Задачі медичної мікробіології, етапи розвитку. Вдосконалення методів лабораторної діагностики інфекційних хвороб
 Скачать 154.95 Kb.
|
|
Матеріал змішують із специфічними сироватками, центрифугують. Утворені комплекси виявляють за допомогою електронної мікроскопії. Віруси, оточені молекулами специфічних імуноглобулінів мають вигляд вінка Електронна мікроскопія – застосовують електронний мікроскоп роздільна здатність якого 0,2 нм, збільшення 700000-1,5 млн разів, застосовують для дослідження ультраструктури клітинних мікроорганізмів і вивчення морфології вірусів, які невидимі в світловий мікроскоп (< 0,2 мкм або 200 нм) Люмінісцентна мікроскопія –Використовується здатність деяких об’єктів і барвників світитися при освітленні їх УФ, синіми або ін. коротко хвилевими променями світа. Мікробіологічна лабораторія призначена для виконання бактеріологічних досліджень, серологічних та вірусологічних досліджень Правила роботи в мікробіологічній лабораторії: 1. Вхід в лабораторію без спецодягу забороняється. Спецодяг є індивідуальним захистом для працюючого. Він також попереджує забруднення сторонніми мікробами досліджуваного матеріалами. 2. Забороняється їсти 3. В лабораторії не допускаються різки рухи, ходіння без потреби 4. При випадковому потраплянні досліджуваного матеріалу не руки, робоче місце, одяг або взуття, необхідно попередити викладача і під його керівництвом провести дезінфекцію 5. Робоче місце повинно утримуватись в повному порядку. Бактеріологічні петлі та чашки знезаражують в полум’ї пальника, а використані шпателі та піпетки – в ємкостях з дезрозчином 6. Після закінчення досліджень поживні середовища з посівами поміщають в термостат. Мікроскопи приводять в неробочий стан (маленьке збільшення, опущений тубус і компресор). Робочі місця протирають дезінфікуючими розчинами 3.1 Типи і механізми живлення бактерій. Поживні середовища, які використовують в мікробіології, вимоги до них, класифікація. Бактеріям притаманний голофітний тип живлення – вони утилізують поживні речовини із водних розчинів всією поверхнею клітини Механізми проникнення поживних речовин в клітину: Енергонезалежні 1)Проста дифузія: – відбувається за рахунок різниці градієнту концентрації (проникнення мілких молекул) – відбувається проникнення середніх ліпофільних молекул також і при вирівнюванні градієнту концентрації 2)Полегшена дифузія – відбувається за участю мембранних білків-пермеаз, постійно локалізованих в порах Схема полегшеної дифузії: Енергозалежні 1)Активний транспорт – відбувається за участю специфічних для речовин ферментів-перенощиків, локалізованих в ЦПМ, проти градієнту концентрації Механізм активного транспорту: 2)Транспорт, обумовлений фосфорилюванням – забезпечується фосфорильованим мембранним ферментом. Відбувається як за градієнтом концентрації, так і проти нього Класифікація бактерій за типом живлення: Залежно від джерела вуглецю та азоту 1)Аутотрофи (аміноаутотрофи) джерелом є неорганічні сполуки вуглецю і азоту 2)Гетеротрофи (аміногетеротрофи) джерелом є органічні сполуки вуглецю та азоту Гетеротрофи класифікуються: Сапрофіти – засвоюють органічні речовини відмерлих організмів Паразити – засвоюють органічні речовини живих організмів Паразитизм: Умовний (необлігатний) – бактерії можуть засвоювати органічні речовини зі штучних середовищ Обов’язковий (облігатний) – бактерії засвоюють органічні речовини живого організму, розвиваються лише внутрішньоклітинно (рикетсії, хламідії) Класифікація поживних середовищ: за походженням (природні, синтетичні, напівсинтетичні) за консистенцією (рідкі,напіврідкі, щільні) за призначенням: - універсальні - спеціальні(селективні, диференційно-діагностичні, транспортні, консервуючі, середовища накопичення Культуральні властивості бактерій: На рідких середовищах бактерії утворюють: -помутніння -плівку -осад -їх комбінації На твердих середовищах утворюють колонії Колонія – це видиме неозброєним оком скупчення біомаси бактеріальних клітин на поверхні або в товщі щільного поживного середовища Характеристика колонії: Розмір (карликові, малі, середні, великі, гігантські) Колір (залежить від кольору пігментів бактерій) Характер краю (рівний, хвилястий, волокнистий тощо) Форма (кругла, овальна, розеткоподібна тощо) Консистенція (м’яка, в’язка, крихка) 3.2 Дихання бактерій. Аеробний та анаеробний типи дихання. Ферменти та структури клітини, що беруть участь в процесі дихання. Методи вирощування анаеробних бактерій. Класифікація бактерій за типом дихання: 1) Аероби – використовують як кінцевий акцептор кисень облігатні – парціальний тиск кисню 20% мікроаерофіли – парціальний тиск кисню 5% 2) Анаероби – використовують сульфати, карбонати, нітрати, піруват факультативні – можуть використовувати кисень облігатні – гинуть в кисневих умовах Аеробні бактерії в процесі дихання окислюють різні органічні сполуки. При повному окисленні молекули глюкози вивільнюється певна кількість калорій тепла. При неповному окисленні вивільнюється відповідно ступеню окислення менша кількість енергії. Інтенсивність процесів аеробного дихання залежить від віку культури, температури і поживних субстратів. Посилене дихання і прискорений обмін речовин пов’язані зі швидкістю поділу клітин, з підвищенням синтезу білка в клітині, що призводить до посилення відновних властивостей середовища, у якому розвиваються мікроби. Дихання у анаеробів - шляхом ферментації субстрату с утворенням невеликої кількості енергії. До анаеробних процесів належать спиртове бродіння, молочнокисле бродіння, маслянокисле бродіння. Анаероби ферментують здебільшого без азотисті сполуки, викликаючи бродіння. Між аеробним і анаеробними типами дихання немає чіткої межі. Дихання бактерій проходить за участю ферментів оксидаз і дегідраз, яким притаманна виражена специфічність. Способи створення анаеробних умов: Анаеростат – апарат, з якого відкачують повітря і заповнюють інертним газом Хімічний спосіб – культивування в ексикаторі з поглиначами кисню (лужний р-н пірогалолу) Газовий пакет з регенератором Біологічний спосіб – одночасне культивування в герметизованій чашці Петрі облігатних аеробів з анаеробами Культивування в товщі середовища Методи вирощування анаеробних бактерій Для культивування анаеробів потрібно створити знижений парціальний вміст кисню в середовищі чи повітрі , з яким воно межує, що досягається декількома способами. 1. Посів анаеробної культури уколом в високий стовпчик цукрового агару. Це найбільш простий спосіб. 2. Додавання в середовище редукуючи речовин. Найчастіше застосовується середовище Кітта-Тароцці: бульйон з 0,5% глюкозою і шматочками свіжих органів тварин(чи з м’ясним фаршем). Шматочки органів, а також глюкоза володіє редукуючи ми властивостями. Середовище зверху заливають шаром масла. Поживні середовища перед посівом анаеробів «регенерують», кип’ятять для видалення кисню. Після посіву їх заливають зверху шаром парафінового чи вазелінового масла для відокремлення від атмосферного повітря. 3. Видалення повітря. Із середовища механічним шляхом. Для цього використовують анаеростати, з яких повітря викачується насосом. 4. Заміна повітря індиферентним газом. таким газом , наприклад, є водень, який отримують в апараті Кіппа і через приєднану трубку надходить в посудину, де знаходяться посіви анаеробів, витісняючи повітря з киснем. 5. Механічний захист від кисню повітря. Зручний спосіб Віняля-Вейона: беруть скляну трубку довжиною близько 30см і шириною 3-6мм. Один кінець її витягують в капіляр, а з іншого роблять перетяжку і вставляють ватну пробку; засівають в розтоплений агар досліджуваний матеріал, перемішують середовище і потім засипають агар в стерильну трубку. Потім запаюють капіляр і трубку поміщають в термостат. В середовищі виростають видимі ззовні колонії бактерій, які можна дістати, розпилявши трубку. 6. Хімічне поглинання кисню, наприклад основним розчином пірогалолу (10% розчин основи і пірогалолу) в особливих пристроях. 7. Біологічний метод – комбінований посів культури анаеробів і аеробів (способом Фортнера). Посів виконують на чашку з товстим шаром кров’яного агару, розподіленого навпіл вирізаною посередині чашки, прокаленим стерильним скальпелем, невеликою межею. На одній половині агару роблять посів культури аероба, на іншій – посів культури анаероба. Чашку обмащують парафіном і поміщають в термостат. Спочатку відбувається ріст аеробів. Коли вони в достатній мірі вичерпаються з чаші кисень, починається ріст анаеробів. 2.2 Морфологія та будова бактерій. Роль окремих структур для життєдіяльності бактерій та у патогенезі інфекційних захворювань. Методи їх виявлення Морфологічні особливості бактерій і їх ультраструктура є, як правило сталою (постійною) ознакою, що дозволяє використовувати їх в якості ідентифікаційного критерію Сферичні – коки (гр. кokkos-ягода, зерно) – мають кулясту, овальну, бобовидну, ланцетовидну форму В залежності від характеру розташування в полі зору, що пов’язано із кількістю площин поділу, виділяють: • мікрококи (поодинокі коки) • диплококи (по 2) • тетракоки (по 4) • стрептококи (ланцюги) • сарцини (пакети по 8 - 16 коків) • стафілококи (грона) Паличкоподібні або палички – мають циліндричну форму, розрізняються за розмірами, формою кінців клітини, розташуванням і спороутворенням За розташуванням: поодинокі, диплобактерії (диплобацили), стрептобактерії (стрептобацили) За спороутворенням: • Споронеутворюючі- власне бактерії • Cпороутворюючі - бацили – діаметр спори не перевищує d бактерії - клостридії – d спори > d бактерії, тому при спороутворенні клітина деформується (closter-веретено) Звивисті бактерії – спіралеподібні бактерії, які мають 1 або більше завитків За кількістю завитків: • Вібріони (1/4 завитка) • Спірили (1-2 завитка) • Спірохети (3-25 завитків) - борелії (3-8 завитків) - трепонеми (8-15 завитків) - лептоспіри (20-25 завитків) Ниткоподібні – розміри від 50 мкм (актиноміцети) Ультраструктура бактерій: Клітинна оболонка бактерій: - капсула - клітинна стінка - цитоплазматична мембрана Поверхневі структури бактерій: - джгутики - мікроворсинки (пілі або війки, фімбрії) Внутрішні структури: - цитоплазма - нуклеоїд - рибосоми - лізосоми, мезосоми - включення Капсула – зовнішній шар, розташований поверх клітинної стінки, який не фарбується аніліновими барвниками За хімічним складом виділяють: • Полісахаридні капсули • Поліпептидні капсули • Змішані капсули За здатністю утворювати капсулу виділяють: • Безкапсульні мікроорганізми • Капсульні мікроорганізми, які утворюють капсулу - тільки в макроорганізмі - в макроорганізмі і на спеціальних поживних середовищах - постійно В залежності від товщини і щільності зв’язку з стінкою клітини капсули поділяють на: • макрокапсули (істинні) – видимі в світловий мікроскоп, товщина > 0,2 мкм, виявляють за допомогою спеціального методу забарвлення за Бурі-Гінсом • мікрокапсули (товщина < 0,2мкм), невидимі в світловий мікроскоп, виявляють за допомогою електронної мікроскопії або за допомогою серологічних реакцій • Капсулоподібна оболонка або слизовий шар – нещільно зв’язана з поверхнею клітини (ліпідо-полісахарідний шар) Функції та властивості капсули: 1.Захисна функція: • Захист від несприятливих факторів навколишнього середовища ( інсоляції, висушування, бактеріофагів) • Антифагоцитарна роль (обумовлює патогенні властивості капсульних бактерій) 2.Адгезивна функція • Полісахариди капсули споріднені до певних клітин або тканин організму людини (тропізм) 3.Антигенні властивості • Полісахариіди або поліпептиди капсул утворюють К-АГ – при потраплянні в організм викликає імунну відповідь • Використовують для виготовлення вакцин проти капсульних бактерій Будова клітинної стінки: Для вивчення будови і хімічного складу клітинної стінки бактерій в умовах звичайної баклабораторії використовують складний метод забарвлення за Грамом. В залежності від будови і хімічного складу клітинної стінки бактерії поділяють на: грампозитивні (забарвлюються за методом Грама у синьофіолетовий колір) грамнегативні – забарвлюються у рожевий колір. Основним компонентом клітинної стінки гр(+) і гр(-) бактерій є пептидоглікан (син. муреїн,мукопептид протеоглікан) – складний біополімер, побудований із полісахаридних і пептидних ланцюгів і являє собою складну сітчасту макромолекулу (“муреїновий мішок”), який покриває протопласт бактерії. Особливості будови клітинної стінки гр(+) бактерій: 1. пептидоглікан складає до 90% сухого залишку, який має багатошарову будову (одноманітність) 2. до складу клітинної стінки входять тейхоєві кислоти , які прошнуровують усю товщу клітинної стінки 3. ліпіди, як правило, відсутні; винятком є кислотостійкі бактерії, які містять велику кількість нейтральних жирів, восків,парафінів 4. білки розташовуються назовні від клітинної стінки (наприклад, білок А у Staphylococcus і білок М у Streptococcus) 5. товщина клітинної стінки > 20нм (20-40нм) Особливості будови клітинної стінки гр(-) бактерій: • 1. складається із трьох шарів, різних за хім. будовою: • - внутрішній шар ригідний представлений 1 або 2 шарами пептидоглікану,який складає 20% сухого залишку • середній шар - ліпопротеїновий (зовнішня мембрана) зовнішній шар - ліпополісахаридний пластичний шар • до складу пластичного шару входять білки, фосфоліпіди, ліпополісахариди • 2. товщина клітинної стінки < 20нм. • 4. менш ригідна,чим клітинна стінка гр(+) бактерій Функції клітинної стінки : 1. Захисна - від шкідливих факторів зовнішнього середовища 2. Формоутворююча –надає форми за рахунок ригідності 3. Рецепторна (рецептори для бактеріофагів, хімічних речовин, бактеріоцинів) 4. Імуногенна (компоненти клітини стінки є повноцінними АГ і подразнюють імунну систему людини) 5. Транспортна 6. Приймає участь у поділі клітини 7. Токсичні властивості (ендотоксин) 8. Будова та хімічний склад клітинної стінки бактерії обумовлює її тінкторіальні властивості (здатність сприймати барвники) Поверхневі структури: До поверхневих структур мікроорганізмів відносять органели руху – джгутики, пілі (фімбрії) Джгутики бактерій – орган руху, побудований із особливого скоротливого білка флагеліну; Наявність джгутиків, їх кількість і характер розташування є ідентифікаційною ознакою певних мікроорганізмів. • Джгутики складаються з базального тільця, за допомогою якого вони кріпляться до бактерії, гачка і власне джгутика (білок флагелін). • Базальне тільце побудоване як система кілець (2 у гр(+) і по 4 (2по2) у гр (-), нанизаних на осьовий циліндр. В базовому тільці утворюється обертовий момент , який передається на джгутик, завдяки руху якого бактерія рухається. • Направлений рух бактерій називається таксис • (аеро-, хемофототаксис) За видом руху виділяють: • Ковзаючі – рух за рахунок скорочення тіла • Плаваючі – рух за допомогою жгутиків • а)монотрихи – один джгутик з одного боку б)лофотрихи – два або декілька з одного боку в)амфітрихи – по одному або декілька з обох полюсів г)перитрихи – джгутики по всій поверхні тіла До поверхневих структурних елементів відносять також пілі або фімбрії. Розрізняють пілі двох типів: 1. Пілі загального типу (common-пілі) – забезпечують адгезію бактерій на певних органах або тканинах 2. F – пілі або sex- пілі – слугують для передачі генетичного матеріалу під час кон”югації двох різних клітин. Джгутики виявляють у плаваючих бактерій, здатних до руху у рідкому або напіврідкому середовищі. Існують як прямі, так і непрямі способи виявлення джгутиків. Методи виявлення джгутиків: Прямі (мікроскопічні методи): а) електронна мікроскопія – дозволяє вивчити будову джгутиків, встановити їх кількість і розташування (монотрихи,амфітрихи, лофотрихи, перитрихи) б) світлова мікроскопія мазків , забарвлених спеціальними методами (Леффлера, імпрегнація сріблом) Непрямі методи – базуються на вивченні рухливості бактерій: а)бактеріоскопічний метод – мікроскопія нативних препаратів ”роздавлена” або висяча крапля – для вивчення монотрихіальної рухливості б) бактеріологічний метод – посів уколом в стовпчик напіврідкого агару (визначення перитрихів) або посів в конденсаційну воду скошеного агару Внутрішні структури бактерій: • Включення – це продукти метаболізму бактерій, які розташовуються в цитоплазмі і використовуються клітиною в якості запасних поживних речовин. • За хімічним складом це можуть бути як органічні (білки, жири, глікоген, крохмаль), так і неорганічні сполуки (сірка, поліфосфати, залізо). Ідентифікаційне значення в медичній мікробіології мають тільки зерна волютину (поліфосфати) у Corynebacterium diphtheriaе, які виявляють за методом забарвлення за Нейсером (тіла бактеріальних клітин жовті, зерна – синьо-чорні). |