биохимия экзамен. 1. Белки элементный и аминокислотный состав. Физиологическая роль белков. Первичная структура белков и ее информационная роль. Конформация белка этапы формирования, особенности влияния условий среды. Конформационная лабильность белков
 Скачать 6.55 Mb.
|
|
1.Белки: элементный и аминокислотный состав. Физиологическая роль белков. Первичная структура белков и ее информационная роль. Конформация белка: этапы формирования, особенности влияния условий среды. Конформационная лабильность белков. Белки: элементный и аминокислотный состав Белки- это полимеры, мономерами которых являются АМКы (аминокислоты).Если кол-во АМК не превышает 10, то такое соед. называется пептид; если от 10 до 40 АМК – полипептид, если более 40 АМК – белок,имеющий опред компактную пространственную структуру, так как длинная полипептидная цепь является энергетически невыгодным состоянием.В состав белков входят углерод, водород, азот, кислород, сера. Часть белков может содержать фосфор, железо, цинк, медь. Белки имеют N конец и C конец (свободные). АМК по строению являются органическими карбоновыми кислотами, у которых, как минимум, один атом водорода замещен на аминогруппу. Аминокислотный состав белков. Белки- непереодические полимеры, мономерами которых являются альфа-аминокислот.( 20 аминокислот. АМК по строению являются органическими карбоновыми кислотами, у которых, как минимум, один атом водорода замещен на аминогруппу. Среди многообразия АМК только 20 участвует во внутриклеточном синтезе белков (протеиногенные АМК). Они являются α-АМК. Различают: -заменимые – могут синтезироваться в организме человека и других животных. -незаменимые – не могут синтезироватся в организме другого человека, должны поступать в организм человека вместе с пищей. (лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, триптофан, треонин, лизин, метионин) Так же в зависимости от аминокислотного состава белки разлиают: -полноценные – содержат весь набор аминокислот -неполноценные – какие-то аминокислоты в их составе отсутвуют. Если белки состоят только из аминокислот, их называют простыми. Если белки помимо аминокислот содержа простетическую группу( небелковый комплекс связаный с белком), их называют сложными. Все аминокислоты содержат: 1) Карбоксильную группу (-COOH) 2) Аминогруппу ( -NH2) 3) Радикал или R ( остальная часть молекулы). В зависимости от количества аминогрупп и карбоксильных групп, входящих в состав аминокислот, различают: -Нейтральные аминокислоты – 1 карбоксильная и аминогруппа. -Основные аминокислоты – имеют более одной аминогруппы(лизин, аргинин, гистидин, также глутамин, аспарагин) - Кислые аминокислоты имеют – более одной карбоксильной группы. (аспарагиновая и глутаминовая кислоты) Аминокислоты являются амфотерными соединениями, в водных растворах существуют в разных ионных формах. Выделяют: - алифатические (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, глицин) -ароматические (фенилаланин, тирозин, триптофан),серосодержащие (цистеин, метионин) Пептидная связь. Пептиды – органические вещества, состоящие из остатков аминокислот, соединенных пептидной связью. Образование пептидов происходит в результате реакции конденсации аминокислот. При взаимодействии аминогруппы одной аминокислоты с карбоксильной группой другой аминокислоты между ними возникает ковалентная азот-углеродная связь, которая и называется пептидной. Различают : дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т.д. Физиологическая роль белков. Белки являются структурными элементами клеток; служат материалом для образования ферментов, гормонов и др.; влияют на усвояемость жиров, углеводов, витаминов, минеральных веществ и т. д. Ежесекундно в нашем организме отмирают миллионы клеток и для восстановления их взрослому человеку требуется 80—100 г белка в сутки, причем заменить его другими веществами невозможно. Первичная структура белков и ее информационная роль. Первичная структура (линейная последовательность АМК в пептидной цепи) закодирована в молекуле ДНК и реализуется в ходе транскрипции и трансляции. Все белки имеют уникальную для данного белка структуру. Последовательность АМК остатков в пептидной цепи – форма записи некоторой информации, которая диктует пространственную укладку длинной линейной цепи в более компактную структуру или конформацию. Замена всего лишь одной АМК на др в полипептидной цепочке приводит к изм свойств и функций белка. Именно первичная структура белковой молекулы определяет свойства молекулы белка и ее пространственную конфигурацию. Например, замена в β-субъединице гемоглобина шестой глутаминовой АМК на валин приводит к тому, что молекула гемоглобина в целом не может выполнять свою основную функцию — транспорт кислорода; в таких случаях у человека развивается заболевание — серповидноклеточная анемия. Конформация белка: этапы формирования, особенности влияния условий среды. Вторичная структура – упорядоченное свёртывание полипептидной цепи в спираль ( имеет вид растянутой пружины). Обусловлена способностью групп пептидной связи к водородным взаимодействиям: C==O…NH. Известны несколько способов укладки полипептидной цепи в пространстве: 1) альфа-спираль–образуется внутрицепочечными водородными связями мужду NH –группой одного остатка аминокислоты и CO- группой четвертого от неё остатка. 2) бэта- структура ( складчатый лист) – формируется водородными связями между пептидными группами полипептидных цепей, расположенных параллельно или антипараллельно, или связями между участками одной полипептидной цепи образуя складки. 3) беспорядочный клубок – это участки, не имеющие правильной переодической пространственной организации. Содержание альфа- спиралей и бэта-структур в разных белках различно: у фибриллярных – либо то либо то ; у глобулярных – одни фрагменты в виде спирали другие в виде складчатого листа, либо беспорядочного клубка. Третичная структура белка – укладка полипептидных цепей в глобулы, возникающая в результате возникновения химических всязей ( водородных, ионных, дисульфидных) и установления гидрофобных взаимодействий между радикалами аминокислотных остатков. Конформационная лабильность белков — это способность белков к небольшим изменениям кон-формации за счет разрыва одних и образования других слабых связей. В водных растворах гидрофобные радикалы стремятся спрятаться от воды, группируясь внутри глобулы, гидрофильные наоборот. 1) Электростатические силы – притяжение между R- группами , противоположно заряженные. 2) Водородные связи между полярными ( гидрофильными) R- группами. 3) Гидрофобные взаимодействия –между неполярными ( гидрофобными ) R- группами. 4) Дисульфидные связи – между радикалами двух молекул цистеина. ( ковалентные) 2.Формирование активного центра и его взаимодействие с лигандом как основа функционирования белков. Четвертичная структура белков. Кооперативные изменения конформации протомеров. Строение и функции олигомерных белков на примере гемоглобина в сравнении с миоглобином. Активный центр белков - определённый участок белковой молекулы, как правило, находящийся в её углублении ("кармане"), сформированный радикалами аминокислот, собранных на определённом пространственном участке при формировании третичной структуры и способный комплементарно связываться с лигандом. В линейной последовательности полипептидной цепи радикалы, формирующие активный центр, могут находиться на значительном расстоянии друг от друга. Высокая специфичность связывания белка с лигандом обеспечивается комплементарностью структуры активного центра белка структуре лиганда Под комплементарностью понимают пространственное и химическое соответствие взаимодействующих молекул. Лиганд должен обладать способностью входить и пространственно совпадать с конформацией активного центра. Это совпадение может быть неполным, но благодаря конформационной лабильности белка активный центр способен к небольшим изменениям и "подгоняется" под лиганд. Кроме того, между функциональными группами лиганда и радикалами аминокислот, образующих активный центр, должны возникать связи, удерживающие лиганд в активном центре. Связи между лигандом и активным центром белка могут быть как нековалентными (ионными, водородными, гидрофобными), так и ковалентными. 1. Характеристика активного центра Активный центр белка - относительно изолированный от окружающей белок среды участок, сформированный аминокислотными остатками. В этом участке каждый остаток благодаря своему индивидуальному размеру и функциональным группам формирует "рельеф" активного центра. Формирование активного центра и его взаимодействие с лигандом как основа функционирования белков. Информация, записанная в линейной последовательности аминокислотных остатков пептидной цепи, воспроизводится в пространственную структуру. 1. Центр связывания белка с лигандом, или активный центр. На поверхности глобулы образуется участок, который может присоединять к себе другие молекулы, называемые лигандами. Центр связывания с лигандом, или активный центр, формируется из радикалов аминокислотных остатков, сближенных на уровне третичной структуры. В линейной пептидной цепи они могут находится на расстоянии, значительно удаленном друг от друга. 2. Белки проявляют высокую специфичность ( избирательность) при взаимодействии с лигандом. 3. Высокая специфичность взаимодействия белка с лигандом обеспечивается комплементарностью структуры активного центра структуре лиганда. Комплементарность – это пространственное и химическое соответствие взаимодействующих поверхностей. 4. В основе функционирования белков лежит их специфическое взаимодействие с лигандами. Доменная стурктура и ее роль в функционировании белков 1. Длинные полипептидные цепи часто складываются в несколько компактных, относительно независимых областей. Они имеют самостоятельную третичную структуру, напоминающую таковую глобулярных белков, и называются доменами. Благодаря доменной структуре белков легче формируется их трёхмерная структура. 2. Центры связывания белка с лигандом часто располагаются между доменами ( например, центр связывания трипсина с его лигандом – пищевым белком) разные домены в белке могут перемещаться относительно друг друга при взаимодействии с лигандом ( например, молекуле гексокиназы) 3. Лигандами, взаимодействующими с трехмерной структурой пептидной цепи, могут быть не только низкомолекулярные органические и неорганические молекулы но и макромолекулы – ДНК, РНК, полисахариды, белки. В этих случаях белок узнает определенный участок лиганда, соразмерный и комплементарный центру связывания. Четвертичная структура белков. Кооперативные изменения конформации протомеров. Строение и функции олигомерных белков на примере гемоглобина в сравнении с миоглобином. Четвертичная структура характерная для сложных белков, молекулы которых образованы двумя и более глобулами. Субъединицы удерживаются в молекуле благодаря ионным, гидрофобным и электростатическим взаимодействиям. Иногда при образовании четвертичной структуры между субъединицами возникают дисульфидные связи. Наиболее изученным белком имеющим четвертичную структуру, является гемоглобин. Он образован двумя альфа-субединицами ( 141 аминокислотный остаток) и двумя бэта-субъединицами ( 146 аминокислотный остаток). С каждой субъединицей связяна молегула гема, содержащая железо. Олигомерные белки обладают особыми свойствами, которых нет у белков, не имеющиих четвертичной структуры. Это можно увидеть, стравнивая белок мышц миоглобин и белок эритроцитов гемоглобин. Вторичная и третичная структура миоглобина и протомеров гемоглобина очень сходны. Оба эти белка являются гемопротеинами и выполняют в организме сходные функции в основе которых лежит способность обратимо связывать кислород. Простетическая группа этих белков – гем- представляет собой плоскую молекулу, содержащую четыре пиррольных цикла и соединенный с ними атом железа. Пептидная цепь миоглобина содержит 153 аминокислотных остатка. Из них примерно три четверти образуют восемь спиральных участков, обозначаемых латинскими буквами от А до Н. Плоская молекула гема расположена в углублённом между спиралями Е и F. Гем соединяется с белковой частью ( глобином) гидрофобными связями между пиррольными циклами и гидрофобными радикалами аминокислот. Атом железа в молекуле гема образует шесть координационных связей; четыре с атомами азота пиррольных колец гема, одну с атомами азота имидазольного кольца гистидина, расоложенного в спирали F ( проксимальный гистидин), и еще одну – с молекулой 02. Спираль Е содержит так же остаток гистидина, не связанный с гемом (дистальный гистидин), но способствующий присоединению кислорода к иону железа. Пиррольные кольца гема расположены в одной плоскости, в то время как атом железа в дезоксигемоглобине несколько выступает из этой плоскости ( на 0,6 ангстрема). Присоединение кислорода «выпрямляет» молекулу гема: железо перемещается в плоскость пиррольных колец. Поскольку железо связано с остатком проксимального гистидина пептидной цепи, то происходит и перемещение участка пептидной цепи, разрыв некоторых слабых связей в молекуле белка, т.е. несколько изменяется конформация белка. Таким образом, присоединение кислорода сопровождается изменением пространственной структуры. В этом отношении миоглобин и гемоглобин одинаковы, но следствия изменения их конформации различны. 3. Гидролиз белков (кислотный, щелочной, ферментативный, полный и частичный). Качественное обнаружение белков с помощью цветных реакций (биуретовой, нингидриновой). Хроматографические методы изучения аминокислотного состава гидролизатов белков. Гидролиз – распад сложного вещества на более простые составные части,связанный с присоединением воды по месту разрыва связей. В зависимости от применяемого катализатора различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При гидролизе простого белка конечными продуктами являются только аминокислоты. В организме гидролиз белка постоянно происходит в процессе, как пищеварения, так и жизнедеятельности клеток под действием протеолитических ферментов. Амидные связи способны гидролизоваться как в кислой, так и щелочной среде. Пептиды и белки гидролизуются с образованием либо более коротких цепей - это так называемый частичный гидролиз, либо смеси аминокислот (в ионной форме) - полный гидролиз. При кислотном гидролизе белка разрушаются некоторые аминокислоты:триптофан подвергается полному разрушению, а серин, треонин, цистин,тирозин, фенилаланин – частичному. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик. При кислотном гидролизе белки распадаются сначала на высокомолекулярные пептиды, затем на низкомолекулярные пептиды, дипептиды и, наконец, на аминокислоты.Полный гидролиз белка протекает при многочасовом кипячении раствора в круглодонной колбе с воздушным холодильнике в присутствии соляной или серной кислоты. При щелочном гидролизе белка отмечается более сильное разрушение аминокислот. Гидролизаты белка применяются в качестве лечебных препаратов.При щелочном гидролизе происходит рацемизация большинства аминокислот и полное разрушение аргинина, лизина, цистина и цистеина. В результате такого гидролиза образуется комплекс дефектных, чуждых организму компонентов. Ферментативный гидролиз важен тем, что протекает селективно, т.е. позволяет расщеплять строго определенные участки пептидной цепи. При медленном, осторожном ферментативном гидролизе белков получаются промежуточные продукты, которые удалось выделить. Это пептоны и полипептиды. Пептоны – это сложно построенные вещества, по ряду свойств еще близкие к белкам, но обладающие уже гораздо меньшим молекулярным весом. Пептоны представляют собой смеси высокомолекулярных продуктов расщепления белков, подобно тому как декстрины представляют собой высокомолекулярные промежуточные продукты гидролиза высшего полисахарида – крахмала. Полипептиды – цепи из многих остатков аминокислот, соединенных пептидной связью. Среди продуктов осторожного гидролиза удалось выделить дипептиды, трипептиды и полипептиды. Которые представляют собой части белковой молекулы, оставшиеся при мягких условиях еще не гидролизованными.  РЕАКЦИЯ ПИОТРОВСКОГО (БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ) Биуретовая реакция – это качественная реакция на обнаружение белков с фиолетовым окрашиванием при действии солей меди (II) (медного купороса) в щелочном растворе. Белок + CuSO4 + NaOH -----> красно-фиолетовое окрашивание. РЕАКЦИЯ РУЭМАННА (НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ) a-Аминокислоты реагируют с нингидрином, образуя сине-фиолетовый комплекс (пурпур Руэманна), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты. Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a-аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции. Хроматографические методы изучения аминокислотного состава гидролизатов белков Бумажная хроматография. Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и три-пептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов. Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой, которая движется вдоль листа вверх или вниз. В качестве подвижной фазы используется смесь бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с различной скоростью и легко могут быть разделены. По окончании хроматографии бумагу высушивают и обрабатывают проявителем (0,5% раствор нингидрина в смеси ацетон-ледяная уксусная кислота-вода) и нагревают в течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Тонкослойная хроматография. Для разделения и определения аминокислот может быть также использована тонкослойная хроматография. ТСХ, как известно, существует в двух вариантах. Распределительная ТСХ сходна с распределительной на бумаге и адсорбционная ТСХ, основана совершенно на других принципах. При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге. Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте. Например, на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. Для разделения аминокислот используют РТСХ, которая позволяет достаточно быстро разделять и определять 22 аминокислоты белковых гидролизатов. Аминокислоты в белковом гидролизате могут быть определены также методом газовой хроматографии, но перед хроматографическим анализом аминокислоты как правило переводят в летучие соединения. Ионообменная хроматография основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов, находящихся в растворе, на ионы, входящие в состав ионообменника (катионита, анионита) и на различной способности разделяемых ионов к ионному обмену с фиксированными ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп. Для органических ионов на электростатическое взаимодействие с фиксированными зарядами ионита накладывается гидрофобное взаимодействие органической части иона с матрицей ионита. Чтобы уменьшить его вклад в удерживание органических ионов и добиться оптимальной селективности их разделения, к водному элюенту добавляют органический компонент (1–25% метанола, изопропанола, ацетонитрила). 4. Физико-химические свойства белков. Молекулярный вес, размеры и форма молекул. Растворимость, ионизация, гидратация. Белки как амфотерные электролиты. Механизм возникновения электрическогозаряда у белковой молекулы. Факторы, определяющие величину и знак заряда.Понятие изоэлектрической точки белков. Физико-химические свойства белков. Молекулярный вес, размеры и форма молекул. Растворимость, ионизация, гидратация Физико-химические свойства белков: - высокая вязкость растворов; - незначительная диффузия; - способность к набуханию в больших пределах; -оптическая активность; -подвижность в электрическом поле; - низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление; - способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм. Белки как и аминокислоты амфотерны. В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут или отрицательный или положительный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза. Так же они обладают ярко-выраженными гидрофильными свойствами. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемую искусственную мембрану ( целлофан, пергамент) Различия белков по форме молекул Глобулярный и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы спрятаны в гидрофобное ядро, растворяются в воде. Фибриллярные белки имеют вытянутую нитевидную структуру,не растворяются в воде. Различия белков по молекулярной массе Белки – ВМС от 6000 до 1 000 000 и вышею Молекулярная масса белка зависит от количества аминокисотных остатков в полипетидной цепи, а для олигомерных белков – и от количества входящих в него протомеров ( субъединиц) Ионизация или суммарный заряд белков Благодаря наличию в своем составе свободных амино- и карбоксильных групп белки являются полиэлектролитами (амфотерными электролитами). Белки в растворах находятся преимущественно в виде биполярных ионов (цвиттерионов, амфионов). При этом свободные карбоксильные группы белков оказываются диссоциированными (_-СОО-), а свободные аминогруппы оказываются протонироваными (-NН3+). Таким образом, ионизация белков является следствием диссоциации свободных карбоксильных групп и протонирования свободных аминогрупп. В свою очередь степень ионизации зависит от рН среды Гидратация Большинство глобулярных белков относятся к гидрофильным веществам, хорошо растворяющимся в воде. Это свойство обусловлено расположенными на поверхности белка группами, способными гидратироваться. Под гидратацией понимается связывание диполей воды с ионными и полярными группами белка, такими как -СОО` , -NН3+, -СОNH2, -OH, -SH , в результате чего образуется гидратная оболочка белков (рис. 1.3). Благодаря этому каждая молекула белка покрывается несколькими молекулярными слоями воды, т.е. одна молекула белка отделена от другой слоем воды и находится в состоянии истинного раствора. Растворимость Зависит от всех перечисленных свойств, определяется составом растворителя и наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать выпадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков. При изучении химического состава белка было установлено, что в его молекуле имеются свободные аминные (NH2) и карбоксильные (СООН) группы, которые в растворе находятся в виде NH3 и СООН. Следовательно, белки в растворе обладают амфотерными свойствами (амфолит, амфион). При пропускании электрического тока белки будут передвигаться в зависимости от заряда белковой молекулы к катоду или аноду. Белки как амфотерные электролиты. Механизм возникновения электрического заряда у белковой молекулы. Факторы, определяющие величину и знак заряда. Понятие изоэлектрической точки белков. При изучении химического состава белка было установлено, что в его молекуле имеются свободные аминные (NH2) и карбоксильные (СООН) группы, которые в растворе находятся в виде NH3 и СООН. Следовательно, белки в растворе обладают амфотерными свойствами (амфолит, амфион). При пропускании электрического тока белки будут передвигаться в зависимости от заряда белковой молекулы к катоду или аноду.  Таким образом, фактором, определяющим поведение белка как аниона или катиона, является концентрация водородных ионов, или значение рН среды. При повышении концентрации водородных ионов (среда кислая - рН 0-7) белок становится катионом, при ее понижении (среда щелочная- рН 7 -14), наоборот, белковые частицы становятся анионами. Такая способность белка проявлять или кислотные, или щелочные свойства характеризует его как амфотерное соединение. Однако при определенных значениях рН число положительных зарядов белка будет равно числу отрицательных и заряд молекулы в целом будет практически равен нулю. Белковая молекула не будет перемещаться в электрическом поле. При этих условиях белок находится в изоэлектрическом состоянии; рН раствора, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой. Изоэлектрическая точка большинства природных белков лежит в слабокислой среде (рН 4,8-5,4). Молекула таких белков содержит больше карбоксильных групп, чем аминных. Это свидетельствует о том, что в их составе содержится больше дикарбоновых аминокислот. В изоэлектрической точке белок находится в наименее устойчивом состоянии и при незначительных изменениях рН среды в кислую или щелочную сторону он легко выпадает в осадок. Амфотерность белков лежит в основе белковой буферной системы, которая участвует в поддержании определенной реакции среды крови. Амфотерные свойства белков используются для разделения их на отдельные фракции (метод электрофореза) с целью диагностики различных заболеваний и контроля за состоянием больного. 5. Обратимое осаждение белков — высаливание; механизм и факторы, вызывающие процесс. Лабильность пространственной структуры белков и их денатурация. Факторы, вызывающие денатурацию. Шапероны — класс белков, защищающих другие белкиот денатурации в условиях клетки и облегчающих формирование их нативнойструктуры. Обратимое осаждение белков — высаливание; механизм и факторы, вызывающие процесс. Обратимое осаждение – при этом процессе под воздействием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание. Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором - глобулиновая фракция. Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка. Реактивы: 1) неразведенный яичный белок; 2) насыщенный раствор сульфата аммония; 3) NaOH, 10% раствор, 4) CuSO4, 1% раствор; 5) дистиллированная вода; 6) сульфат аммония в порошке. Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок - глобулины. Лабильность пространственной структуры белков и их денатурация. Факторы, вызывающие денатурацию. Шапероны — класс белков, защищающих другие белкиот денатурации в условиях клетки и облегчающих формирование их нативнойструктуры. Лабильность белка - склонность к небольшим изменениям конформации за счет разрыва одних и образовании других слабых связей. Конформация белка может меняться при изменении химических и физических свойств среды, а также при взаимодействии белка с другими молекулами. При этом происходит изменение пространственной структуры не только участка, контактирующего с другой молекулой, но и конформация в целом. Денатурация - потеря нативной конформации белка с утратой специфической функции белка. Это происходит когда рвутся многочисленные, но слабые связи в молекуле белка под воздействие различных факторов. ОДНАКО! При денатурации не происходит разрыва пептидных связей, первичная структура БУДЕТ... ЖИТЬ... Самые распространённые факторы денатурации: 1. Высокая температура, более 50 градусов по Цельсию. Увеличивается тепловое движение, связи рвутся. 2. Интенсивное стряхивание раствора, когда происходит контакт с воздушной средой и происходит изменение конфомации молекул. 3. Органические вещества (этиловый спирт, фенол и др.) спсобные взаимодействовать с функциональными группами аминокислот, что приводит, догадайтесь, правильно!, к изменению конформации. 3. Кислоты и щелочи, изменением рН среды приводят к перераспределению связей в белке. 4. Соли ТЯЖЁЛЫХ металлов, образуют прочные связи с функциональными группами, меняя активность и конформацию. 5. Детергенты (мыло) - содержащие гидрофобный углеводородный радикал и гидрофильную функц. группу. Гидрофобные участки белка и детергента находят друг друга в сложном мире раствора и изменяют конформацию белка, однако не оседают, так как их поддерживают на плаву гидрофильные участки детергента. Шапероны – класс белков, защищающий другие белки от денатурации в условиях клетки и облегчающий формирование их нативной конформации. Шапероны - белки, способные связываться с другими белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны обеспечить их конформацию, обеспечивая фолдинг белков. Среди шаперонов различают: 1. Конститутивные, их количество постоянно в клетке, вне зависимости от внешнего воздействия на неё. 2. Индуцибильные, белки теплового шока, быстрый синтез которых отмечают практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрессовым воздействиям. Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к белкам, на поверхности которых есть элементы, характерные для несвёрнутых молекул. Попадая в полость шаперонового комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участков Ш-60. В специфической среде этой полости, в перебор возможных конформации белка, пока не будет найдена единственная, энергетическая наиболее выгодная конформация. 6. Методы выделения индивидуальных белков: гель-фильтрация, ионообменная, аффинная хроматография. Методы очистки белков от низкомолекулярных примесей (диализ, ультрафильтрация). Применение. Гель фильтрация. Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов . Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля (помечены красным цветом), будут перемещаться с высокой скоростью. Средние (зеленого цвета) и небольшие белки (синего цвета) будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля . На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций . Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной масс. Ионообменная хроматография. Метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нем в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники – полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Различают положительно заряженные анионообменники и отрицательно заряженные катионообменники. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одно из которых находится искомый белок. Аффинная хроматография Это наиболее специфичные метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными ( иммобилизованными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, приспускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв ее раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Данная хроматография отличается высокой избирательностью помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз. Диализ Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе. Ультрафильтрация Ультрафильтрация это процесс мембранного разделения растворов высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений, а также концентрирования и фракционирования высокомолекулярных соединений. Процесс протекает за счет разности давлений до и после мембраны В отличие от обратного осмоса, ультрафильтрацию применяют для разделения систем, в которых молекулярная масса растворенных компонентов намного больше молекулярной массы растворителя. Например, для водных растворов содержащих органические соединения с молекулярной массой 500 и более. Поскольку осмотические давления высокомолекулярных веществ малы (обычно не более десятых долей МПа), в процессе расчетеовдвижущей силы процесса ультрафильтрации ими, как правило, можно пренебречь. Поэтому ультрафильтрацию проводят при сравнительно невысоких давлениях (0,2 - 1,0 МПа). 7. Химическая природа ферментов. Изоферменты (на примере ЛДГ и МДГ).Проферменты (зимогены). Мультиферментные комплексы. Структурно-функциональная организация ферментных белков: активный центр, егосвойства. Контактный и каталитический участки активного центра ферментов.Кофакторы ферментов: химическая природа, классификация, роль в биологическомкатализе. Роль витаминов в построении кофакторов. Коферменты и простетические группы Основу жизнедеятельности любого организма составляют химические процессы. Практически все реакции в живом организме протекают с участием природных биокатализаторов, называемых ферментами или энзимами. Ферменты - это белки, которые действуют как катализаторы в биологических системах. Являясь веществами белкой природы, ферменты обладают всеми свойствами белков: Изоферменты – это множественные формы одного фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающие по физическим и химическим свойствам (сродству к субстрату, максимальной скорости катализируемой реакции, электрофоретической подвижности, разной чувствительности к ингибиторам и активаторам, оптимуму рН и термостабильности). Изоферменты имеют четвертичную структуру, которая образована четным количеством субъединиц (2, 4, 6 и т.д.). Изоформы фермента образуются в результате различных комбинаций субъединиц. В качестве примера можно рассмотреть лактатдегидрогеназу (ЛДГ), фермент, который катализирует обратимую реакцию: НАДН2 НАД+ пируват ←ЛДГ→ лактат ЛДГ существует в виде 5 изоформ, каждая из которых состоит из 4-х протомеров (субъединиц) 2 типов М (muscle) и Н (heart). Синтез протомеров М и Н типа кодируется двумя разными генетическими локусами. Изоферменты ЛДГ различаются на уровне четвертичной структуры: ЛДГ1 (НННН), ЛДГ2 (ННМ), ЛДГ3 (ННММ), ЛДГ4 (НМММ), ЛДГ5 (ММММ). Полипептидные цепи Н и М типа имеют одинаковую молекулярную массу, но в составе первых преобладают карбоновые аминокислоты, последних – диаминокислоты, поэтому они несут разный заряд и могут быть разделены методом электрофореза. Кислородный обмен в тканях влияет на изоферментный состав ЛДГ. Где доминирует аэробный обмен, там преобладают ЛДГ1, ЛДГ2 (миокард, надпочечники), где анаэробный обмен - ЛДГ4, ЛДГ5 (скелетная мускулатура, печень). В процессе индивидуального развития организма в тканях происходит изменение содержания кислорода и изоформ ЛДГ. У зародыша преобладают ЛДГ4, ЛДГ5. После рождения в некоторых тканях происходит увеличение содержания ЛДГ1, ЛДГ2. Существование изоформ повышает адаптационную возможность тканей, органов, организма в целом к меняющимся условиям. По изменению изоферментного состава оценивают метаболическое состояние органов и тканей. Проферментами (или зимогенами) называют неактивную форму фермента. Механизм превращениянеактивной формы в активную различен. Ферменты, у которых активная группа связана пара-лизатором (ингибитором), активируется при отщеплении его (например, неактивный пепсиноген или трипсиноген превращаются в активные пепсин и трипсин после отщепления от каждого из них ингибитора полипептидной природы). Ферменты, у которых неактивной является окисленная форма Мультиферментные компексы. Мультиферментные комплексы это надмолекулярные образования которые включают, несколько ферментов и коферментов. Они катализируют последовательные этапы реакции преобразования одного субстрата. Примером мультиферментов являются реакции окисли тельного декарбоксилирования αкетокислот (пирувата и αкетоглутарата) под влиянием пи руватдегидрогеназы и αкетоглутаратдегидрогеназы. Строение ферментов Метаболит - вещество, которое участвует в метаболических процессах. Субстрат – вещество, которое вступает в химическую реакцию. Продукт – вещество, которое образуется в ходе химической реакции. Ферменты характеризуются наличием специфических центров катализа. Активный центр (Ац) – это часть молекулы фермента, которая специфически взаимодействует с субстратом и принимает непосредственное участие в катализе. Ац, как правило, находиться в нише (кармане). В Ац можно выделить два участка: участок связывания субстрата – субстратный участок (контактная площадка) и собственно каталитический центр. Большинство субстратов образует, по меньшей мере, три связи с ферментом, благодаря чему молекула субстрата присоединяется к активному центру единственно возможным способом, что обеспечивает субстратную специфичность фермента. Каталитический центр обеспечивает выбор пути химического превращения и каталитическую специфичность фермента. У группы регуляторных ферментов есть аллостерические центры, которые находятся за пределами активного центра. К аллостерическому центру могут присоединяться “+” или “–“ модуляторы, регулирующие активность ферментов. Различают ферменты простые, состоят только из аминокислот, и сложные, включают также низкомолекулярные органические соединения небелковой природы (коферменты) и (или) ионы металлов (кофакторы). Кофакторы ферментов – это ионы металлов, необходимые для проявления каталитической активности многих ферментов. В качестве кофакторов выступают ионы калия, магния, кальция, цинка, меди, железа и т.д. Их роль разнообразна, они стабилизируют молекулы субстрата, активный центр фермента, его третичную и четвертичную структуру, обеспечивают связывание субстрата и катализ. Например, АТФ присоединяется к киназам только вместе с Mg2+. Коферменты – это органические вещества небелковой природы, принимающие участие в катализе в составе каталитического участка активного центра. В этом случае белковую составляющую называют апоферментом, а каталитически активную форму сложного белка – холоферментом. Таким образом: холофермент = апофермент + кофермент. В качестве коферментов функционируют: гемы, нуклеотиды, коэнзим Q, ФАФС, SAM, Глутатион производные водорастворимых витаминов:
Кофермент, который присоединен к белковой части ковалентными связями называется простетической группой. Это, например, FAD, FMN, биотин, липоевая кислота. Простетическая группа не отделяется от белковой части. Кофермент, который присоединен к белковой части нековалентными связями называется косубстрат. Это, например, НАД+, НАДФ+. Косубстрат присоединяется к ферменту в момент реакции. 8. Общие свойства ферментов: зависимость активности ферментов от реакции среды и температуры; биологическое и медицинское значение этих свойств ферментов.Специфичность действия ферментов. Виды специфичности. Биологическоезначение специфичности действия ферментов Являясь веществами белкой природы, ферменты обладают всеми свойствами белков: являются амфотерными соединениями; вступают в те же качественные реакции, что и белки (биуретовую, ксантопротеиновую, фолина и др.); подобно белкам растворяются в воде с образованием коллоидных растворов; обладают электрофоретической активностью; гидролизуются до аминокислот; склонны к денатурации под влиянием тех же факторов: температуры, изменениях рН, действием солей тяжелых металлов, действием физических факторов (ультразвук, ионизирующее излучение и др.); имеют несколько уровней организации макромолекул, что подтверждено данными рентгеноструктурного анализа, ЯМР, ЭПР. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры среды - С повышением температуры ускоряется движение молекул, что приводит к повышению вероятности взаимодействия реагирующих веществ. Например, Taq-полимераза, выделенная из микроорганизмов, живущих в горячих источниках, не инактивируется при повышении температуры до 95 °С. Этот фермент используют в научно-практической медицине для молекулярной диагностики заболеваний с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды- Отклонение от оптимального значения рН приводит к понижению ферментативной активности. Биологическая роль ферментов заключается в том, что они катализируют контролируемое протекание всех метаболических процессов в организме. Ферменты, работающие в кислых условиях среды (например, пепсин в желудке или лизосомальные ферменты), эволюционно приобретают конформацию, обеспечивающую работу фермента при кислых значениях рН. Специфическая регуляция. Под действием специфических активаторов и ингибиторов изменяется активность определенных регуляторных ферментов, которые контролируют интенсивность метаболических процессов в организме. Механизмы специфической регуляции каталитической активности ферментов: 1). Аллостерическая регуляция; 2). Регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий; 3). Регуляция через ковалентную модификацию. а). Регуляция путем фосфорилирования/дефосфорилирования фермента; б). Регуляция частичным протеолизом. 1). Аллостерическая регуляция каталитической активности ферментов Аллостерическими ферментами называют ферменты, активность которых регулируется обратимым нековалентным присоединением модулятора (активатора и ингибитора) к аллостерическому центру. Аллостерические ферменты являются олигомерными белками или имеют доменное строение. Эти ферменты играют важную роль в регуляции т.к. чрезвычайно быстро реагируют на изменения среды. Ингибиторами аллостерических ферментов часто являются конечные продукты метаболических путей, активаторами – их начальные субстраты. Активирование происходит по принципу прямой положительной связи, а ингибирование - по принципу отрицательной обратной связи.  Например, конечный продукт катаболизма глюкозы АТФ ингибирует аллостерически ферменты гликолиза фосфофруктокиназу и пируваткиназу. Накапливаемая в гликолизе фруктоза-1,6-ф активирует пируваткиназу, что ускоряет реакции гликолиза. 2). Регуляция каталитической активности ферментов с помощью белок-белковых взаимодействий. Выделяют 2 механизма: а). Активация ферментов в результате присоединения регуляторных белков. Например, аденилатциклаза (Ац), которая катализирует превращение АТФ в цАМФ, активируется присоединением α-субъединицы G-белка. Этот механизм регуляции обратим. б). Регуляция каталитической активности ферментов ассоциацией/диссоциацией протомеров. Например, протеинкиназа А, активируется при диссоциации ее тетрамера на 4 субъединицы и инактивируется при обратном соединении 4 субъединиц в тетрамер. 3). Регуляция каталитической активности ферментов путем их ковалентной модификации. Регуляция активности фермента осуществляется в результате ковалентного присоединения или отщепления от него фрагмента. Она бывает 2 видов: 1). путем фосфорилирования и дефосфорилирования ферментов; 2). путем их частичного протеолиза. а). Регуляция каталитической активности ферментов путем их фосфорилирования и дефосфорилирования. Фосфорилирование осуществляется протеинкиназами (ПК) по ОН-группе серина, треонина и тирозина регуляторный белков и ферментов. Дефосфорилирование в этих же положениях осуществляется фосфопротеинфосфатазами (ФПФ). Введение отрицательно заряженной фосфорной группы приводит к обратимому изменению конформации и активности фермента.  Например, под действием глюкагона и адреналина в клетках печени происходит фосфорилирование ключевых ферментов гликогенеза (гликогенсинтаза) и гликогенолиза (гликогенфосфорилаза), при этом распад гликогена активируется, а синтез ингибируется. Инсулин наоборот вызывает в клетках печени дефосфорилирование тех же ключевых ферментов, в результате синтез гликогена активируется, а распад ингибируется. б). Регуляция каталитической активности ферментов путем их частичного протеолиза. При участии активаторов и протеолитических ферментов происходит отщепление части молекулы фермента и его необратимая активация. Эти ферменты функционируют короткий период, а затем разрушаются. Характерно для внеклеточных ферментов ЖКТ (пепсин, трипсин, химотрипсин и др.) и ферментов свертывающей и противосвертывающей системы крови (тромбин, фибрин, плазмин др.). Например, трипсиноген, синтезируемый в поджелудочной железе, поступает в двенадцатиперстную кишку, где энтеропептидаза кишечника отщепляет у него с N-конца гексапептид. В результате в оставшейся части молекулы фермента формируется активный центр.  9.Регуляторные (аллостерические) центры ферментов. Аллостерические модуляторы ферментов. Зависимость активности ферментов от конформации белков. Механизм действия ферментов. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата и фермента. Константа Михаэлиса. Номенклатура и классификация ферментов. Аллостерический центр представляет собой участок молекулы фермента, в результате присоединения к которому какого-то низкомолекулярного вещества изменяется третичная структура белковой молекулы фермента, что влечет за собой изменение его активности. Аллостерический центр является регуляторным центром фермента. Аллостерические модуляторы Аллостерические модуляторы, связываясь с аллостерическим центром GPCR, меняют его сродство к сигнальным молекулам (+ или -). В настоящее время идет разработка лекарственных средств, которые способны аллостерически менять активность GPCR. Механизм действия ферментов. Действие ферментов заключается в образовании комплекса с молекулой субстрата, которое представляет собой обратимый процесс. Комплекс фермент-субстрат соответствует промежуточному соединению или переходному состоянию в теории промежуточных соединений. Затем этот комплекс распадается и регенерирует фермент. Этот процесс описывается уравнением E + S = ES = E + P где E-фермент, S-субстрат, ES-комплекс, a P-продукт реакции, оно получило название уравнения Михаэлиса - Мептен.  Зависимость скорости ферментативной реакции он концентрации субстрата. Если концентрацию ферментов оставить постоянной, изменяя только количество субстрата, то график скорости ферментативной реакции описывают гиперболой.( рис 1) При увеличении количества субстрата начальная скорость возрастает. Когда фермент становится полностью насыщенным субстратом, т.е. происходит максимально возможное при данной концентрации фермента формирование фермент-субстратного комплекса, наблюдают наибольшую скорость образования продукта. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению образования продукта, т.е. скорость реакции не возрастает. Данное состояние соответствует максимальной скорости реакции Vmax. Таким образом, концентрация фермента - лимитирующий фактор в образовании продукта. Это наблюдение легло в основу ферментативной кинетики, разработанной учёными Л. Михаэлисом и М. Ментен в 1913 г. Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:  где k1 - константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k-1 - константа скорости обратной реакции, распада фермент-субстратного комплекса; k2 - константа скорости образования продукта реакции. Следующее соотношение констант скоростей (k-1 + k2)/k1 называют константой Михаэлиса и обозначают Кm. Скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса ES, a скорость образования ES зависит от концентрации субстрата и концентрации свободного фермента. На концентрацию ES влияет скорость формирования и распада ES. Наибольшая скорость реакции наблюдается в том случае, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом, т.е. в фермент-субстратном комплексе ES, т.е. [Е] = [ES]. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается следующим уравнением (математическое выведение этой формулы можно найти в пособиях по ферментативной кинетике): V =
Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен. В случае, когда скорость реакции равна половине максимальной, Km = [S] (рис. 2-19). Таким образом, константа Михаэлисачисленно равна концентрации субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости. Уравнение Михаэлиса-Ментен - основное уравнение ферментативной кинетики, описывающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.  Рис.1. Зависимость скорости реакции (V) от концентрации субстрата S. Vmax - максимальная скорость реакции при данной концентрации фермента в оптимальных условиях проведения реакции. Кm - константа Михаэлиса. |