования анаэробов. ТЕМА 5 МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. ИТОГОВОЕ ЗАНЯТИЕ. Цель занятия: проверить усвоение материала по морфологии и физиологии микробов; проверить приобретенные практические навыки. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ Морфология микроорганизмов. 1. Значение микробиологии для врача. 2. Основные правила работы в бактериологической лаборатории 3. История открытия микроорганизмов и описание морфологии, работы А. Левенгука. 4. Значение работ Л. Пастера и Р. Коха в развитии медицинской микробиологиии. 5. Роль медицинской микробиологии в снижении заболеваемости и ликвидации инфекционных болезней. 6. Современные методы микроскопического исследования. 7. Устройство микроскопа с иммерсионной системой. 8. Разрешавшая способность и увеличение микроскопа. 9. Принцип темнопольной микроскопии. 10. Принцип фазовоконтрастной микроскопии. 11. Размер и измерение микроорганизмов. 12. Принципы современной классификации микробов. 13. Определение вида бактерий, разновидности, штамма, клона, чистой культуры, колонии. 14. Прокариотическая клетка, структурные элементы. Генетический аппарат прокариот, ядерные структуры, плазмиды. 15. Структура цитоплазматической мембраны, клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Капсулы, методы их выявления. 16.Подвижность прокариот. Методы ее выявления. Жгутики, пили. 17. Цитоплазма. Органеллы прокариот. Спорообразование у микроорганизмов. Методы выявления спор. 18.Отличие прокариот от эукариот. 19.Теоретические основы окрашивания микроорганизмов. Простые и сложные методы окраски. 20. Окраска по Граму (принцип и механизм). 21. Окраска по Цилю-Нильсену. 22. Морфология кокковидиых, палочковидных и извилистых форм бактерий. Физиология микроорганизмов. Питательные среды. Дифференциально-диагностические и элективные. Условия культивирования микробов. Химический состав микробов. Методы стерилизации и контроля стерильности. Асептика и антисептика. Размножение микробов: Фазы развития бактериальной популяции в жидкой питательной среде. Микробное число /М-концентрация/. Методы выделения чистой культуры аэробных микробов. Этапы выделения чистой культуры аэробных микробов. Культуральные свойства микробов. Способы создания анаэробных условий. Питательные среды, используемые для культивирования анаэробов. Методы выделения чистых культур анаэробов. Классификация ферментов, образуемых микробами, по составу, по механизму действия. Методы изучения ферментативной активности микробов. Значение ферментов в идентификации бактерий. Ферменты патогенных микробов. Антибиотики, история открытия. Классификация антибиотиков по происхождению и механизму действия. Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам. Лекарственная устойчивость у бактерий, её возникновение и пути предупреждения. Дезинфицирующие вещества. Виды дезинфекции /текущая и заключительная/. Бактермофаг: его природа, свойства. Вирулентный и умеренный бактериофаги. Фазы их взаимодействия с микробами. Применение бактериофагов в медицинской практике. Формы изменчивости у микробов. Фенотипическая и генотипическая изменчивость. Значение изменчивости микроорганизмов для медицинской практики. Нехромосомные факторы наследственности у микробов /плазмиды/. Генетические рекомбинации у бактерий: конъюгация. Трансдукция. Трансформация. Мутации у микроорганизмов. Бакпрепараты. Биохимические свойства кишечной палочки. Рост ее на средах Эндо, Левина. Опыт определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Биологический метод культивирования анаэробов по Фортнеру. 4. Среды для культивирования анаэробов: Китт-Тароцци. тиогликолевая, Вильсон-Блера. 5. Фаготипирование бактерий. 6.Определение фермента лецитовителазы у патогенного стафилококка на желточно-солевом агаре Чистовича. Практические навыки 1.Приготовление и окраска препарата. 2.Работа с иммерсионным микроскопом. 3.Окраска препарата по Граму. 4.Посев на скошенный МПА петлей. 5.Посев на чашку смеси микробов для выделения чистой культура. 6.Определение лекарственной чувствительности микробов. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ. 1.История открытия микроорганизмов работы Антонию Левенгука. 2.Значение работ Л. Пастора, Р. Коха, Д.И. Ивановского в развитии медицинской микробиологии. 3.Современные методы микроскопического исследования. Принципы темнопольной, фазовоконтрастной, люминесцентной и электронной микроскопии. Разрешающая способность и увеличение светового биологического микроскопа. 4.Размер и измерение микроорганизмов. 5.Генетические рекомбинации у микроорганизмов: конъюгация, трансдукция, трансформация 6.Генная инженерия. Её значение для медицинской практики. ТЕМА 6 ФОРМЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ. БАКТЕРИОФАГИ. Цель занятия: изучить основные положения учения о наследственности и изменчивости микроорганизмов; ознакомиться с общими свойствами вирусов, изучить основные свойства бактериофагов и практическое применение. Основные вопросы темы 1.Основные закономерности изменчивости как общебиологическая проблема. 2. Формы изменчивости, фенотипическая и генетическая изменчивость. 3. Мутации, их механизм. 4. Рекомбинации ДНК и способы передачи генетической информации между бактериями: трансформация, конъюгация, трансдукция. 5. Плазмиды как внехромосомные факторы наследственности. 6. Общая характеристика вирусов. 7. Природа и свойства бактериофагов, механизм взаимодействия фага с бактериальной клеткой /вирулентные и умеренные фаги/. 8. Применение бактериофагов для профилактики, лечения болезней и идентификации бактерий. БЛОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ИНФОРМАЦИИ. 1. Формы изменчивости микроорганизмов. Изменчивость микроорганизмов может возникать под действием внешних факторов и связана, в основном, с образованием индуцированных ферментов. Такие изменения являются фенотипическими, не наследуются и сохраняются в течение действия внешнего фактора. Наследуемые изменения у микроорганизмов являются следствием нарушений генетической информации и связаны, в основном, с мутациями и генетическими рекомбинациями. Основой наследственности у бактерий и вирусов служит ДНК. Бактериальная ДНК замкнута в кольцо. Эта структура называется нуклеоидом или бактериальной хромосомой. Сохранение генетической информации поддерживается точным воспроизведением ДНК в репликации и системой репарации ДНК. Репаративная система представляет комплекс белков ферментов /конститутивные и индуцибельные/, которые находят поврежденные участки ДНК, разрушают их, затем полимеразы синтезируют новый участок, а лигазы вшивают его в цепочку. Внехромосомные факторы наследственности представлены плазмидами, транспозонами и Is-последовательностями, которые представляют молекулы ДНК. Они не являются жизненно необходимыми для бактерий, но придают им селективные преимущества. Плазмиды могут быть связаны с хромосомой и делятся вместе с ней или находятся в свободном состоянии в цитоплазме, где может происходить их автономная амплификация. Плазмиды несут генетическую информацию: F - плазмиды способствуют конъюгации, Rtf - множественной устойчивости к антибиотикам, End - плазмиды контролируют синтез токсина, Hly – плазмида - синтез гемолизина. Плазмиды могут контролировать синтез факторов вирулентности и устойчивости микробов к различным воздействиям внешней среды /к свету, ультрафиолету/, могут менять скорость размножения бактерий. Транспозоны всегда связаны с хромосомой, они несут информацию для транспозиции, при включении в ДНК способны перемещаться с одного репликона на другой, вызывая дупликации или делеции и инверсии. Они могут нести информацию для синтеза токсинов и ферментов, обуславливают антимикробную устойчивость к одному фактору. Is-последовательности (inscription – вставка, sequencl – послежлвательность) - это фрагменты ДНК, в которых содержится информация для их перемещения в различные участки ДНК. Они вызывают делеции или инверсии, а при включении в хромосому - дупликации. Они кодируют взаимодействие транспозонов, плазмид и умеренных фагов между собой и обеспечивают их рекомбинацию. Изменения генетической информации микроба связаны в основном с мутациями и генетическими рекомбинациями. Мутации бывают: 1. Спонтанные (радиация, световой фон, ошибки ДНК – полимеразы). 2. Индуцированные - причина их возникновения связана с мутагенными факторами (физическими, химическими, биологическими). а). точковые - замена основания. б). транспозиция - перенос участка ДНК с одного на другой. в). трансверсия - переворот на 180 градусов. г). амплификация генов - вставочные мутации, ДНК становится больше. д). делеции - выпадение участка ДНК. Последствия мутаций: 1. Нейтральная - изменения не проявляются. 2. Условно-летальные изменения имеются, но фермент не утрачивает активности. 3. Летальная - утрата функциональной активности, не синтезируется жизненно важный для клетки фермент. Повышающие жизнеспособность, встречаются крайне редко. Рекомбинации ДНК и передача генетической информации между бактериями происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации. Трансформация - передача генетической информации от одной бактерии к другой без их непосредственного контакта. Трансформацию открыл Ф. Гриффитц, который показал способность экстракта капсульного пневмококка индуцировать вирулентность и образование капсулы у бескапсульного пневмококка. Трансформация чаще происходит между разновидностями, типами и штаммами микробов одного вида и осуществляется донором и реципиентом. Донор отдает ДНК, а реципиент воспринимает ее. Донором являются клетки с максимальной скоростью размножения, часть ДНК попадает в окружающую среду, где и захватывается реципиентом. Реципиентом являются клетки со сниженной скоростью размножения в состоянии фазокомпетентности, на поверхности этих клеток появляются белки- трансформосомы, которые связывают ДНК в окружающей среде. Этот процесс идет активнее у грамположительных бактерий, а у грамотрицательных бактерий переносу ДНК мешает наружная мембрана клеточной стенки. При трансформации приобретаются один или два признака донора, чаще передаются капсульные и поверхностные антигены, резистентность к лекарственным препаратам, способность синтезировать факторы роста и ферментировать углеводы. Конъюгация –передача генетической информации между бактериями при их непосредственном контакте. Клетка - донор имеет специальные плазмиды фертильности (F-плазмиды), эта клетка имеет специальные sex- реснички, которые служат для сближения клеток донора и реципиента и образования между ними протоплазматических мостиков. F- фактор, включенный в ДНК дает высокую частоту рекомбинаций. Hfr - форма расщепляет двойную спираль (ДНК), превращая ее из кольцевой молекулы в линейную и транспортирует ее в клетку реципиента, Оставшаяся в клетке донора ДНК восстанавливает свою первоначальную структуру, достраиваясь до двойной спирали. При конъюгации от донора к реципиенту могут передаваться плазмиды, автономно расположенные в цитоплазме. Конъюгация чаще происходит у медленно делящихся клеток. У грамотрицательных бактерий в этом процессе участвуют две клетки (донор и реципиент), а у грамположительных бактерий в конъюгации одновременно участвует 50-100 клеток, эти скопления называют клампами. Конъюгация лучше возникает при внутривидовом скрещивании бактерий, но возможна и межвидовая рекомбинация, которая часто происходит у бактерий кишечной группы, воспроизводится между кишечными палочками, шигеллами, сальмонеллами, клебсиеллами, холерным вибрионом. Трансдукция - передача генетической информации из одной микробной клетки в другую с помощью бактериофагов. Этот процесс может осуществляться как умеренными, так и вирулентными фагами. Для умеренных фагов характерен переход к продуктивной инфекции, что чаще связано с действием ультрафиолетового облучения или радиации, при этом происходит повреждение хромосомы клетки и вирусная ДНК в процессе сборки вириона соединяется с одним или несколькими генами хромосомы клетки хозяина. Неправильно вылепленный геном вируса начинает реплицироваться, образуется множество копий, каждая из которых содержит гены клетки донора. Синтезируются белки капсида бактериофага, и из клетки выходит популяция вирусов, где каждый из вирусов содержит один или несколько генов клетки донора. Дальше, взаимодействуя с клеткой-реципиентом, геном вируса встраивается в хромосому клетки вместе с генами из хромосомы клетки донора. Трансдукцию, осуществляемую умеренными бактериофагами, подразделяют на общую, специфическую и абортивную. При общей трансдукции вирус встраивается в различные места хромосомы клетки-донора. Специфическая трансдукция характерна для бактериофага, встраивающего свой геном в строго определенное место хромосомы донора. При абортивной трансдукции перенесенный ген не встраивается в хромосому клетки реципиента, а остается в цитоплазме. При делении клетки этот ген остается в одной клетке и происходит постепенное утрачивание нового признака. У вирулентных фагов в процессе сборки вирионов образуются дефектные вирусы, содержащие внутри капсида участок ДНК клетки донора, который они и переносят в цитоплазму клетки-реципиента, но не вызывают процесса репликации вирусов. Трансдукция, осуществляемая умеренными бактериофагами, включает этап амплификации, то есть увеличение копий переносимого гена, что весьма важно в изменчивости микроорганизмов. В процессе трансдукции передается генетическая информация об антигенной структуре бактерий и осуществляется передача факторов вирулентности. 2. Практическое значение учения о генетике микроорганизмов. Генетические исследования микроорганизмов позволили получить вакцинные штаммы со сниженной вирулентностью, культуры вырабатывающие высокоэффективные антибиотики, ферменты, витамины, ценные лекарственные и пищевые вещества. Селекционированы микробы, которые используют для получения продуктов питания, кормов для животных, производства аминокислот. Значительное повышение ферментативной активности микроорганизмов получено путем направленных мутаций при воздействии на культуры химическими веществами и излучениями. Развивается генная инженерия, которая позволяет с помощью ферментов эндонуклеаз рестрикции разрывать в строго определенных местах молекулы ДНК на отдельные фрагменты и структурные гены, а также синтезировать их на матрице и РНК с помощью фермента обратной транскриптазы. Выделение бактериальных генов из плазмида и дефектных умеренных фагов позволяет получить целые опероны, контролирующие определенные свойства клеток. Удалось сконструировать много рекомбинантных молекул ДНК, которые переносятся в реципиентный организм плазмидами, умеренными фагами и некоторыми вирусами. Использование микрохирургии позволяет пересаживать клеточные ядра и оперировать с хромосомным аппаратом. 3. Общая характеристика вирусов. Д.И. Ивановский при изучении мозаичной болезни листьев табака в 1892 г. открыл фильтрующийся агент, который впоследствии получил название вирус (Virus - яд). Известно более 500 видов вирусов, вызывающих заболевания у людей. Вирусы представляют собой своеобразную форму существования живой материи: содержат только одну нуклеиновую кислоту РНК или ДНК, являются облигатными внутриклеточными паразитами, культивируются и воспроизводятся только в живых клетках, путем репродукции дисъюнктивным способом. Простейшие вирионы состоят из нуклеиновой кислоты, окруженной белковой оболочкой - капсидом, некоторые вирусы имеют внешнюю оболочку - суперкапсид (например вирус гриппа). Различают вирусы, вызывающие заболевания человека, растений, бактерий - бактериофаги. Бактериофаги Бактериофаги были открыты д,Эреллем в 1917 г. Величина бактериофага от 20 до 200 нм. Фаги состоят из головки, содержащей нуклеиновую кислоту, и отростка, на конце которого расположена шестиугольная базальная пластинка, от которой отходят шипы, заканчивающиеся нитями. По типу взаимодействия с бактериальной клеткой фаги делятся на вирулентные и умеренные. У вирулентных бактериофагов происходит адсорбция, проникновение в клетку фаговой нуклеиновой кислоты и белков капсида, формирование зрелых вирионов и лизис бактериальной клетки. Умеренные фаги (профаги) могут оставаться в цитоплазме клетки или встраиваются в бактериальную ДНК и с ней синхронно реплицируются. Такие бактериальные клетки называются лизогенными. Получают бактериофаги путем их накопления в бактериальных культурах на жидких питательных средах, бактерии удаляются путем фильтрования культуры через мелкопористые фильтры, при этом фаги остаются в жидкости. Определяют титр бактериофага по методу Грация (метод агаровых слоев). Метод основан на том, что 1,0 мл бактериофага смешивают в пробирке с 0,5 мл бактериальной культуры и добавляют в эту же пробирку расплавленный МПA, все выливают в чашку с МПА, дают застыть верхнему тонкому слою и ставят в термостат. На месте попадания фаговых частиц происходит лизис и образуются негативные колонии фага, которые подсчитывают для определения его титра. Титром фага называют количество фаговых частиц в 1 мл препарата фага. Бактериофаги применяют с целью профилактики и лечения инфекционных заболеваний и для фаготипирования культур по специфическому фаголизису. тест для рейтингового контроля. 1. Генетические рекомбинации - это: 1. конъюгация. 2. модификация. 3. трансформация. 4. диссоциация. 5. трансдукция. 2. К эписомным факторам относятся: 1. умеренный бактериофаг. 2. фактор множественной лекарственной устойчивости. 3. рибосомы клетки. вирулентный бактериофаг. бактериоциногенный фактор. 3. Бактериофаги характеризуются: 1. бактериальной природой. 2. фильтруемостью через бактериальные фильтры. 3. внутриклеточным паразитизмом. 4. вызывают лизис бактерий. 5. усиливают размножение бактерий. 4. Бактериофаги применяют: 1. с целью идентификации культуры бактерий. 2. для профилактики дизентерии и брюшного тифа. 3. для выделения чистой культуры бактерий. 4. для определения лекарственной чувствительности. 5. при лечении дизентерии. 5. К фенотипической изменчивости относят: 1. получение вакцинных штаммов бактерий. 2. образование адаптивных ферментов. 3. мутационную изменчивость. 4. временную устойчивость к антибиотикам. 5. конъюгацию. САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДEHTOB. 1. Продолжение работы по выделению чистой культуры. Определение чувствительности культуры к антибиотикам методом бумажных дисков. Сделать сплошной посев культуры на чашку с МПА. На культуру положить бумажные диски с различными антибиотиками. 2. Учесть результаты ферментативной активности выделенной культуры. 3. Провести фаготипирование бактерий по методу Фюрта. Сделать посев 4-х разных культур на сектора чашей с МПА, содержащим дизентерийный бактериофаг. Практические навыки Освоить метод определения чувствительности культуры к антибиотикам и интерпретации результатов. Демонстрационные препараты 1. Препараты бактериофагов: дизентерийный, брюшнотифозный. Представляют собой фильтрат бульонной культуры лизированных фагом бактерий. Применяются для профилактики и лечения этих заболеваний. 2. Холерный монофаг El-Tor и монофаг С - диагностические бактериофаги, применяются для идентификации культур. 3. Чашка Петри с фаготипированием культур по методу Фишера: на чашку с МПА засевается неизвестная культура, выделенная от больного. На сектора чашки наносятся капли разных бактериофагов. Там, где культура соответствует бактериофагу наблюдается лизис. 4. Негативные колонии вирулентного бактериофага. |