|
Задачі медичної мікробіології, етапи розвитку. Вдосконалення методів лабораторної діагностики інфекційних хвороб
Спори бактерій – округлі або овальні утворення, які формуються всередині бактеріальної клітини за несприятливих умов зовнішнього середовища.
Основна мета спороутворення у бактерій – збереження виду в несприятливих умовах.
Найбільш впливовим фактором для утворення спори є відсутність поживних речовин, наявність кисню в оточуючому середовищі для анаеробних бактерій, висушування.
Процес спороутворення у бактерій проходить у 4 стадії і триває 18-20 годин.
В організмі людини або на поживних середовищах (сприятливі умови) спори проростають і утворюють вегетативну форму.
Процес проростання спори триває 5-6 годин.
Виявляють спори за методами Ожешко або Ціля-Нільсена (спори забарвлюються у червоний колір, вегетативні клітини – у синій).
2.4 Морфологія і класифікація мікроскопічних грибів, патогенних для людини. Методи їх вивчення
Форма клітин у молодих культур може бути кругла, яйцеподібна або витягнута, у зрілих клітин – грушоподібна, веретеноподібна, амебоподібна.
Гриби мають диференційоване ядро (одне або кілька), клітинну стінку, цитоплазматичну мембрану. У молодих культур цитоплазма гомогенна, у дорослих – зерниста; містяться мітохондрії, комплекс Гольджі, вакуолі, включення. Основний структурний компонент – міцелій, який складається з безбарвних ниток гіфів. Спорин’я утворює склєроций у вигляді щільного сплетення гіф міцелію. Морфологія різноманітна, особливо в культурах на різних поживних середовищах, де спостерігається виражений поліморфізм. Тканинні форми патогенних грибів менш поліморфні, вони відрізняються від культуральних, це враховується в діагностиці мікозів.
Найбільше значення для медицини мають ооміцети, аскоміцети, базидіоміцети, дейтероміцети.
Культивують в аеробних умовах при т 22-27С на поживних середовищах, які містять азотисті і вуглецевмісні речовини. Найкраще рН 6,0-6,5, але патогенні гриби можуть рости при рН 3-10. Патогенним грибам потрібні різноманітні фактори росту( вітаміни, амінокислоти) і мікроелементи. Виробляють різнокольорові пігменти, які ділять на розчинні у воді і розчинні у спирті, ацетоні. Деяка кількість грибів здатна продукувати екзотоксини, більшість продукує ендотоксини.
2.3 Морфологія і класифікація найпростіших, патогенних для людини. Методи їх вивчення
Найпростіші – одноклітинні еукаріотні тваринні організми, більше організовані у порівнянні із бактеріями. Мають цитоплазму, диференційоване ядро (деякі представники багатоядерні), різну за своїми оптичними властивостями оболонку, примітивні органоїди. Розмножуються простим і множинним поділом, статевим шляхом, складним способом (статевим і нестатевим). Деякі форми можуть утворювати цисти. Тип Найпростіші має чотири класи: джгутикові, саркодові, споровики, війчасті. Патогенними є збудники лейшманіоза, трипаносомоза, тріхомоніаза, лямбліоза, амебіаза, малярії, токсоплазмоза, балантидіаза.
Найпростіші (Protozoa) – еукаріотичні одноклітинні мікроорганізми, що складають підцарсвто царства тварин (Animalia). Найпростіші включають 7 типів, із яких 3 типи (Sarcomastigophora, Apicomplexa, Ciliophora) мають представників, що викликають захворювання у людини. Розміри найпростіших коливаються в межах від 5 до 30 мкм.
Ззовні найпростіші вкриті мембраною(пеликулою) – аналогом цитоплазматичної мембрани клітин тварин. Деякі представники найпростіших мають опорні фібрили. Цитоплазма і ядро відповідають по будові еукаріотичним клітинам: цитоплазма складається з ендоплазматичного ретикулума, мітохондрій, лізосом, і ін.; ядро має ядерце і ядерну оболонку. Рух найпростіших здійснюється за допомогою джгутиків, війок і шляхом утворення псевдоподій. Найпростіші можуть харчуватися шляхом фагоцитозу чи утворенням особливих структур. Багато найпростіших при неблагоприємних умовах утворюють цисти – стадію спокою, що стійка до змін температури, вологості і т.д.
Тип Sarcomastigophora. Підтип Mastigophora(джгутикові) включає в себе наступних патогенних представників: трипаносому – збудника африканського трипаносомозу (сонної хвороби); лейшманії – збудника шкірної і вісцеральної форм лейшманіозів; трихонади, що передається статевим шляхом і паразитують в товстій кишці людини; лямблії – збудника лямбліозу. Ці найпростіші характеризуються наявністю джгутиків: один у лейшманій, 4 вільних джгутики і ундулююча мембрана у трихомонад.
До підтипу Sarcodina (саркодові) відноситься дизентерійна амеба – збудник амебної дизентерії людини. Морфологічно з нею схожа непатогенна кишкова амеба. Ці найпростіші пересуваються шляхом утворення псевдоподій. Поживні речовини захоплюються і погружаються в цитоплазму клітин. Статевий шлях розмноження у амеб відсутній. При несприятливих умовах вони утворюють цисту.
Тип Apicomplexa. В класі Sporozoa (споровики) патогенними представниками є збудники токсоплазмозів, кокцидіозів, саркоцистозів, малярії і пневоцистозу. Збудник пнемоцистозу умовно віднесений до найпростіших. Життєвий цикл збудника малярії характеризується чергуванням статевого розмноження (в організмі комарів Anopheles)
І безстатевого ( в клітинах тканин і еритроцитів людини вони розмножуються шляхом множинного поділу). Токсоплазми мають півмісяцеву форму. Токсоплазмозом людини заражається від тварин. Токсоплазми можуть передаватися через плаценту і вражати центральну нервову систему і очі плоду.
Тип Ciliophora. Патогенний представник – збудник балантидіазу вражає товстий кишечник людини. Балантидії мають численні війки і тому є рухливі.
Методи вивчення
Морфологія найпростіших вивчається як в живому так і в забарвленому вигляді. Просте забарвлення (фуксином чи синькою) непридатна, так як вона не дозволяє вивявити складну структуру цих мікроорганізмів. Найбільш простим способом, що дозволяє диференціювати окремі елементи клітини, є метод забарвлення за Романовським-Гімзе. При цьому фіксація мазків повинна виконуватись не над полум’ям, а в якому-небуть фіксаторі(наприклад сумішшю спирту з ефіром по Нікіфорову).
3.3
Ферменти бактерій, їх роль в обміні речовин. Ферменти патогенності. Використання для диференціації бактерій.
Для відтворення метаболічних процесів бактерії використовують ферменти. Їх набір – генетично детермінована ознака. Вивчення ферментативної активності збудників проводять з метою ідентифікації.
Класифікація ферментів
За механізмом дії:
оксидоредуктази
трансферази
гідролази
ліази
лігази
ізомерази
За місцем локалізації:
ендоферменти – локалізуються в цитоплазмі, ЦПМ або периплазматичному просторі
екзоферменти – виділяються в зовнішнє середовище
За генетичним контролем:
Конститутивні – постійно синтезуються клітиною
Індуктивні – синтезуються в присутності субстрату
Репресивні – їх синтез пригнічується надмірним накопиченням продуктів метаболізму реакції, яка ними каталізується
За субстратом:
протеолітичні
цукролітичні
- ряд Гісса(глюкоза, лактоза, маніт, мальтоза, сахароза +МПБ+ індикатор);
- довгий ряд Гісса - до 20 вуглеводів;
- СистемиІндикаторніПаперові;
- Тест системи (ентеротести,стафілотести);
- системи мультимікротестів;
- середовища ДСС(Енна, Лєвіна, Плоскірєва).
Лі політичні
Амілолітичні
Пептолітичні
Гемолітичні
Лецитиназна активність
Окрема група - ферменти захисту та агресії
Практичне значення
Ферменти використовують:
з метою ідентифікації збудників інфекційних хвороб
як лікувальні препарати:
- фібринолізин – для попередження тромбоемболій при свіжих інфарктах
- пеніциліназа – для профілактики анафілаксії на пеніцилін
стрептодорназа – для розрідження гною і полегшення дренажування
в промисловості їх використовують у виробництві біологічних препаратів (вітаміни групи В, аскорбінової кислоти, амінокислот, генній інженерії )
Ферменти патогенності:
- Гіалуронідаза – руйнує гіалуронову кислоту сполучної тканини
- Лецитиназа – руйнує лецитин клітинних оболонок
- ДНК-аза та РНК-аза
- Фібринолізин – руйнує фібрин кров´яних згустків
- Плазмокоагулаза – коагулює білки плазми, закриває власні рецептори
- Колагеназа – руйнує колаген
- Гемолізин – руйнує мембрани еритроцитів
3,4
Ріст і розмноження бактерій. Механізм клітинного поділу, фази розмноження культури бактерій у стаціонарних умовах.
Ріст – процес збільшення біомаси клітини внаслідок синтезу нових речовин
Розмноження – процес відтворення подібних собі особин, який забезпечує існування виду
Механізми розмноження(клітинного поділу):
бінарний поділ
дроблення і спороутворення (у актиноміцетів)
брунькування
Фази розмноження бактерій в ізольованому середовищі
Лаг-фаза – адаптація до нових умов
Експоненціальна фаза – інтенсивне розмноження (збільшення кількості особин в геометричній прогресії)
Стаціонарна фаза – кількість відмерлих особин дорівнює кількості живих, що розмножуються
Фаза відмирання – інтенсивне відмирання (кількість відмерлих збільшується в геометричній прогресії)
Крива росту мікроорганізмів в поживному середовищі
3.5
Бактеріологічний метод дослідження. Принципи виділення чистих культур бактерій та їх ідентифікації
| Методы выделения чистых культур. Выделение от¬дельных видов бактерий и получение чис¬той культуры являются основой бактери¬ологической работы, так как на практике чаще всего приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микробов. Установление же вида микроба и изучение всех его свойств возможно только тогда, когда бактерии полу-чены в чистом, изолированном виде, т. е. в чистой культуре. Основной задачей при исследовании материала, содержа¬щего смесь микробов, является получение отдельных коло¬ний (скопление микробов одного вида, выросших из одного зародыша) по возможности всех микробов, находящихся в исследуемом материале. Простейший способ — механичес-кое разобщение микробов на поверхности плотной пита¬тельной среды. Для этой цели наиболее часто применяется агар, разливаемый в так называемые чашки Петри (рис 49).
Выделение чистых культур методом рассева на чашки. Посев шпателем (метод Дригальского). Простейшим спо¬собом разъединения микробов является последовательное
растирание материала стеклянным шпателем (рис. 50) или петлей по поверхности агара на нескольких чашках Петри с питательной средой.
Агар в чашках приготовляют заранее следующим обра¬зом: стерильный агар, находящийся в колбах или флаконах, расплавляют на водяной бане. Колбу с расплавленным ага¬ром берут в правую руку, а левой вынимают пробку. Обжи¬гают горлышко колбы и большим и указательным пальца¬ми левой руки приподнимают крышку чашки лишь настоль¬ко, чтобы в щель могло пройти горлышко колбы со средой. Вводят горлышко под крышку чашки (не касаясь ее краев), наливают в чашку 10—15 мл питательной среды, быстро выводят горлышко колбы из чашки и закрывают ее крыш-ку. Тотчас же обжигают край горлышка колбы и пробку и
закрывают колбу. Если среда не распределилась равномер¬но по дну чашки, то, осторожно покачивая чашку, среду распределяют ровным слоем толщиной приблизительно 0,5 см. Пока среда не застынет, чашки нельзя передвигать или переносить. Застывшую среду подсушивают в термо¬стате или в закрытых чашках в течение 1—2 часов или в от¬крытых чашках в течение 30 минут. В последнем случае от¬крытые чашки помещают дном вверх на полках термостата, покрытых стерильной бумагой.
Первый день: посев исследуемого матери¬ала. Посев производится на трех пронумерованных чаш¬ках Петри (I, II, III) с питательной средой. Для посева за¬ранее заготовляются стеклянные шпатели, завернутые в бумагу и простерилизованные. Можно сделать шпатель из пастеровской пипетки, загнув под углом ее конец в.пламе¬ни горелки.
1. На поверхность питательной среды в чашке I наносят петлей или стерильной пастеровской пипеткой каплю иссле¬дуемого материала и растирают ее стерильным шпателем, двигая его сначала взад и вперед на небольшом участке, а затем круговыми движениями по всей поверхности пита¬тельной среды. При этом крышку чашки приоткрывают ле¬вой рукой лишь настолько, чтобы в щель мог пройти шпа¬тель.
2. Вынимают шпатель из чашки I, закрывают ее и быст¬ро переносят шпатель в чашку II, не прожигая его. Растирают материал по всей поверхности среды, прикаса¬ясь к ней той же стороной шпателя, которой растирался материал в чашке I. Чашку II закрывают.
3. Так же переносят шпатель в чашку III и растирают материал по поверхности питательной среды той же сторо¬ной шпателя. Закрывают чашку. Шпатель прожигают или опускают в дезинфицирующую жидкость.
4. Чашки надписывают (название материала, фамилия больного, дата) и ставят в термостат вверх дном, чтобы об¬разующиеся капельки паров воды, попадающие на крышку, не стекали на поверхность среды и не размывали посева. Чашки находятся в термостате 18—24 часа.
Второй день: изучение колоний и выделе¬ние чистых культур. Через сутки засеянные чашки вынимают из термостата и изучают полученные посевы. На
чашке 1, где было много материала, получился сплошной рост бактерий и отдельных колоний не видно. На чашке II и в особенности на чашке III колонии распределились изо¬лированно, поэтому легко доступны исследованию (рис. 51).
Прежде всего изучают колонии макроскопичес¬ки, невооруженным глазом. Просматривают чашку (не от¬крывая) со стороны дна в проходящем свете, держа ее на уровне глаз на расстоянии 20—30 см. Обнаруживают, что посев смеси микробов дал рост неоднородных колоний. От¬мечают величину колоний (крупная, мелкая, точечная), форму (правильная круглая, неправильная, плоская, воз¬вышающаяся над поверхностью среды), цвет (бесцветная, окрашенная), консистенцию (плотная, крошащаяся, мяг¬кая), характер поверхности (гладкая, морщинистая, блес-тящая, тусклая, влажная, сухая, слизистая и т. д.).
Еще лучше видна разница в структуре колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого пользуются или
лупой, или вынутым из тубуса микроскопа окуляром', или микроскопом со слабой сухой системой при суженной диаф¬рагме или несколько опущенном конденсоре. При изучении под микроскопом чашку помещают на столике вверх дном и, передвигая ее, отмечают на ней карандашом колонии различной формы, очерчивая их кружком.
Под микроскопом резко выявляется строение колоний: характер краев (ровные, фестончатые, зазубренные), характер поверхности (гладкая, шероховатая), структура (гомогенная, зернистая, однородная или различающаяся в центре и по периферии).
Каждому виду микробов свойствен определенный харак¬тер колоний. Нередко характер колоний имеет диагности¬ческое значение для определения возбудителей болезни.
3. Из части каждой из намеченных колоний делают маз-I ки, окрашивают их по Граму.
Намеченные колонии пересеваются в пробирки с косым агаром. Из остатка колонии, находящегося на петле после посева, следует приготовить мазок и чжрасить его, чтобы микроскопией проверить чистоту изучаемой колонии и мор¬фологию микробов в ней.
Пробирки с посевами помещают в термостат на 18—24 часа.
4. Производят подсчет колоний (см. ниже).
Третий день: проверка чистоты культуры и изучение свойств микроба. Через сутки про¬бирки с посевами вынимают из термостата и убеждаются, что в каждой из них получен посев однородной культуры. Проверяется чистота культуры и изучается морфология бактерий в мазках, окрашенных по Граму. Посев петлей. Выделение чистых культур из смеси мик¬робов можно сделать посевом петлей штрихом.
1. Простерилизорованной на пламени горелки и охлажден¬ной петлей берут материал для посева и осторожно вводят петлю в чашку.
2. На поверхности питательной среды распределяют ма¬териал петлей параллельными штрихами на расстоянии 0,5 см один от другого от одного края чашки к другому, держа петлю плашмя (не царапать питательной среды).
3. Вынимают петлю из чашки. Тотчас же, закрыв чашку, обжигают петлю и ставят ее в штатив.
4. Чашку надписывают и помещают в термостат вверх дном на сутки.
Рост на агаре на первом штрихе сплошной, на следую¬щих — изолированными колониями.
Все дальнейшие манипуляции с изолированными коло¬ниями совершенно такие же, как при посеве шпателем.
При достаточном навыке посев петлей исследуемого ма¬териала (взятого в небольшом количестве) производят лишь на одну чашку с агаром, получая в последних штри¬хах рост микробов в виде изолированных колоний.
Метод пластинчатых разводок Коха. Этот метод выделе¬ния чистых культур на плотной среде употребляется в тех случаях, когда нужно произвести количественное оп¬ределение микробов — подсчет микробов в определенном объеме исследуемого материала (вода, гной и т. д.).
1. Расплавляют в кипящей воде в нескольких пробирках по 9 мл агара, а затем охлаждают его до 50—55°, оставляя пробирки на все время работы в горячей воде такой же тем¬пературы.
2. Стерильной пипеткой набирают 1 мл исследуемого ма¬териала, вносят в первую пробирку с агаром и переме¬шивают. Получается разведение 1(Н.
3. Далее последовательно переносят по 1 мл из пробир¬ки в пробирку, получая таким образом соответствующие разведения: 10^2, 10
3 и т. д. Количество пробирок, взятых в опыт, зависит от степени загрязненности исследуемого ма¬териала.
4. Приготовив разведение, приступают к разливке засе¬янного агара в стерильные чашки Петри (для того чтобы агар распределился равномерно, а не застыл комками, ре¬комендуется предварительно согреть чашки в термостате или же слегка нагреть над пламенем горелки): берут про¬бирки по порядку, открывают, обжигают край, выливают содержимое в чашку, открыв крышку лишь настолько, что¬бы в щель вошло устье пробирки.
|
|
|
Скачать 154.95 Kb.