Выпускная квалификационная работа артефакты при изготовлении гистологических препаратов

• Название: Выпускная квалификационная работа артефакты при изготовлении гистологических препаратов
• Дата: 19.12.2019
• Размер: 3.7 Mb.
• Имя файла: Andreychuk_diplom.docx
• Тип: Документы; #101178
• страница: 4 из 8

1.4 Окрашивание фиксированных гистологических объектов

Окрашивание фиксированных гистологических. (Цитологических.) объектов служит для выявления (контрастирования) различных структур клеток и тканей, по-разному воспринимающих те или иные красители в зависимости от физико-химических свойств. Результаты окраски в значительной степени зависят от предшествующей обработки объекта (фиксации, заливки и т. п.). Гистологическая, окраска — сложный процесс, в к-ром играют роль многие физ.-хим. факторы, связанные со свойствами как красителя, так и окрашиваемого объекта. Гистологические, красители классифицируют по источникам получения (натуральные и синтетические), по хим. строению (азокрасители, хинонимидные и т. д.), по способу использования (протравные и т. п.), возможности избирательно окрашивать объект (ядерные, цитоплазматические и т. п.) и по другим свойствам. По наиболее распространенной классификации красители подразделяют на основные, кислые, нейтральные и индифферентные. Основные красители представляют собой красящие основания или чаще их соли (метиленовый синий, толуидиновый синий, азуры, тионин, а также гематоксилин, бисмарк коричневый и др.). Окрашиваемые ими структуры называют базофильными (см. Базофилия). Интенсивность базофильной окраски зависит от числа кислотных групп, способных реагировать с красителем. Кислые (кислотные) красители — это красящие к-ты или их соли (пикриновая к-та, эозин, эритрозин, конгорот, лихтгрюн, оранж и т. д.).[1] Окрашиваемые ими структуры называют ацидофильными, а также оксифильными или эозинофильными. К нейтральным красителям относятся смеси, содержащие как основные, так и кислые красящие компоненты, например, смесь Романовского— Гимзы (см. Романовского-Гимзы метод) и др. Наконец, красящие свойства индифферентных красителей связаны с их способностью растворяться в определенных веществах. Так, напр., судан III или шарлах-рот хорошо растворяются только в жирах и вследствие этого избирательно окрашивают их в красно-оранжевый цвет.

Способы (механизмы) окрашивания гистологических, структур весьма многообразны. Существующие теории (химическая, электроколлоидальная, физико-химическая, обменной адсорбции) касаются какого-то одного из механизмов окрашивания, но не охватывают всего многообразия связывания красителей со структурами клеток и тканей.

От окраски в собственном смысле слова отличают импрегнацию  — специальный метод выявления структур клеток и тканей, основанный на различной их способности удерживать или восстанавливать соли тяжелых металлов (напр., серебра, свинца, осмия, золота).[3]

1.5 Заключение препарата в среды

Изготовление гистологических, препаратов обычно заканчивается заключением их в среды, обеспечивающие сохранность структур объекта, его окраски и прозрачности. Наиболее часто для этой цели применяют канадский бальзам  — особый вид смолы, растворимый в ксилоле, толуоле и бензоле. Хорошо промытые после окраски или фиксации препараты обезвоживают в спиртах восходящей крепости (до 100%), просветляют в смеси кристаллической карболовой к-ты (1 часть) и ксилола (3 части) и помещают в две порции чистого ксилола. Затем на препарат наносят каплю раствора канадского бальзама (на ксилоле, толуоле или бензоле и др.) и покрывают покровным стеклом. После высыхания растворителя бальзам затвердевает, и препарат можно многократно использовать для микроскопирования. Существует много заменителей канадского бальзама (пихтовый бальзам, даммаровая смола, цедакс, полистирол и т. д.). В случаях, когда препарат нельзя приводить в контакт с ксилолом, спиртом и другими реактивами, растворяющими краситель или окрашиваемое вещество (например, жиры) , используют водорастворимые среды (глицерин, желатину или их смеси). При применении плохо затвердевающих заключающих сред (например, глицерина) края покровного стекла обычно окантовывают расплавленным парафином, менделеевской замазкой и т. п.

ГЛАВА 2. АРТЕФАКТЫ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Практическая часть работы была выполнена на базе: ГКБ им. Ф.И. Иноземцева ДЗМ и дополнительно в ГКБ № 15.

2.1 Артефикациальные изменения

В повседневной практике морфологи часто встречаются с артефикациальными изменениями тканей, которые зачастую образуются при технической обработке (фиксации, проводке, заливке и т.д.), что может создавать объективные трудности при гистологическом исследовании препаратов тканей и может стать источником диагностических ошибок. Источники ошибок можно разделить на две основные группы. Одни из них имеют субъективный характер, являясь результатом недостаточной осведомленности исследователя, неправильных методологических предпосылок при выполнении работы или нарушений законов логики в суждениях и выводах. Другие источники более объективны, существуют независимо от исследователя - это различные помехи, искажающие результаты. Таким помехам присуща известная закономерность. В данной работе мы не будем касаться упущений, зависящих от недостатка опыта и специальных знаний, необходимых для самостоятельной работы, хотя ошибки, возникающие по такой причине, наиболее часты, а иногда имеют роковые последствия. Что же касается объективных помех, то многие из них являются общими для всех морфологов: изменения органов и клеток, которые привносят агония, смерть и трупные процессы, технические артефакты и т.д. Удельный вес отдельных источников ошибок для тех, кто работает с жизненно свежим или с трупным материалом, неодинаков.

Основным объектом микроскопических исследований служит срез, т.е.: препарат, способный показать лишь статичное состояние заведомо умерщвленных тканей и клеток. Но стоит заметить, что и витальная микроскопия не лишена помех. Приемы, открывающие доступ к внутренним органам, или травма, наносимая любыми оптическими устройствами, вводимыми в ткань, нередко вызывают не только повреждения, но и нежелательные реактивные явления.

Живые ткани — кусочки, взятые путем биопсии или вырезанные у только что убитого животного, — наиболее пригодны и для изготовления гистологических препаратов. Но при этом возникают артефакты, появляющиеся в живых тканях в момент разреза или фиксации. Кроме того, в связи с наступлением смерти всего организма происходят изменения, поскольку терминальные расстройства функций (происходящие даже при быстрой гибели) получают свое морфологическое отображение, не всегда учитываемое должным образом.

Наряду с агональными и посмертными изменениями, серьезные помехи создают технические процедуры, которым подвергается материал, подготавливаемый для гистологических исследований. Фиксация, обезвоживание и т.д. всегда в той или иной степени искажают естественное строение живых клеток и тканей.

Уже на самом первом этапе работы медицинского лабораторного техника — во время получения материала для микроскопического исследования возникают разнообразные артефакты. Так, например, очень легко возникает ложный ателектаз легкого, сопровождающийся мнимым утолщением межальвеолярных перегородок, на местах, подвергшихся сдавливанию во время осмотра органа и иссечения из него кусочков для исследований. Поверхность разреза ткани, если он сделан недостаточно острым или тупым ножом, делает его практически непригодным для гистологических исследований (так как при этом возникают ложные сдавления ткани, ее разволокнения и т.д., имитирующие травматическое повреждение тканей). В некоторых случаях наблюдаются особые артефакты, обусловленные разносом по поверхности раны обрывков тканей и клеток (чаще это отмечается в кусочках, содержащих кость и полученных путем выпиливания, где опилки могут оказаться в самых разнообразных местах). При вырезании кусочков из органов, имеющих трубчатое строение, частицы поврежденной ткани могут вдавливаться в просвет трубок. Проявляя бережность, пользуясь острыми инструментами и применяя некоторые специальные приемы, удается уменьшить вред, наносимый тканям, подлежащим исследованию.

2.2 Артефакты при фиксации

Фиксация играет решающую роль для сохранения структуры тканей, предупреждения развития в них посмертных изменений, а также успешной последующей окраски. Полноценность фиксации зависит от правильного выбора фиксатора в зависимости от цели исследования, от сроков прошедших с момента смерти, от величины фиксированных кусочков, количества фиксирующей жидкости, продолжительности пребывания в ней материала и т.п. Погрешности при фиксации материала служат причиной многочисленных артефактов. Формалин представляет наиболее распространенный фиксатор, и его преимуществом является простота использования, недорогая цена, хорошие диффузионные свойства и достаточное уплотнение тканей. При длительном хранении в нем изменяется pH в кислую сторону вследствие образования муравьиной кислоты, которая мешает хорошей фиксации. Нейтрализация кислой реакции легко достигается прибавлением углекислого кальция.

При фиксации формалином, особенно кислым, возможно появление в срезах темно-коричневого пигмента в виде зернышек или глыбок. Так называемый «формалиновый» пигмент (рис.1)



Рисунок 1 – Формалиновый пигмент

имитирует другие кровяные пигменты (например, глыбки гемосидерина, которые образуются при распаде эритроцитов при травматических кровоизлияниях и повреждениях тканей), что при недостатке опыта может привести к диагностическим ошибкам, особенно в случаях при определении давности происхождения повреждений. На этапе фиксации ткань или набухает (в формалине) либо сморщивается (в алкоголе), а последующая обработка усиливает сморщивание вследствие дегидратации.

Причиной недостаточной фиксации может быть фиксация большого куска в малом количестве фиксатора. В недофиксированных тканях продолжает развиваться аутолиз и остается клеточная жидкость, которые в будущем помешают пропитке гидрофобным парафином (рис. 2).



Рисунок 2 – Неполная фиксация