Вещества кислотного характера
 Скачать 0.5 Mb.
|
|
Приготовление хроматографических пластинок. Обнаружение нитразепама по УФ- и ИК-спектрам. Раствор нитразепама в этиловом спирте имеет максимумы поглощения при 218 и 260 нм, в 0,1 и. растворе серной кислоты имеет максимум поглощения при 277 нм и изгиб около 340 нм; нитразепам в ИК-области спектра (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1692, 1615, 1352 и 702 см '. ОКСАЗЕПАМ Оксазепам (тазепам, адумбран, нозепам, пракситен, серакс, серенал и др.) является производным 1,4-бензодиазепина. Он представляет собой кристаллический порошок, почти не растворимый в воде, растворимый в этиловом спирте и хлороформе. Этот препарат экстрагируется органическими растворителями, из щелочных водных растворов. Выделение оксазепама из биологического материала (по Л. Ф. Фартушному с сотрудниками). К 25 г исследуемого объекта (желудок и тонкая кишка с содержимым, печень, почки) прибавляют 3 мл насыщенного водного раствора гидрофосфата натрия и эту смесь подвергают гомогенизированию. Гомогенат переносят в колбу с притертой пробкой вместимостью 500 мл, прибавляют 100 мл диэтилового эфира, содержимое колбы взбалтывают с помощью аппарата для встряхивания жидкостей в тече ние 10 мин, а затем отделяют эфирную вытяжку. Оставшийся в колбе гомогенат еще дважды взбалтывают с новыми порциями диэтилового эфира (по 100 и 50 мл) в течение 10 мин. Эфирные вытяжки соединяют, фильтруют через бумажный фильтр. Объединенные профильтрованные эфирные вытяжки используют для обнаружения и количественного определения оксазепама, выделенного из биологического материала. Выделение оксазепама из крови и мочи. В колбу с притертой пробкой вместимостью 250 мл вносят 10 мл крови или мочи, а затем прибавляют 100 мл диэтилового эфира. Содержимое колбы взбалтывают при помощи аппарата для встряхивания жид костей в течение 10 мин. Затем отделяют эфирную вытяжку. Оставшуюся в колбе жидкость еще раз взбалтывают со 100 мл диэтилового эфира. Эфирные вытяжки соединяют и фильтруют через бумажный фильтр. Объединенные эфирные вытяжки ис пользуют для идентификации и количественного определения оксазепама. Обнаружение оксазепама Для обнаружения оксазепама применяют цветные реакции, метод хроматографии в тонком слое сорбента, методы УФ- и ИК-спектроскопии и др. Цветная реакция на оксазепам. 25—50 мл объединенной эфирной вытяжки, полученной после изолирования исследуемого ве щества из биологического материала (см. выше), выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл 6 н. раствора соляной кислоты и фильтруют. 1 мл фильтрата вносят в колбу вместимостью 25 мл и кипятят 5—10 мин. Жидкость охлаждают и помещают в холодильник на 15 мин. К охлажденной жидкости прибавляют 1 мл смеси (0,3 г бромида калия, 0,3 г нитрита натрия в 6 мл воды). Жидкость взбалтывают и помещают в холодильник на 30 мин. Затем к охлажденной жидкости прибавляют 0,5 мл 10%-го раствора мочевины. Через 15 мин прибавляют 1 мл 1 %-го спиртового раствора а-нафтола и 1 мл 40 %-го водного раствора гидроксида натрия. При наличии оксазепама появляется красная окраска, которую дает и хлордиазепоксид. Приведенная выше реакция может быть использована для фотоколориметрического определения оксазепама (А. Ф. Фартуш-ный с сотр.). Обнаружение оксазепама методом хроматографии. 5—10 мл объединенной эфирной вытяжки (см. выше) выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилового спирта. Каплю полученного раствора наносят на линию старта на пластинке «силуфол». Правее через 2—3 см на линию старта наносят каплю раствора «свидетеля» (0,5 %-й спиртовой раствор оксазепама). Пятна нанесенных растворов подсушивают на воздухе, а затем пластинку вносят в камеру для хроматографирования, насыщенную парами системы растворителей (хлороформ — пропиловый спирт — ацетон (9:0,4:1). Пластинку вынимают из камеры после того, как система растворителей поднимется на пластинке на 10 см выше линии старта, подсушивают на воздухе и опрыскивают насыщенным раствором тиосульфата натрия. При наличии оксазепама на пластинке появляются оранжевые или желто ватые пятна. Обнаружение оксазепама по УФ- и ИК-спектрам. Растворы оксазепама в этиловом спирте имеют максимумы полос поглощения при 230 и 315 нм. В ИК-области спектра оксазепам (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1687, 1706, 693 и 830 см1. 21. Химико-токсикологический анализ производных 1,4-бензодиазепина по их метаболитам. Изолирование Гидролиз. В пенициллиновый флакон вместимостью 20 мл помещают объект исследования, добавляют 3 мл концентрированной хлористоводородной кислоты, флакон закрывают резиновой пробкой, фиксируют металлическим зажимом, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. При гидролизе хлордиазепоксида и оксазепама образуется 2-амино-5-хлорбензофенон, при гидролизе диазепама - 2-метиламино-5-хлорбензофенон, нитразепама – 2-амино-5-нитробензофенон, феназепама – 2-амино-5-бром-2,-хлорбензофенон. Процесс кислотного гидролиза 1,2-дигидропроизводных 1,4-бензодиазепина протекает по следующей схеме:  Экстракция продуктов гидролиза. Гидролизат охлаждают, подщелачивают 50% раствором гидроксида натрия (осторожно!) до рН=10-11, смесь охлаждают, добавляют 10 мл хлороформа. Содержимое флакона встряхивают в течение 5 минут, центрифугируют 10 минут при 3000 об/минут, хлороформный экстракт переносят в делительную воронку, отделяют, фильтруют через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Экстрагирование повторяют ещё 1 раз. Хлороформные извлечения объединяют, сливают в выпарительную чашку (чашку Петри), выпаривают при комнатной температуре досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл хлороформа, делят поровну. По 2,5 мл используют для идентификации и количественного определения. 2. Хроматографический анализ производных 1,4-бензодиазепина. Исследуемую аликвоту раствора упаривают до объема 1 мл, наносят на стартовую линию хроматографической пластинки «Сорбфил» в 2 зоны. В качестве метчиков 1 зоны используют бензофеноны, полученные при гидролизе известных препаратов. Пластинку помещают в хроматографическую камеру, система – бензол. Метчик во 2 зоне – 2-метиламино-5-хлорбензофенон (метаболит диазепама). После пробега фронта растворителей на 10 см пластинку высушивают. Бензофеноны обнаруживают по собственной желтой окраске, флюоресценции в УФ-свете, по реакции образования азокрасителя (реакция Браттона-Маршалла). Перед проявлением пластинки 2 зону экранируют. 1 зону пластинки последовательно обрабатывают 2 н. раствором хлористоводородной кислоты, 0,1% раствором натрия азотистокислого, раствором -нафтола в 10% растворе гидроксида натрия. Пятна бензофенонов проявляются в виде оранжевых пятен. Не образует азокрасителя диазепам, поскольку он не содержит первичной ароматической аминогруппы. Продукт гидролиза диазепама обнаруживают путем обработки 2 зоны (ранее экранированной) 10% раствором хлорной кислоты, после чего наблюдают флюоресценцию в УФ-свете (длины волн 254 и 360 нм). Идентификация веществ – по величинам Rf и результатам реакций окрашивания. 3. Количественное определение. Количественное определение исследуемых соединений по 2-амино-бензофенонам проводят фотометрическим методом в видимой области спектра после реакции Браттона-Маршалла. Для расчета количественного содержания пользуются градуировочным графиком. 3.1. Построение градуировочного графика. В три мерные пробирки на 5 мл добавляют по 0,1 мл (100 мкг) стандартного раствора анализируемого вещества (1 мг/мл) и по 3 мл 2 н. раствора хлористоводородной кислоты. Гидролиз проводят на глицериновой бане в колбе с обратным холодильником при 125-130оС в течение 30 минут или на кипящей водяной бане в течение 1 часа. По окончании гидролиза холодильники промывают 1 мл 2 н. раствора хлористоводородной кислоты. После охлаждения объем гидролизата доводят 2 н. раствором хлористоводородной кислоты до 5 мл. Далее для каждого гидролизата поступают следующим образом: в мерные пробирки переносят по 0,1, 0,25, 0,5, 1,0 мл стандартного раствора (2, 5, 10, 20 мкг вещества), доводят объем до 3 мл 2 н раствором хлористоводородной кислоты, проводят реакцию Браттона-Маршалла: добавляют 1 мл 0,1% раствора натрия азотистокислого, а через 5 минут – 0,5 мл 1% раствора сульфамата аммония. Полученный раствор встряхивают до полного удаления пузырьков газа, после чего добавляют 1 мл 0,1% раствора N-a–нафтилэтилендиаминдихлорида. Оптическую плотность измеряют через 15 минут на фотоэлектроколориметре в кюветах с толщиной слоя 10 мм, светофильтр зеленый, раствор сравнения – смесь реактивов для реакции Браттона-Маршалла (двойной объем). Полученные данные используют для построения градуировочного графика зависимости оптической плотности от концентрации вещества. Для количественного определения бензофенона, выделенного из биологического материала, 2,5 мл исследуемого раствора выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 5 мл 2 н. раствора хлористоводородной кислоты, проводят реакцию Браттона-Маршалла и фотометрируют. Концентрацию анализируемых веществ определяют по градуировочному графику. По значениям оптической плотности находят содержание вещества в пробе (Сх). Количество вещества в 100 г органа рассчитывают по формуле: Х мкг = Сх*2*100 / 5, где Х – количество вещества в 100 г объекта, Сх – содержание вещества в пробе,
22. Токсикологическое значение группы веществ, изолируемых экстракцией и сорбцией (производные барбитуровой кислоты, 1,4-бензодиазепина, фенотиазина, опиаты). Нормативные акты, регулирующие оборот контролируемых веществ в РФ. Постановление Правительства Российской Федерации от 30 июня 1998 года № 681 “Перечень наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в Российской Федерации.“ Постановление Правительства Российской Федерации от 6 мая 2004 г. № 231 (г. Москва). "Об утверждении размеров средних разовых доз наркотических средств и психотропных веществ для целей статей 228, 228(1) и 229" Уголовного кодекса Российской Федерации. Опубликовано 12 мая 2004 г. Барбитураты оказывают угнетающее влияние на центральную нервную систему. В зависимости от дозы, их терапевтический эффект может проявляться от состояния лёгкой седации до стадии наркоза. Ранее барбитураты широко назначались в качестве успокаивающих и снотворных средств. В настоящее время сфера их применения существенно ограничена, так как, во-первых, они имеют узкую терапевтическую широту, что может привести к передозировке и возникновению токсических эффектов, а во-вторых, при длительном приёме барбитуратов возможно развитие привыкания и лекарственной зависимости. Бензодиазепины —Большинство являются транквилизаторами, некоторые используются как снотворные средства. Бензодиазепины входят в широкую группу веществ депрессантов центральной нервной системы. Их применяют для лечения и снятия симптомов психических беспокойств, бессонницы, возбуждения, эпилептических припадков, мышечных спазмов, а также синдрома физической отмены (алкоголя, наркотиков). Известна эффективность бензодиазепинов для лечения панических атак, вызванных приёмом наркотиков-галлюциногенов. При долговременном использовании могут вызывать привыкание и физическую зависимость. Производные фенотиазина Это типичные нейролептики, обладающие всеми основными свойствам данной группы лекарственных средств. Введение их в организм в дозах, превышающих терапевтические (медицинские ошибки, бытовые и суицидальные отравления), нередко пpивoдит к летальным исходам. Описано большое количество отравлений этими соединениями, нередко в сочетании с другими лекарственными препаратами (барбитуратами, производными изоникотиновой кислоты, имизином, антибиотиками, инсулином и др.). 23. Физико-химические методы качественного и количественного анализа веществ кислотного характера (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ, УФ-спектрофотометрия – прямая и дифференциальная). Хроматографию можно рассматривать как метод разделения веществ, в основе которого лежит разница в коэффициентах распределения этих веществ между неподвижной (НФ) и подвижной (ПФ) фазами. В ТСХ роль неподвижной фазы выполняет тонкий фиксированный слой сорбента (0,1 - 0,5 мм), содержащий определенное количество воды, нанесенный на пластинку из стекла (алюминиевой фольги, полимера). В качестве сорбентов чаще используется силикагель и окись алюминия. Для лучшего связывания сорбента в него добавляют связующий компонент – гипс, крахмал и др. Роль подвижной фазы выполняет индивидуальный растворитель или смесь растворителей, называемые «хроматографической системой». Методы детектирования в ТСХ: Физические, основанные на физико-химических свойствах веществ; Химические, основанные на образовании соединений детектируемых веществ с реагентами. ГЖХ нашла свое применение в анализе лекарственных веществ в качестве скринингового метода благодаря своей универсальности. Необходимым условием является переведение исследуемого вещества в летучее состояние. Каждый компонент выходит из колонки на детектор. Наиболее часто используемым в лабораториях детектором является детектор ионизации пламени (ДИП). Другие (реже встречающиеся) детекторы - азотно-фосфорный детектор и детектор захвата электронов (ДЭЗ). По мере того, как каждый компонент проходит через детектор, подается сигнал, результатом которого является пик на хроматограмме, полученной с помощью записывающего устройства. ВЭЖХ (жидкостная хроматография высокого давления) является вариантом колоночной хроматографии, где элюент подается в колонку под высоким давлением, что ускоряет проведение анализа. Разделение веществ проводится на колонках, заполненных мелкодисперсным сорбентом. При работе с колонками, заполненными силикагелем, в качестве элюента используются углеводороды, иногда с добавлением небольшого количества спирта или других растворителей (нормальнофазный вариант). В качестве детекторов обычно применяют спектрофотометрический детектор с переменной (от 190 до 900 нм) или с фиксированной длиной волны. Могут быть использованы и другие детекторы – рефрактометрический, флуорометрический, ионизационно-пламенный, электрохимический, диодно-матричный, масс-селективный и т.п. Исследование сравнительно простых по составу систем выполняют прямой спектрофотометрией. В случае невозможности ее применения по ряду причин (неизвестный состав, высокая концентрация) определение проводят методом дифференциальной спектрофотометрии. Этот метод характеризуется высшей точностью. Сущность метода дифференциальной заключается в измерении светопоглощения анализируемого раствора относительно раствора сравнения, содержащего определенное количество испытуемого вещества; это приводит к изменению рабочей области шкалы прибора и снижению относительной ошибки анализа до 0,5—1%. 24. Понятие скрининга, требования, предъявляемые к аналитическим скрининговым методам. Хроматографические, спектральные скрининговые методы: краткая характеристика, основные понятия, идентификация веществ. В токсикологической химии такие исследования принято называть аналитическим скринингом. Скрининг (screening) в переводе с английского означает «просеивание», «отбор», «сортировка». Аналитический скрининг - это система методических приемов, позволяющих в ходе исследовательских операций исключить («отсеять») или определить группы веществ (индивидуальные соединения) на этапе предварительного исследования. Это позволяет построить дальнейший анализ в нужном направлении. Аналитический скрининг является эффективным при его соответствии определенным требованиям: • специфичность (чаще групповая); • высокая чувствительность; • экспрессность; • точность и воспроизводимость; • возможность сочетания с другими методами анализа. Скрининг используется при анализе многокомпонентных смесей, а в случае ненаправленного анализа - при исследовании извлечения из биологического объекта на неизвестное токсическое вещество. В настоящее время понятие скрининга в токсикологической химии значительно шире. Скрининг — это поэтапное движение к выявлению индивидуального вещества путем последовательного исключения групп ядовитых веществ, а затем отсеивания веществ в обнаруженной группе до выявления конкретного соединения. Из современных скрининговых методов в практике химико-токсикологического анализа нашла широкое применение хроматография в тонких слоях сорбента (ТСХ) в нормально-фазовом и обращенно-фазовом вариантах. ГЖХ-скрининг используется, в основном, при анализе летучих, лекарственных и наркотических веществ. Не потерял своего значения аналитический скрининг с использованием различных химических реакций. Имеются разработки по использованию в качестве скрининговых методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), абсорбционной спектроскопии, иммунохимических методов, спектроскопии ядерного магнитного резонанса. При использовании этих методов необходима тщательная очистка извлечений от эндогенных соединений, способных исказить результаты анализа и засорить колонки хроматографов. ТСХ-скрининг в нормально-фазовом варианте Метод используется в химико-токсикологическом анализе при исследовании веществ, изолируемых из объекта экстракцией и сорбцией (лекарственные, наркотические вещества, пестициды). Неподвижной фазой в TCX служит тонкий слой сорбента (0,1-0,5 мм), содержащий небольшое количество воды и нанесенный на пластинку (из стекла, фольги или полимера). Сорбентом чаще всего является силикагель или оксид алюминия, которые закрепляются на пластинке добавлением связующего компонента - гипса, крахмала и др. В качестве подвижной фазы (элюента, системы растворителей) предложены индивидуальные растворители или их смеси в определенных соотношениях. При движении элюента за счет капиллярных сил вверх по пластинке происходит разделение смеси веществ. Эффективность разделения зависит от сродства вещества к сорбенту и определяется коэффициентом распределения его между обеими фазами - подвижной и неподвижной. Чтобы обнаружить вещество на пластинке, используют различные способы детектирования: • визуальный, если само вещество окрашено; • облучение пластинки УФ-лучами, при этом вещество может флуоресцировать или давать темные пятна; • обработка пластинки соответствующими реагентами-проявителями, которые способны образовать с веществом окрашенные соединения. Для идентификации вещества используют величину Rf - отношение длины пробега анализируемого вещества к длине пробега растворителя (рис. 8). После хроматографирова-ния измеряют расстояние от центра пятна до стартовой линии (отрезок АБ) и от линии фронта жидкости до стартовой точки (отрезок AB). Отношение отрезков АБ к AB обозначают величиной Rf: Величина Rf характерна для данного соединения на данном сорбенте в данной системе растворителей. Она зависит от качества и активности сорбента, толщины слоя, природы растворителей и их соотношения, а поэтому не всегда воспроизводима. Более надежной оценкой хроматографической подвижности вещества является величина R5. Для ее определения находят величину Rf исследуемого вещества и Rf вещества, принятого за стандарт |