уч пособие. Учебное пособие Общая микробиология. Великий новгород
 Скачать 0.68 Mb.
|
Тема 2Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски бактерий ( Грама, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса).Цель занятия: изучение структуры бактериальной клетки с применением сложных методов окраски; освоение окраски бактериальных препаратов методом Грамма; выявление капсул методом Бурри-Гинса и спорообразования по Цилю-Нильсену. Основные вопросы темы 1. Основные признаки, характеризующие прокариотические и эукариотические клетки, их различия. 2. Структура бактериальной клетки: нуклеоид, плазмиды, цитоплазма, включения. 3. Структура цитоплазматической мембраны, клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, капсулы. Методы выявления капсулы. 4. Спорообразование у бактерий, способы окраски спор. 5. Подвижность бактерий. Структура жгутиков, определение подвижности бактерий, методы выявления жгутиков. 6. Сложные методы окраски бактериальных препаратов. Метод Грама: этапы окраски, механизм окраски. Окраска по Цилю-Нильсену, механизм. Выявление капсул по методу Бурри-Гинса. Вопросы контроля исходного уровня 1. Этапы приготовления бактериальных препаратов. 2. Принципы окрашивания бактериальных препаратов простыми методами с применением анилиновых красителей. 3. Правила работы с иммерсионным биологическим микроскопом. Блок дополнительной информации. Структурные и функциональные особенности клеток позволяют выделить более сложно организованные и дифференцированные эукариотические клетки животных, растений, водорослей и простейших и более просто организованные прокариотические клетки многих микроорганизмов: бактерий, актиномицет, риккетсий, микоплазм, спирохет. Прокариотические клетки легко адаптируются к условиям окружающей среды, биохимически активны, многие паразитируют в организме человека и животных, что приводит к их широкому распространению. Основные характерные структурные различия прокариотических и эукариотических клеток представлены в таблице № 1. Таблица 1. Основные признаки, характеризующие прокариотические и эукариотические клетки.
1. Основные структурные элементы прокариотических клеток. Цитоплазма составляет основную массу бактериальных клеток, имеет сложную коллоидную структуру, которая содержит многочисленные ферменты, Т-РНК и большое число рибосом (от 5 до 50000), являющихся местом синтеза белка. Некоторые бактерии содержат газовые вакуоли (аэросомы). В цитоплазме клеток могут откладываться гранулы запасных питательных веществ: гликогена, крахмала, полисахаридов, липидов и др. Грибы и дрожжи содержат гранулы нейтральных жиров, микобактерии – воска, коринебактерии – волютина. Ядерный аппарат прокариот не имеет ядерной мембраны, поэтому он не отграничено от цитоплазмы четко. Ядерная субстанция бактерий представляет собой нуклеоид, величина и форма которого меняется в зависимости от фазы деления клетки. Бактериальная ДНК составляет нить длиной около 1 мм, замкнутую в кольцо. Она состоит из одной молекулы ДНК и представляет собой бактериальную хромосому с линейно расположенными генами, что позволяет составить генетическую карту бактерий. Величина генома бактерий составляет до 8х10 пар нуклеоидов, что значительно меньше чем у эукариот. Кроме нуклеоида у бактерий имеются плазмиды, которые представляют собой молекулы двухнитчатой ДНК, чаще замкнутые в кольцо. Плазмиды располагаются в цитоплазме, они могут быть автономными или интегрированными в бактериальную хромосому и реплицируются вместе с ней. Плазмиды способны передаваться из клетки в клетку в процессе генетических рекомбинаций. Так R-плазмиды способны сообщать клетке множественную лекарственную устойчивость к антибиотикам, F-плазмиды контролируют синтез F-фимбрий, с помощью которых происходит коньюгация бактериальных клеток, плазмиды бактериоциногенности контролируют синтез белковых веществ летальных для бактерий, Ent-плазмиды детерминируют образование энтеротоксинов и др. Клеточная стенка придает бактериям характерную морфологическую форму, защищает от внешних воздействий и поддерживает постоянство бактериальной среды. Клеточной стенки не имеют микоплазмы и L-формы бактерий. Структура клеточной стенки и химический состав у различных видов бактерий неодинаковы, что выявляется при окраске по Граму. У грамположительных бактерий основным компонентом является пептидогликан (муреин), составляющий 30-70% сухой массы клеточной стенки и состоящий из 40 слоев муреина, связанного с тейхоевыми и липотейхоевыми кислотами. У грамотрицательных бактерий муреин составляет лишь 10% сухой массы клеточной стенки, содержит всего 1-2 слоя, он лишен лизина и тейхоевых кислот. Между муреином и наружной мембраной имеется значительное количество липидов (липополисахариды, липопротеиды). Пептидогликан связан с липополисахаридами через диаминопимелиновую кислоту. Если обработать бактериальную клетку пенициллином или лизоцимом, клеточная стенка разрушается и клетка превращается в протопласт или сферопласт (грамотрицательные бактерии). Плазматическая мембрана имеет толщину 75А, выполняет различные функции: защитную, транспортную, содержит ферменты переноса электронов и окислительного фосфорилирования. Участвует в формировании клеточной стенки и капсулы. Химический состав мембран у различных микроорганизмов варьирует. В него входят два слоя фосфолипидов, в которые погружены молекулы белка, осуществляющего значительную часть мембранных функций. У грамположительных бактерий мембрана окружена толстой клеточной стенкой из пептидогликана и тейхоевых кислот, а у грамотрицательных – тонким слоем пептидогликана, который покрыт наружным слоем плазматической мембраны. Капсулы, выделения слизи. Многие бактерии (пневмококки, клебсиеллы, клостридии и др.) кнаружи от клеточной стенки имеют рыхлый слизистый слой, образующий капсулу толщиной до 10 мкм или микрокапсулу (0,2 мкм), реже - менее оформленное скопление слизи. Он обеспечивает устойчивость бактерий в организме человека или животных, повышает вирулентность бактерий, делая их резистентными к фагоцитозу, способствует адгезии бактерий к тканям. Кроме того, капсулы защищают бактерии от высыхания и механических повреждений. Капсульное вещество содержит антигены, придающие специфичность микробным клеткам. Капсулы чаще представляют собой полисахариды или белки, они плохо окрашиваются анилиновыми красителями и лучше выявляются методом Бурри-Гинса. Жгутики, пили. Длина жгутиков колеблется от 3 до 15 мкм, толщина - от 10 до 20 нм. Расположение жгутиков может быть моно-, биполярным или перетрихиальным. Бактерии, имеющие жгутики, способны к движению в жидкости и по поверхности плотной среды. Жгутик представляет собой длинную спиральную нить из флагеллина, содержащего одиннадцать разных белков. Фиксация стержней осуществляется базальным тельцем, а также двумя внутренними кольцами у грамположительных бактерий и двумя внешними кольцами, расположенными на наружной мембране, - у грамотрицательных бактерий. Движение происходит по типу хемотаксиса по градиенту концентрации некоторых веществ. Возможен также аэротаксис - аэробные микроорганизмы устремляются в сторону аэрации, анаэробные скапливаются в центре культуры. Фимбрии, или пили представляют собой полые нити, образованные белком пиллином. Они располагаются по периферии клетки в количестве 100-200, принимают участие в адгезии бактерий к поверхности клеток и тканей, а также в процессе конъюгации. Подвижность бактерий может быть выявлена методом “висячей” и “раздавленной капли”, лучше в темнопольном или фазовоконтрастном микроскопе. Спорообразование. Многие прокариоты способны сохраняться при неблагоприятных условиях среды, образуя покоящиеся формы, к ним следует отнести эндо- и экзоспоры, цисты и др. Эндоспоры образуют около 15 родов прокариот, в том числе , Васillus и Сlostridium, имеющие значение в инфекционной патологии человека и животных. Споры представляют собой овальные или округлые образования, расположенные центрально, терминально или субтерминально, сильно преломляющие свет, устойчивые к высокой температуре, радиации, ультрафиолету, кислотам, щелочам и другим неблагоприятным факторам. Образование споры происходит в течение 5-13 часов, при этом в клетке уменьшается содержание глюкозы и -оксимасляной кислоты, расходуются запасные питательные вещества, накапливаются ионы Са2+, Мg2+, Мn2+, К + , синтезируется дипиколиновая кислота, значительно снижается метаболическая активность. В каждой клетке образуется только одна спора, она содержит цитоплазматическую мембрану, часть цитоплазмы, хромосому и рибосомы. Стенка споры окружает внутреннюю мембрану, кортекс содержит пептидогликан, наружный слой оболочки состоит из кератиноподобного белка, что приводит к устойчивости споры. При неблагоприятных условиях, повышении температуры и влажности наблюдается активация споры, вырастает ростовая трубка, которая разрывает оболочку споры и происходит образование бактериальной клетки. Экзоспоры образуют некоторые актиномицеты, кандиды и плесневые грибы. Гифы актиномицет делятся септами, и каждая часть превращается в спору. Дрожжеподобные грибы образуют псевдомицелий, от которого отпочковываются экзоспоры. Плесневые грибы образуют спорангии и различно расположенные скопления экзоспор. У спирохет, в отличие от спорообразования, вся клетка превращается в цисту – округлую форму, обладающую устойчивостью. Споры не окрашиваются обычными красителями, они требуют размягчения оболочки и длительного прокрашивания концентрированным фуксином (метод Циля-Нильсена). 2. Сложные методы окраски. На препарат последовательно наносят красители различные по химическому составу и цвету, что позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать микроорганизмы. Метод Грамма разработан датским ученым Х. Грамом в 1884 году. Он позволяет выявить структуры клеточных стенок и химические особенности бактерий. Грамположительно в фиолетовый цвет окрашиваются бактерии, у которых клеточная стенка содержит много слоев пептидогликана, соединенного поперечными мостиками в плотный чехол. Кроме того, в цитоплазме содержатся магниевые соли РНК, изоэлектрическая точка рН 2-3. Комплекс генцианвиолета и йода у этих бактерий образует химическое соединение с магниевыми солями рибонуклеиновой кислоты, которое не разрушается спиртом и не проходит через плотную клеточную стенку, поэтому цитоплазма бактерий окрашивается в фиолетовый цвет. Примеры грамположительных бактерий - стафилококки, стрептококки, микобактерии, возбудитель дифтерии и др. У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом обесцвечивается этанолом и легко выходит через клеточную стенку, имеющую тонкий слой пептидогликана, покрытого наружной плазматической мембраной, которая содержит липополисахариды и липопротеиды. Белки внешней мембраны являются поринами, через которые могут проникать гидрофильные молекулы величиной до 6000 Да, поэтому грамотрицательные бактерии не окрашиваются генцианвиолетом, а воспринимают дополнительную окраску фуксином. Например: менингококки, гонококки, кишечная палочка, холерный вибрион и др. Техника окраски Препарат залить генцианвиолетом – 3-4 мин. затем раствором люголя – 2 мин. обесцветить спиртом – 15-20 сек. Промыть водой. докрасить фуксином водным 2-3 мин. Смыть краску водой, препарат просушить фильтровальной бумагой. Метод Бурри-Гинса применяется для обнаружения капсул. Капсулы представляют собой наружный слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов или пептидов с содержанием большого количества воды, поэтому капсула не окрашивается анилиновыми красителями. Для выявления капсулы по методу Бурри-Гинса культуру бактерий смешивают на предметном стекле с тушью, мазок высушивают, фиксируют и докрашивают обычным фуксином. При этом на черном фоне капсулы видны светлыми ореолами вокруг розовых бактерий. Например: пневмококки, возбудитель чумы, сибирской язвы и др. Техника приготовления препарата. На предметное стекло наносят каплю культуры и каплю туши, смешивают их краем шлифованного предметного стекла и делают препарат по типу мазка крови, затем высушивают, фиксируют и докрашивают две минуты водным фуксином. Метод Циля-Нильсена применяется для выявления бактерий и спор, обладающих кислотоустойчивостью. Кислотоустойчивые микроорганизмы не окрашиваются простыми методами, так как содержат в клеточной стенке до 40% жировосковых веществ и фосфолипидов. Поэтому препараты сначала протравливают кислотой (метод Ожешка) и окрашивают при подогревании краски основным карболовым фуксином Циля (метод Циля-Нильсена). Затем препарат обесцвечивают серной кислотой и докрашивают метиленовой синькой. При этом кислотоустойчивые бактерии и споры окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые элементы и бактерии - в синий. Техника окраски. На фиксированный препарат нанести раствор основного фуксина через кусочек фильтровальной бумаги, подогреть краску до появления пара 3-5 мин. Снять фильтровальную бумажку, нанести 3-5% раствор серной кислоты - 20-30 сек. и смыть водой. Докрасить препарат водной метиленовой синькой – 3-5 мин. тесты для рейтингового контроля (примеры). 1. Клеточная стенка у грамположительных бактерий имеет: много слоев пептидогликана. наружную плазматическую мембрану. в основном полисахариды. 2. Грамположительные бактерии - это: менингококки. стрептококки стафилококки кишечная палочка. микобактерии туберкулеза. 3. Для выявления капсулы применяют методы окраски: по Граму. по Цилю-Нильсену. простую окраску фуксином. метод Бурри-Гинса. Самостоятельная лабораторная работа студентов. 1. Приготовление мазка из смеси E.Coli и Staphylococus albus. Окраска по Граму. Записать процесс окраски грамположительных и грамотрицательных бактерий. 2. Определение подвижности E.Coli. 3. Просмотреть демонстрационные препараты: а) споры В.anthraсoides, окрашенные по методу Циля-Нильсена б) капсулы В.Friedlanderi, выявленные по Бурри-Гинсу в) препарат Neisseriae gonorrhoeae грамотрицательный. Г) препарат Corynebacterium diphtheriae грамположительный. 4. Зарисовать все препараты цветными карандашами, указать латинские названия микробов 5. Получить подпись преподавателя под протоколом. Практические навыки. 1. Приготовление препаратов из культур патогенных микробов. 2. Освоение сложного метода окраски культур бактерии по Граму. 3. Освоение структуры бактериальных клеток. Методы выявления спор и капсул. |