Микробиология. 1. Химический состав бактериальной клетки
 Скачать 1.8 Mb.
|
|
Бактериологический метод исследования включает: 1. посев исследуемого материала в питательные среды 2. выделение чистой культуры 3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду). Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований: I этап (работа с нативным материалом) Цель: получение изолированных колоний 1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре 2. Подготовка материала к исследованию 3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний 4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов II этап Цель: получение и НАКОПЛЕНИЕ чистой культуры 1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний). 2. Микроскопическое изучение изолированных колоний 3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов). 4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях. III этап Цель: идентификация выделенной чистой культуры 1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается: * морфология и тинкториальные свойства * культуральные свойства (характер роста на питательных средах) * биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов) * серологические свойства (антигенные) * вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии) * патогенность для животных * фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам) * чувствительность к антибиотикам * другие индивидуальные свойства IV этап (Заключение) По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды. При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов. Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности. Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора. Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. ✓ Чистая культура - совокупность микробов одного вида или варианта, полученная из одного образца материала и содержащаяся в определенном объеме среды ✓ Колония (бактериальная) – обособленная совокупность бактерий - потомство одной клетки, накопленная на плотной питательной среде ✓ Клон – потомство одной клетки ✓ Штамм – чистая культура микроорганизмов, выделенная из определенного источника, обладающая однородными свойствами. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа. Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого: 1. закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют небольшое увеличение объектива (х8) Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная). Таблица 11. Схема изучения колоний № Признак Возможные характеристики колоний 1. Форма Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая 2. Величина, мм Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм) 3. Характер поверхности Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая 4. Цвет Бесцветные, окрашенные 5. Прозрачность Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные 6. Характер краев Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые 7. Внутренняя структура Гомогенная, зернистая, неоднородная 8. Консистенция Вязкая, слизистая, крошковидная 9. Эмульгирование в капле воды Хорошо, плохо 2. Передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: • характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), • структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии). Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для этого: 1. Из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. 2. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию). При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые культуры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. ✓ Чистые культуры. Микроорганизмы одного и того же вида, выращенные в искусственной среде in vitro («в пробирке») и являющиеся потомками одной бактериальной клетки. Своего рода изолированное скопление микроорганизмов, выведенное с помощью посева на питательных средах. ✓ Смешанные культуры. Сообщество бактерий разных видов, первоначально взятое из естественных источников (воздуха, воды, почвы) и культивированное (выращенное) в лабораторных условиях. Чистая культура используется: • в научных исследованиях; • при диагностике инфекционных заболеваний; • как исходный материал для производства вакцин, ферментов, антибиотиков, витаминов, гормонов и др.; • в промышленном производстве (молочнокислые закваски, пивные и обычные дрожжи и т.д.). Смешанная культура дает определение о поведении микробов «в естественной среде». То есть ученые получают возможность проследить за взаимодействием бактерий различного вида, появлением новых свойств, присущих микроорганизмам, только в «сожительстве» с другими видами. Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов: a) Механическое разобщение бактериальных клеток. 1. Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма. 2. Метод Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру. b) Методы основанные на использовании биологических св-в бактерий. 1. Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С). 2. Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО2(кампилобактер, геликобактер). 3. Метод обогащения. Исследуемый материал за¬севают на элективные питательные среды, способствую¬щие росту определенного вида микроорганизмов. c) Биологический метод – метод, основанный на способности бактерий размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных. Тактика изучения колоний. 1. Просмотр чашки первичного посева, отбор характерных для золотистых стафилококков изолированных колоний. Исследование отобранных изолированных колоний проводят по следующей схеме: Макроскопическое изучение колоний: • в проходящем свете (чашку держат дном к себе): а) форма (круглая, неправильная и т.д.); 6) величина (точечные - менее 1 мм, мелкие — 1-2 мм, средние — 2-4 мм, крупные — более 4 мм); в) прозрачность (прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные). • в отраженном свете (чашку держат горизонтально крышкой вверх): а) поверхность (гладкая, складчатая, радиально исчерченная, блестящая, матовая и т.д.); 6) рельеф (плоский, выпуклый и т.д.); в) цвет (бесцветные - грязно-белые относятся к бесцветным; пигментированные - указать цвет пигмента). Микроскопическое изучение колоний (х8): • чашку Петри кладут вверх дном на предметный столик микроскопа, слегка опускают конденсор и с помощью объектива х8 изучают: а) край колонии (ровный, волнистый, зубчатый и т.д.); б) структуру (гомогенная, зернистая и т.д.). Поскольку для посева использовался ЖСА, то отмечается образование радужного венчика, свидетельствующего о лецитиназной активности. На ЖСА стафилококк растет в виде круглых, диаметром 1-3 мм, непрозрачных, выпуклых, блестящих, пигментированных колоний, имеющих ровный или волнистый край, гомогенную структуру и маслянистую консистенцию. Вокруг колоний может образовываться радужный венчик (лецитиназа «+»). При отсутствии на чашках лецитиназоположительных колоний исследованию подвергают колонии, сходные по морфологии с колониями стафилококков. 2. Из части отобранных изолированных колоний приготовить фиксированные препараты, окрасить по Граму и промикроскопировать. При приготовлении препарата определить консистенцию, прикасаясь петлей к поверхности колонии (маслянистая, слизистая, крошащаяся и т.д.). В препарате, окрашенном по Граму, стафилококки — это грамположительные мономорфные кокки, располагающиеся, в основном, неправильными группами, гроздьевидно. 3. Оставшуюся часть изолированной колонии засевают зигзагом на поверхность скошенного агара в пробирке. Посев следует проводить со дна пробирки, не касаясь конденсата. Пробирки с посевом поместите в термостат на 18-24 часа при 37°С. III этап (ПОДРОБНО) Цель: идентификация выделенной чистой культуры 1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается: • морфология и тинкториальные свойства • культуральные свойства (характер роста на питательных средах) • биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов) • серологические свойства (антигенные) • вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии) • патогенность для животных • фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам) • чувствительность к антибиотикам • другие индивидуальные свойства IV этап (Заключение) По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре По совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств делают вывод о видовой принадлежности выделенной чистой культуры бактерий. При необходимости изучают и другие признаки (факторы вирулентности, антигенную структуру, чувствительность к фагам и др.). В бактериологической практике установление вида возбудителя позволяет поставить диагноз заболевания, поэтому выделение и идентификация чистой культуры - это и естьбактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Постановка этого метода обязательно включает и определение чувствительности выделенной чистой культуры возбудителя к антибиотикам (определение антибиотикограммы). Третий этап исследований. (ПОДРОБНО )Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: • морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаим- ного расположения в мазке); • тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам); • химические (соотношение гуанина+цитозина вмолекуле ДНК); • культуральные (питательные потребности, условия культивирования, темп и характер роста на различных питательных средах, морфологические особенности колоний); • ферментативные (расщепление различных веществ с образованием про- межуточных и конечных продуктов); • серологические (антигенная структура, специфичность); • биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.). • вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии) • фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам) • чувствительность к антибактериальным препаратм • патогенность для животных Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных иконечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты. Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна. Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой. При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки. Заключение Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур. Культуральные св-ва (3 день исследования) – определяется характером роста на скошенном агаре. ПЛАН ОПИСАНИЯ ХАРАКТЕРА РОСТА НА СКОШЕННОМ АГАРЕ 1) Однородность – однородная, неоднородная 2) Поверхность – гладкая (Шигеллы), шероховатая, складчатая, морщинистая (микобактерии), бугорчатая, «шагреневая кожа» (Коринебактерии) (поверхность кажется шероховатой); 3) Прозрачность - непрозрачная, прозрачная, полупрозрачная; 4) Цвет (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная), выделение пигмента в среду; бесцветные (Shigella), красные (Escherichia) слаборозовые (Salmonella, серовар typhi), голубовато-дымчатые (Proteus), в виде капельки ртути (Bordetella), молочно-белые (Francisella), перламутровые (Listeria), мутные (Klebsiella), черные, синие, желтые или зеленые (Actinomyces). 5) Консистенция - плотная, мягкая, врастающая в агар, слизистая, тягучая, крошащаяся. Биохимические свойства бактерий включают в себя определение сахаролитических, протеолитических свойств, реакций на аммиак, индол, сероводород, обнаружение каталазы. Результаты работ по идентификации культуры протоколируют. Изучение сахаролитической активности бактерий проводят с использованием короткого и длинного «пестрого» ряда. Короткий «пестрый» ряд: жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридима: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. Длинный «пестрый» ряд: короткий ряд + моносахариды (арабиноза, ксилоза, галактоза) + спирты (глицерин, инозит, дульцит). В качестве индикатора ко всем средам добавляют реактив Андре или ВР. Среды Гисса («пёстрый» ряд) - дифференциально - диагностические среды, используемые для выявления сахаролитической активности микрооргангизмов. Состав: дистиллированная вода, 1% пептона и 0,5% поваренной соли, 1% индикатора Андреде или 0,1% спиртового раствора бромтимолового синего, 0,5—1% одного из углеводов; среду разливают по пробиркам с поплавками. При изготовлении полужидких сред Гисса добавляют 1% углеводов и 0,4% агара. Индикатор Андреде - реактив, содержащий фуксин, применяемый для определения ферментативной активности бактерий. (фуксин+вода, для обесцвечивания + едкий натр). Индикатор ВР – реактив, содержащий водный голубой и розоловую кислоту. В нейтральной среде имеет цвет розовый, при сдвиге рН в кислую сторону становится синим. В полужидкие среды с индикатором ВР посев производится петлей, опущенной до дна пробирки. В результате ферментации углеводов индикатор изменяет свою окраску, а пузырьки газа распределяются в питательной среде и в связи с ее вязкостью могут некоторое время сохраняться в среде. В жидких питательных средах изменения устанавливают также по изменению цвета индикатора, а образование газа – с помощью поплавка (небольшая пробирка помещается вверх дном), в котором появляется пузырек газа. К – изменение цвета. КГ – цвет и газ. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только некоторые углеводы, входящие в состав сред Гисса, то наблюдается довольно пестрая картина. Поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором был назван |