Микробиология. 1. Химический состав бактериальной клетки
 Скачать 1.8 Mb.
|
|
«пестрым» рядом. Также для определения сахаролитической активности используют среды: Ресселя, Клиглера, Хью-Лейфсона. Среда Ресселя - плотная комбинированная дифференциально-диагностическая питательная среда, предназначенная для выделения чистых культур энтеробактерий, а также определения их ферментативной активности по отношению к лактозе и глюкозе. Ферментативную активность учитывают по изменению цвета индикатора. Интенсивное изменение окраски всей среды указывает на ферментацию лактозы. Р. с. с индикатором Андраде краснеет, с индикатором ВР— синеет, с бромтимолблау — приобретает желтый цвет. Изменение цвета среды только в столбике указывает на ферментацию одной глюкозы, т. к. из-за малой концентрации этого моносахара индикатор улавливает сдвиг pH лишь в столбике, где благодаря анаэробным условиям сбраживание глюкозы происходит интенсивнее. Среда Клиглера – используется для отсева материала из колоний с целью накопления чистых культур и определения их ферментативной активности по отношению к глюкозе, лактозе и образования Н 2 S. Принцип работы: бактерии, имеющие фермент тиосульфат-редуктазу, восстанавливают тиосульфат в сульфит, при этом выделяется сероводород, который реагирует с железо-сульфатом – в результатате образуется сульфид железа черного цвета. Закисление столбика среды – расщепление глюкозы; Закисление скошенной части среды – расщепление лактозы. Протеолитические свойства обусловлены наличием у бактерий ферментов протеаз, расщепляющих белки. Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели применяют желатин, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса. На желатине. Посев производят уколом, погружая петлю с исследуемой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Микробы, способные расти при низкой температуре, оставляют стоять в комнате при 20—22°С. Остальные посевы инкубируют в термостате при 37°С. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят одну или две пробирки с незасеянным желатином для контроля. При температуре 37°С желатин плавится, поэтому после инкубации пробирки, вынутые из термостата, опускают в холодную воду или ставят в холодильник. После застудневания желатина в контрольных пробирках приступают к просмотру роста и учету изменений в питательной среде опытных пробирок. Там, где под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной среды. Результаты учитывают в 1-й, 10-й и 20-й день, отмечая степень и характер разжижения желатина. Разжижение может быть послойное, что характерно для синегнойных бактерий, стафилококки – в виде «чулка». Характер разжижения желатина возбудителем сибирской язвы напоминает перевернутую елочку. Протеолитическое действие микроорганизмов можно наблюдать при посевах на свернутую сыворотку крови, вокруг колоний появляются углубления и зоны разжижения. В молоке наблюдается просветление или растворение образовавшегося вначале сгустка казеина, который расщепляется с образованием пептона, что придает молоку желтоватый цвет (пептонизация молока). Показателями более глубокого расщепления белка являются его конечные продукты: индол, аммиак, сероводород и др. Для определения этих газообразных веществ производят посев чистой культуры бактерий в бульон или пептонную воду. Реакция на аммиак. Узкую полоску лакмусовой бумаги укрепляют под пробиркой так. Чтобы она не соприкасалась с питательной средой. Посинение свидетельствует о наличии аммиака. Образование индола и H2S. Обычно для определения способности к образованию индола и сероводорода также закрепляют бумажки: в первом случае пропитанные раствором щавелевой кислоты (при образовании индола - краснеет), во втором — раствором ацетата свинца (при образовании H2S - чернеет). Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой добавляют 2-3 мл эфира, перемешивают и добавляют реактив Эрлиха (парадиметиламидобензальдегид с HCl) – в присутствии индола наблюдается розовое окрашивание. Реакция на H 2 S. Посев культуры делают уколом в столбик с питательной средой, содержащей реактивы для выявления газа (сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). При наличии сероводорода происходит почернение агара. Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят каплю 1-3% раствора перекиси водорода и вносят в нее бактериальную культуру. Каталаза разлагает перекись водорода на кислород и воду, выделение кислорода свидетельствует о наличии каталазы у бактерий. Обнаружение уреазы. В составе питательной среды: мочевина и фенолрот (крезолрот). Уреаза расщепляет мочевину с образованием аммиака и углекислоты. Повышается pH среды - покраснение индикатора. При отсутствии фермента среда остается желтой. Редуктазная проба (также реакция с метиленовым синим, резазуриновая проба) — метод проверки бактериального заражения непастеризованного молока, основанный на обесцвечивании красителя в присутствии продуктов жизнедеятельности бактерий. Среда Симмонса. Эта среды используют для дифференциации энтеробактерий по способности использовать цитрат в качестве единственного источника углерода. Первоначально цитратная среда была разработана Козером, она содержала соль аммония в качестве единственного источника азота и цитрат в качестве единственного источника углерода, что позволяло дифференцировать Escherichia coli и Enterobacter aerogenes. Затем Симмонс модифицировал среду, введя в ее состав агар-агар и бромтимоловый синий. Среда содержит гидрофосфат аммония в качестве единственного источника азота и цитрат натрия в качестве единственного источника углерода. Бромтимоловый синий – индикатор рН. Микроорганизмы в ходе размножения на среде продуцируют щелочные продукты, которые способствуют изменению цвета индикатора с зеленого на синий. Лакмусовое молоко. Эта среда наиболее полезна для контроля в молочной промышленности, т.к. она служит достоверным индикатором действия бактерий на молок. Лакмус является хорошим кислотно-щелочным индикатором, который подходит для молочных сред по своему окислительно-восстановительному потенциалу, а также низкой токсичности для микробов, по сравнению, например, с бромкрезоловым пурпурным. Ферментативная активность исследуется по пяти основным направлениям: 1) Изучение изменения уровня кислотности питательной среды. 2) Изучение конститутивных ферментов (постоянно синтезируемых в бактериальной клетке). Этот метод позволяет идентифицировать микроорганизмы без создания специализированных условий для их роста. Так, например, производится идентификация на бактерии рода Bacillus, которые требуют особых условий для культивирования, поскольку являются анаэробами (среди представителей рода Bacillus есть также аэробные виды). 3) Использование меченых источников углерода. 4) Исследование конечных продуктов жизнедеятельности (метаболизма) бактерий в питательной среде. 5) Идентификация на бактерии по визуальному выявлению признаков роста колонии (степень помутнения). Интерпретация результатов проведенных исследований и тестов производится с соблюдением следующих трех принципов: 1) Должно быть выявлено и изучено максимальное количество признаков. 2) Ни один из признаков не является заведомо более весомым. 3) Идентификация результируется как коэффициент соответствия признаков выделенной исследователем культуры свойствам эталонного штамма. 9. Понятие о колониях микробов. Макро- и микроскопическое изучение колоний. План изучения колоний, характеристики колоний. Пигментообразование у бактерий. Значение пигментов в жизнедеятельности бактерий и для их идентификации Колония (бактериальная) – обособленная совокупность бактерий - потомство одной клетки, накопленная на плотной питательной среде. Колонии изучают: • - макроскопически: невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете; • - микроскопически - при малом увеличении сухой системы микроскопа.. В проходящем свете изучают: • - величину колоний (крупные, средние, мелкие, карликовые); форму колоний (правильная, неправильная , круглая); прозрачность колоний ( прозрачная, непрозрачная). В отраженном свете: • - определяют цвет (бесцветные или окрашенные); характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, шероховатая); высоту колоний над поверхностью среды (вдавленная, плоская, возвышающаяся). ПЛАН ОПИСАНИЯ КОЛОНИЙ 1) Форма - округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная; 2) Размер (диаметр) - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средние (3-5 мм), крупные (более 5 мм); 3) Поверхность – гладкая (smooth) – S–форма; шероховатая, складчатая, морщинистая (rough) – R– форма, с концентрическими кругами или радиально исчерченная; 4) Профиль - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т.д.; 5) Прозрачность - непрозрачная, прозрачная, полупрозрачная; 6) Цвет (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная), выделениепигмента в среду; 7) Край - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.; 8) Структура - однородная, мелко или крупнозернистая, волокнистая, струйчатая; 9) Консистенция - плотная, мягкая, слизистая, тягучая, крошащаяся. Пигментообразование у бактерий Пигменты бактерий – это специфические фоторецепторные молекулы, вторичные метаболиты, образующиеся на свету и придающие бактериям окраску. (Наличие у бактерий пигментов обычно связано с их способностью существовать за счет энергии света. Некоторые микроорганизмы утратили способность к фотосинтезу, но сохранили пигменты. Способность образовывать пигменты детерминирована генетически и используется в качестве диагностического признака. Образование пигментов зависит от состава среды и условий культивирования. У многих микроорганизмов образование пигмента происходит только на свету. Пигменты различают по химическому составу и цвету.) Классификация пигментов по химическому составу и цвету: Химический состав Цвет Пигментообразующие микроорганизмы Хиноновые Желтый Микобактерии Азахиноновые (индигоидин) Синий Коринеактерии, псевдомоны, артробактерии Каротиноиды Красный, оранжевый, желтый, белый Сарцины, актиномицеты, стафилококки, микрококки, коринебактерии, дрожжи Меланиновые Черный, коричневый Бактероиды, порфиромоны Пирроловые (продигиозин) Ярко-красный Серрации Фенозиновые (пиоцианин) Сине-зеленый (щелочная среда) или красный (кислая среда) Синегнойная палочка Пиразиновые (пульхерримин) Темно-красный Кандида Классификация пигментов по растворимости: Ø жирорастворимые (каротиноидные, хиноновые, азахиноновые); Ø водорастворимые (фенозиновые, пиразиновые) – хромопарные (способны диффундировать в окружающую среду и окрашивать не только колонии, но и питательные среды); Ø спирторастворимые (каротиноидные, пирроловые); Ø нерастворимые ни в воде, ни в сильных кислотах (меланиновые). Значение пигментов: Ø защита от действия видимого света и УФ-лучей; Ø ассимилируют углекислый газ; Ø обезвреживают токсичные кислородные радикалы; Ø участвуют в синтезе витаминов; Ø обладают антибиотическим действием и свойствами биологически активных веществ; Ø цвет пигмента используют в идентификации бактерий. 10)Накопление чистой культуры микробов на плотных и жидких питательных средах. На 2 день происходит получение и накопление чистой культуры. Просматривают чашки Петри и изучают изолированные колонии, обращая внимание на их форму, величину, консистенцию, цвет, прозрачность, контуры). Для определения морфологии клеток и их тинкториальных свойств из части колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов: d) Механическое разобщение бактериальных клеток. 3. Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма. 4. Метод Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру. e) Методы основанные на использовании биологических св-в бактерий. 4. Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С). 5. Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО2(кампилобактер, геликобактер). 6. Метод обогащения. Исследуемый материал за¬севают на элективные питательные среды, способствую¬щие росту определенного вида микроорганизмов. Биологический метод – метод, основанный на способности бактерий размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных. 11)Культуральные и биохимические свойства бактерий. Изучение сахаролитической и протеолитической активности бактерий. Понятие о пестром ряде. Состав сред Гисса, принцип работы сред Гисса. Методы обнаружения индола и H2S. Идентификация бактерий по морфологическим и культурально-биохимическим свойствам. Культуральные признаки : морфологические особенности колоний бактерий, характер роста на плотных и в жидких питательных средах. Культуральные св-ва (3 день исследования) – определяется характером роста на скошенном агаре Биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов). Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных иконечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты. Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна. Для определения сахаролитической активности используют среды Гисса, Ресселя, Клиглера, Хью-Лейфсона. Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой. Для определения протеолитической активности исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую белок.( желатин, свернутая лошадиная сыворотка, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса, пептонную воду) При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки. Биохимические свойства бактерий включают в себя определение сахаролитических, протеолитических свойств, реакций на аммиак, индол, сероводород, обнаружение каталазы. Результаты работ по идентификации культуры протоколируют. Изучение сахаролитической активности бактерий проводят с использованием короткого и длинного «пестрого» ряда. Короткий «пестрый» ряд: жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридима: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. Длинный «пестрый» ряд: короткий ряд + моносахариды (арабиноза, ксилоза, галактоза) + спирты (глицерин, инозит, дульцит). В качестве индикатора ко всем средам добавляют реактив Андре или ВР. Среды Гисса («пёстрый» ряд) - дифференциально - диагностические среды, используемые для выявления сахаролитической активности микрооргангизмов. Состав: дистиллированная вода, 1% пептона и 0,5% поваренной соли, 1% индикатора Андреде или 0,1% спиртового раствора бромтимолового синего, 0,5—1% одного из углеводов; среду разливают по пробиркам с поплавками. При изготовлении полужидких сред Гисса добавляют 1% углеводов и 0,4% агара. Индикатор Андреде - реактив, содержащий фуксин, применяемый для определения ферментативной активности бактерий. (фуксин+вода, для обесцвечивания + едкий натр). Индикатор ВР – реактив, содержащий водный голубой и розоловую кислоту. В нейтральной среде имеет цвет розовый, при сдвиге рН в кислую сторону становится синим. В полужидкие среды с индикатором ВР посев производится петлей, опущенной до дна пробирки. В результате ферментации углеводов индикатор изменяет свою окраску, а пузырьки газа распределяются в питательной среде и в связи с ее вязкостью могут некоторое время сохраняться в среде. В жидких питательных средах изменения устанавливают также по изменению цвета индикатора, а образование газа – с помощью поплавка (небольшая пробирка помещается вверх дном), в котором появляется пузырек газа. К – изменение цвета. КГ – цвет и газ. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только некоторые углеводы, входящие в состав сред Гисса, то наблюдается довольно пестрая картина. Поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором был назван |