Выпускная квалификационная работа артефакты при изготовлении гистологических препаратов

• Название: Выпускная квалификационная работа артефакты при изготовлении гистологических препаратов
• Дата: 19.12.2019
• Размер: 3.7 Mb.
• Имя файла: Andreychuk_diplom.docx
• Тип: Документы; #101178
• страница: 3 из 8

1.2 Гистологические методы исследования

Гистологические методы исследования (греч, histos столб, ткань + logos учение) — методы, применяемые для изучения строения и функций клеток и тканей растительных и животных организмов в норме, патологии и в эксперименте. Более узким по сравнению с Г. м. и. является термин «гистологическая техника», которым обозначают комплекс методических приемов, используемых в гистологии , а также в нормальной и патологической анатомии, главным образом при изготовлении препаратов клеток и тканей для их последующего микроскопирования.[5]

Гистологическое исследование. Гистологический метод диагностики основан на изучении тонкой морфологической структуры клеточного строения тканей организма. Материалом для гистологического исследования являются кусочки тканей, взятые оперативным путем специально для установления диагноза или удаленные во время оперативного лечения.

При биопсии материал берут таким образом, чтобы в состав иссекаемой ткани входили участки патологически измененной и здоровой ткани. Это дает возможность получить представление не только о клеточном составе патологически измененных тканей, но и о состоянии окружающих здоровых тканей, а при опухолях — об их отношении к пограничным здоровым тканям. Гистологическое исследование принято подразделять на срочное и плановое. Срочное исследование делают в тех случаях, когда в связи с опухолевым процессом необходимо быстро решить вопрос об объеме оперативного вмешательства. При этом взятую во время биопсии ткань тут же замораживают на микротоме при помощи углекислоты или электротока и готовят препараты. Основным недостатком этого метода является то, что препараты получаются довольно объемными, а это затрудняет их интерпретацию и может повести к ошибочному заключению. Для планового гистологического исследования, которое позволяет получить более достоверные данные, взятую ткань помещают в 10-20% раствор формалина и направляют в патогистологическую лабораторию. Следует подчеркнуть, что все удаленные во время оперативного вмешательства ткани и органы также помещают в раствор формалина и в обязательном порядке направляют на гистологическое исследование. Этот метод более информативен, позволяет изучить клеточное строение тканей организма. Чтобы получить материал для этого исследования, проводят биопсию. [10]

Существуют два основных пути микроскопического исследования клеток и тканей в зависимости от их состояния:

1) исследование живых (переживающих) клеток и тканей;

2) исследование неживых клеток и тканей, сохраняющих в той или иной мере морфологию, особенности и химические структуру, присущую данному виду тканей. Во втором случае исследование начинается с выбора способа фиксации, затем следует заливка препаратов и приготовление срезов, окрашивание и заключение препаратов в среды.

Исследование живых или переживающих объектов (витальное и суправитальное) дает возможность наблюдать физиологические, процессы в клетках и тканях, исследовать прижизненное их строение. Витальным наблюдением принято называть исследование клеток и тканей в живом организме, суправитальным — исследование живых клеток и тканей, выделенных из организма непосредственно перед исследованием и помещенных в соответствующие условия наблюдения. Прижизненные наблюдения можно проводить на клетках, свободно взвешенных в жидкой среде или выделенных из фрагментов тканей (простейшие, клетки крови, эпителиальные клетки соскобов слизистых оболочек и т. п.). Большие возможности для прижизненного наблюдения клеток и тканей дает метод культуры клеток и тканей . При этом извлеченные из организма кусочки тканей помещают в специальные питательные среды, где клетки растут, размножаются или некоторое время находятся в состоянии «переживания». С помощью этого метода визуальным путем или способом микрокиносъемки  анализируют свойства исследуемых тканей, их способность к пролиферации , автономному росту , чувствительность к различным факторам и пр. Клетки помещают в капле физиол. раствора или среды, в которой они культивируются, на предметное стекло (обычный размер 76 X 26 мм, толщина 1—2 мм), накрывают покровным стеклом (обычный размер 18 X 22 мм, толщина 0,15—0,20 мм) и изучают под микроскопом.[9] Для предотвращения охлаждения и высыхания препаратов используют специальные приспособления (камеры с подогревом и заданной влажностью, нагревательные столики и т. п.). Простейшим приемом, предотвращающим высыхание препаратов, может служить смазывание краев покровного стекла растопленным парафином, вазелином и т. п.

Для изучения процессов образования антител, продукции гормонов, кроветворения, злокачественного роста и др. нередко применяют культивирование ' клеток в диффузионных камерах, стенки которых сделаны из миллипорных фильтров, пропускающих макромолекулы, но не пропускающих клетки. Такие камеры имплантируют в различные ткани организма, наблюдая изменения находящихся внутри камеры клеток под влиянием гуморальных факторов организма или веществ, введенных в камеру одновременно с клетками.

Объектом прижизненного наблюдения могут служить и тонкие, пропускающие свет тканевые пленки (брыжейка, плавательные перепонки и т. п.). Выделенную брыжейку животных, напр., можно наблюдать под микроскопом, не нарушая ее нервных и сосудистых связей с организмом. Помещая органы во влажные прозрачные камеры, можно наблюдать многие микрофизиологиеские процессы в ряде органов лабораторных животных. Так, напр., у крысы удалось наблюдать [Блум и Фоситт (W. Bloom, D. Fawcett), 1968] процесс овуляции и перемещения яйца в яйцевод. Методы выведения органов и тканей во влажные прозрачные камеры без нарушения связей с организмом могут использоваться лишь в острых опытах. Для продолжительных, повторяющихся наблюдений используют различные модификации предложенного Сэндисоном (J. С. Sandison, 1924) так наз. метода окошечек. [8]При этом сквозное отверстие, сделанное в ухе кролика (или в складке кожи), с обеих сторон плотно закрывают тонкими стеклянными (или иными прозрачными) пластинками. В пространство между пластинками прорастает окружающая соединительная ткань с сосудами, что можно наблюдать, помещая «окошечко» под микроскоп. С помощью этого метода были сделаны важные наблюдения над развитием и функцией мелких тканевых сосудов и капилляров, поведением трансплантатов различных органов и т. д. Естественной прозрачной средой для прижизненных микроскопических наблюдений за теми или иными тканями может служить передняя камера глаза животных, в которую имплантируют изучаемую ткань. Так, в передней камере глаза удалось наблюдать первые стадии развития оплодотворенного яйца мыши, циклические изменения в кусочке трансплантированного эндометрия обезьяны (Блум и Фоситт, 1968), реактивные изменения имплантатов скелетной мышечной ткани и т. д.

Важное место среди приемов исследования живых клеток и тканей занимают методы микрургии (см.), т. е. совокупность методических приемов, дающих возможность производить разнообразные операции над помещенными в питательную среду очень мелкими и микроскопическими объектами (простейшими, клетками или комплексами клеток многоклеточных животных, яйцами иглокожих, земноводных, зародышами, внутриклеточными структурами и т. п.). В зависимости от размеров объекта операции производят вручную или с помощью специальных микроманипуляторов (см. ниже, раздел «Аппараты для гистологических исследований»). С их помощью можно производить пересадки ядер и ядрышек, введение в изолированные клетки различных веществ, подведение к клеточным мембранам микроэлектродов и т. д. Для локального разрушения микроструктур клеток, например, ядрышек, используют сфокусированный пучок ультрафиолетовых лучей («лучевой микроукол») — прием, впервые предложенный С. С. Чахотиным в 1912 г. Использование методов прижизненных наблюдений ограничивается большими техническими трудностями, связанными со свойствами тканей (непрозрачность, оптическая однородность и т. д.), с повреждающими воздействиями освещения (особенно ультрафиолетовыми лучами и др.), токсическим действием красителей и т. п. Вследствие этого при исследовании живых и переживающих объектов, следует особенно тщательно подбирать специальные методы микроскопического исследования в каждом отдельном случае. Для витального исследования могут быть применены следующие методы микроскопии.

1. Микроскопия в темном поле (см. Темнопольная микроскопия) основана на явлении рассеивания света на границе двух объектов с разными показателями преломления (напр., ядро и цитоплазма). Темнопольный микроскоп отличается от обычного только специальным конденсором, приспособленным для бокового освещения объекта. Т. о., прямой свет в объектив не попадает, а объект, освещенный рассеянным светом, кажется светлым на темном фоне. Так, напр., в живой клетке ядрышко, ядерная мембрана, митохондрии, жировые капли и другие включения будут светиться на темном фоне неструктурированной цитоплазмы. Метод находит применение в экспериментальной микробиологии, лабораторной диагностике, в частности для обнаружения бледных трепонем, и др.[7]

2. Фазово-контрастная микроскопия (см.) и интерференционная микроскопия основаны на свойстве биологических, структур, прозрачных для видимого света, изменять фазу проходящих через них лучей. Поскольку в разных участках объекта, отличающихся показателем преломления и толщиной, эти изменения неодинаковы, биологические, структуры становятся видимыми. Фазово-контрастную и интерференционную микроскопию живых клеток и тканей, особенно физиологических, процессов клеток культуры тканей, часто сочетают с замедленной (цейтраферной) или с ускоренной микро-киносъемкой, с помощью к-рой можно не только зафиксировать эти процессы, но и представить их в динамике. Интерференционную микроскопию используют также для получения количественных данных о сухой массе, показателях преломления объектов и их толщине. Разновидностью фазово-контрастного микроскопирования является аноптральная микроскопия.[7]

3. Поляризационная микроскопия основана на свойстве анизотропии (двойного лучепреломления) структур в клетках и тканях и применяется гл. обр. для выявления и идентификации некоторых кристаллических веществ и липидов, а также поперечнополосатых мышц, коллагена, миелина и т. д.

4. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия (см. Люминесцентная микроскопия), основанная на регистрации флюоресцирующих веществ, дает возможность наблюдать клетки и ткани при освещении (возбуждении) ультрафиолетовыми или сине-фиолетовыми лучами. Люминесцентный микроскоп со стеклянной оптикой позволяет наблюдать флюоресценцию в видимой части спектра, ультрафиолетовый флюоресцентный микроскоп с кварцевой оптикой используется для изучения невидимой ультрафиолетовой флюоресценции путем ее фотографической или фотоэлектрической регистрации. С помощью люминесцентных микроскопов можно наблюдать собственную флюоресценцию содержащихся в тканях веществ, например, витаминов А, В2, некоторых пигментов. В ультрафиолетовой области флюоресцируют, напр., содержащие триптофан белки. Наибольшее распространение, однако, получило использование специальных флюоресцентных красителей (см. Флюорохромы). Флюорохромы применяют в небольших концентрациях (1 : 10 000, 1 : 100 000), что позволяет широко использовать их для прижизненных наблюдений клеток и тканей. Интенсивность и спектры флюоресценции могут быть измерены (микрофлюорометрия), т. е. может быть получена и количественная, и качественная характеристика флюоресцирующих в клетке веществ. Флюоресцентные микроскопические методы широко используются не только для прижизненных наблюдений; они нашли применение в гистохимии, в иммуноморфологии (метод флюоресцирующих антител Кунса (см. Иммунофлюоресценция). Большие возможности для прижизненных наблюдений дает метод контактной флюоресцентной микроскопии (E. М. Брумберг, 1964), позволяющий получать изображения с поверхности органов и тканей. При этом используются специальные объективы, выполняющие одновременно роль опак-иллюминатора и конденсора.[7]

5. Ультрафиолетовая микроскопия основана на абсорбции ультрафиолетовых лучей хим. структурами клеток (белки, нуклеиновые кислоты). Этот метод применим для прижизненных наблюдений, однако наибольшее распространение он нашел в количественной цито- и гистохимии — метод абсорбционной цитоспектрофотометрии .[7]

Способом улучшения условий микроскопического наблюдения над живыми объектами является прижизненное окрашивание их специальными красителями, позволяющее изучить детали строения микроскопических объектов и исследовать некоторые их физиологические, свойства.

Несмотря на наличие многочисленных методов витальной микроскопии и на их большое значение, наиболее полную картину строения клеток и тканей можно получить при параллельном изучении живых и фиксированных объектов. Исследование фиксированных объектов дает возможность изучать структуру клеток и тканей неживых объектов.[6]

Фиксация — сохранение структуры клеток тканей и микроорганизмов путем быстрого воздействия на них хим. или физ. агентами, предотвращающими развитие посмертных изменений; привнесение артефактов при этом минимальное. Некоторые методы фиксации  позволяют в известной степени сохранить и хим. структуру клеток и тканей. Выбор способа фиксации зависит от задач исследования и особенностей объектов. Так, при исследовании клеточных ядер и хромосом обычно используют кислые фиксаторы. При исследовании ферментативной активности применяют ацетон , формальдегид ( Муравьиный альдегид) или глютаральдегид, вызывающие минимальную денатурацию белка и сохраняющие многие ферментные системы.

Большинство фиксаторов применяют в виде р-ров, действующих гл. обр. на белковые компоненты клеток и тканей. Входящие в состав фиксирующих смесей вещества (формальдегид, сулема и т. д.) образуют прочные связи между белковыми молекулами. Так, формальдегид реагирует с аминами, карбоксильными и индольными группами белка, в результате чего между белковыми молекулами образуются метиленовые мостики; сулема действует на сульфгидрильных, карбоксильные и аминогруппы белка, образуя ртутные мостики между белковыми молекулами. Соли хрома вызывают окисление и осаждают белки и фосфолипиды. Широкое распространение получили фиксаторы, содержащие пикриновую к-ту. Одним из лучших фиксаторов для исследования цитологических, объектов является четырехокись осмия (OsO₄), часто используемая для фиксации объектов, подвергающихся электронной микроскопии .[5]

При выборе фиксирующих смесей необходимо учитывать проницаемость ткани для разного вида фиксаторов. В случае медленного проникновения фиксатора в тканях могут развиться деструктивные изменения, связанные с аутолитическим действием ферментов, аноксией и т. п. Плохо проникает в фиксируемую ткань, напр., четырехокись осмия. Поэтому в растворах осмия фиксируют кусочки тканей толщиной не более 0,5—1,0 мм. При проведении гистохимических исследований необходимо знать, как влияет та или иная фиксирующая смесь на различные хим. компоненты клеток и тканей. Так, для исследования растворимых соединений используют методы замораживания-высушивания, а также замещения в замороженном состоянии. Лиофилизации состоит в быстром замораживании ткани (обычно используют жидкий азот) и ее обезвоживании (сушке) в вакууме при t° —30—40°. При методе замещения в замороженном состоянии замороженные при температуре жидкого азота ткани затем выдерживают при t° —20—60° в реактиве, растворяющем кристаллы льда (этиловый и метиловый спирт, ацетон). Оба названных метода позволяют сохранить хим. состав клеток и тканей практически неизмененным.

По окончании фиксации кусочки обычно промывают в воде или спирте. Твердые компоненты, имеющиеся в ткани (кость, хитин, отложения извести и др.), размягчают воздействием к-т или с помощью постоянного электрического тока — так наз. электролитическая декальцинация  и после удаления из ткани к-ты приступают к изготовлению постоянных препаратов.[4] Для изучения фиксированных объектов применяют многочисленные методы светооптической и электронной микроскопии.

В гистологической технике использование тотальных препаратов (мазки, отпечатки, пленочные препараты и т. п.) ограничено, и обычно приходится прибегать к изготовлению срезов тканей с помощью микротомов. Наиболее удобным способом, обеспечивающим быстрое изготовление срезов, является замораживание кусочка ткани. Однако при этом трудно получить достаточно тонкие срезы. Метод замораживания нельзя применять при работе с очень мелкими объектами; срезы некоторых тканей и органов крошатся и при оттаивании распадаются и т. д., в связи с этим ряд объектов приходится заливать в среды.

1.3 Заливка гистологических препаратов и изготовление срезов

Чаще прибегают к заливке объекта исследования в соответствующую среду, которая его пропитывает и уплотняет до консистенции, пригодной для изготовления срезов. Из сред для заливки наибольшее распространение получили парафин и целлоидин. Фиксированную ткань обезвоживают и пропитывают одним из этих веществ, проводя ее через промежуточный растворитель (ксилол или толуол для парафина, спирт-эфир — для целлоидина). Примерная схема заливки в парафин следующая. Кусочек ткани обезвоживают, проводя через ряд р-ров спирта возрастающей крепости (от 40 до 100%), затем помещают в смесь 100% спирта и ксилола (1 : 1), в ксилол (две порции), в смесь ксилола с парафином (1:1, при t° 37°), в чистый парафин (две порции, при t° 55—56°).[3] Парафин быстро охлаждают, кусочек ткани с окружающим его парафином вырезают в виде так наз. блока. При заливке в парафин и изготовлении блоков можно пользоваться специальными рамками, позволяющими регулировать размер и форму блоков. Вместо ксилола можно использовать толуол, бензол, хлороформ, а также касторовое масло. В качестве промежуточной пропитывающей среды часто "используют диоксан, а для обезвоживания — бутиловый, изобутиловый или пропиловый спирты, амилацетат и т. п. Заливка в парафин позволяет получить достаточно тонкие, пригодные для световой микроскопии срезы (от 5—8 мкм и до 1—2 мкм). При заливке в целлоидин обезвоженный в спиртах кусочек органа или ткани переносят в смесь 100% спирта и эфира (1 : 1), после чего пропитывают спиртоэфирными р-рами целлоидина возрастающей концентрации (от 2 до 8%). Затем кусочек в виде блока в деревянных или пластмассовых рамках выдерживают в парах хлороформа до затвердевания целлоидина и помещают в 70% спирт, где препарат приобретает плотность хряща и может храниться долгое время. Целлоидиновые срезы легко режутся на микротоме и хорошо окрашиваются большинством красителей, однако толщина их больше, чем у парафиновых срезов. Иногда используют прием дополнительной заливки пропитанных целлоидином кусочков в парафин (заливка в целлоидин-парафин), что позволяет соединить преимущества обоих методов. Время обезвоживания, пропитывания в промежуточных и заливочных средах подбирают для каждого конкретного исследования. Все более широкое применение находят для заливки тканей синтетические смолы (аралдит, эпон и т. д.), особенно при изготовлении срезов для электронной микроскопии. Изготовленные срезы для дальнейшей обработки обычно наклеивают на предметные стекла. Замороженные и целлоидиновые срезы можно не наклеивать на предметные стекла, а переносить из одного раствора в другой с помощью препаровальной иглы и т. п. Перед наклейкой парафиновых срезов на обезжиренные, чисто вымытые предметные стекла наносят тонкий слой смеси глицерина с куриным белком (1:1) и нагревают для денатурации белка. Затем в капле дистиллированной воды на предметном стекле расправляют парафиновые срезы, слегка их подогревая.[2] Избыток воды удаляют и стекла со срезами высушивают при t° 37—40° в термостате. Перед окраской или исследованием препаратов в неокрашенном виде из срезов удаляют парафин путем последовательного помещения препаратов в растворы ксилола и спиртов понижающейся концентрации (от 100 до 40%). При использовании целлоидиновых срезов, как правило, не требуется специальных процедур удаления целлоидина — срезы проводят, минуя ксилол, через ряд спиртов понижающейся концентрации (вплоть до воды) и окрашивают.