Микробиология. 1. Химический состав бактериальной клетки
 Скачать 1.8 Mb.
|
|
1.Химический состав бактериальной клетки Вода, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, минеральные вещества. Вода – 80-90%, сухой остаток – 10-20%. Вода. Выполняет механическую роль в обеспечении тургора. А) Связанная вода – связана с хим соединениями и входит в состав клеточных структур, количество постоянно. Б) Свободная вода – растворитель кристаллических веществ , является источником ионов , количество меняется в зависимости от интенсивности обмена веществ (так, образование споры ведет к уменьшению количества воды (цель – сохранение генетического материала) до 18-20%) Сухой остаток. А) Минеральный остаток регулирует осмотическое давление, pH среды, окислительно-восстановительного потенциала; активирует ферменты, входит в состав ферментов, витаминов, строительного компонента клетки - участие в метаболизме клетки. Макроэлементы: C – 50% , H, O – 30%, N – 8-15%, P – 3%, S, K, Ca, Mg, Fe. Микроэлементы: Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, Va, B, Cl, Na – 1%, Se, Si, Wo – не нужны каждому организму, но бактериям они необходимы для синтеза кофермента либо поддержания специфического типа метаболизма. Б) Органические вещества: белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты. - белки: составляют 30-50% сухого остатка и обуславливают антигенность, иммуногенность, вирулентность, видовую принадлежность бактерий. Содержат большое количество кислых и нейтральных АМК, меньше всего основных АМК. Более 2000 различных белков в клеточной стенке, ЦПМ, жгутике, пили, зернах валютина, капсуле у бацилл. Содержат диаминопимелиновую кислоту. Функции: строительная, ферментативная, регуляторная. - липиды: свободные ЖК, нейтральные жиры, воски, фосфолипиды, глицериды. В клеточной стенке, ЦПМ, запасах пит вещ-в. Составляют 5-35% (микобактерии). Функции: участие в энергетическом обмене и является запасом пит вещ-в. - углеводы: моносахариды (пит вещ-ва), полисахариды ( в капсуле у пневмо-, стрептококков) – содержат азот- ацетилмурановую кислоту, азот-ацетилглюкозамин. Функции: участие в энергетическом обмене и являются запасом пит вещ-в. - нуклеиновые кислоты: ДНК отвечает за наследственность, РНК – за синтез белка. Бактерию можно характеризовать по содержанию Т и Ц оснований от общего количества в ДНК. Уникальные химические соединения: Клеточная стенка: пептидогликан (азот-ацетилглюкозамин, азот-АМК), диаминопимелиновая кислота, тейхоевая кислота (у грам +). А также: Миколевая, фтионовая, туберкулостеариновая кислоты, воск миколь – у микобактерий туберкулеза. кориномиколевая кислота – у коринебактерии дифтерии лепрозиновая кислота – у микобактерии лепры. 2. Механизмы питания бактерий. Классификация микробов по типу питания Поступление пит вещ-в зависит от величины, растворимости, pH, концентрации вещ-в, различных факторов проницаемости мембран. 1) Пассивная диффузия: по градиенту концентрации, без затрата энергии. Скорость зависит от величины градиента концентрации. Отсутствует субстратная специфичность, низкомолекулярные вещества. Проходит через липидные слой ЦПМ. 2) Облегченная диффузия: участие белков- переносчиков ( пермеазы), субстратная специфичность, по градиенту концентрации, без затрата энергии. Моносахара, аминокислоты, нуклеотиды. От более высокой до более низкой концентрации. 3) Активные транспорт: против градиента концентрации, требуется энергия, могут быть задействованы специфические белки (не идентичны пермеазам) 4) Транслокация групп такой же механизм, как в активном транспорте, но переносимая группа видоизменяется во время переноса (фосфорилируется). Классификация По источнику энергии: 1) фототрофы – энергия солнечного света 2) хемотрофы – энергия ОВР 2а) сапрофиты – разложение орг вещ-в 2б) паразиты - из живых организмов – делятся на облигатные (хламидии и риккетсии) и факультативные. По источнику углерода: 1) Автотрофы: благодаря микробному синтезу синтезируются органические продукты, которые используются гетеротрофами. 2) Гетеротрофы: благодаря микробной деградации происходит синтез неорганических продуктов, которые используются автотрофами. Составляют основу круговорота веществ в природе. По источнику азота: 1) Аминоавтотрофы – азот воздуха, минеральный азот 2) Аминогетеротрофы – азотсодержащие орг вещ-ва По механизму питания: Голофиты – растворенные пит вещ-ва Голозиты – твердые пит вещ-ва По источнику водорода: Литотрофы – неорганика Органотрофы – органика (хемоорганотрофы – патогенные тип питания) 3. Ферменты бактерий, их классификация по механизму действия, химическому составу. Конститутивные и адаптивные (индуцибельные) ферменты. Ферменты - органические вещества белковой природы, которые синтезируются в клетках и во много раз ускоряют протекающие в них реакции, не подвергаясь при этом химическим превращениям. Классификация 1. По локализации: A. Эндоферменты – локализуются в структурах клетки, функционируют только внутри клетки, катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. B. Экзоферменты – синтезируются в клетке, но выделяются в окружающую среду. Катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений. 2. По механизму действия: A. Оксидоредуктазы – ОВР B. Трансферазы – перенос группы от донора к акцептору C. Лиазы – разрыв связей без присоединения воды D. Гидролазы – разрыв связей с присоединением воды E. Изомеразы – внутримолекулярные перестройки F. Лигазы – присоединение двух молекул с участием АТФ 3. По генетическому контролю синтеза: A. Конститутивные – синтез в течение всего клеточного цикла. B. Индуцибельные – синтез индуцируется субстратом. C. Репрессибельные – синтез подавляется в результате избыточного накопления продуктов реакции, катализируемой данным ферментом. 4. По субстрату: A. Сахаролитические – расщепляют углеводы с образованием кислых продуктов или газов. (энтеробактерии B. Протеолитические – расщепляют белок с образованием газов (индол, сероводород, аммиак). (E.coli, S. aureus, протеи) C. Гемолитические – расщепляют гемоглобин. В зависимости от полноты расщепления выделяют 3 вида гемолитической активности (альфа, бета, гамма). D. Аутолитические – действуют на саму бакт. Клетку E. Ферменты агрессии F. Антиоксидантные – разлагают активные формы кислорода, секретируемые микрофлорой. Каталаза (2H 2 0 2 = 2H 2 O+O 2 ) и Супероксиддисмутаза (2О 2 - +2Н + = О 2 +Н 2 О 2 ) 5. По набору ферментов: Прототрофы – полный набор ферментов Ауксотрофы – неполный набор ферментов 4 вопрос Классификация питательных сред Классификация питательных сред по составу: 1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред. Существует несколько способов приготовления МПБ: а) на мясной воде с добавлением готового пептона (продукт неполного переваривания белка) – это так называемый мясопептонный бульон; б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена). Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путей добавления к МПБ arap-arapa(l,5-3%). Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона – это скошенный агар.Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА,застывший в чашках Петри в виде пластинки – пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слойтакой же величины, это полускошенный агар. 2. Сложные средыготовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.) Классификация питательных сред по исходным компонентам: 1. Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или ра- стительного происхождения. Могут быть: • Растительные (исходные продукты – соя, горох, картофель, морковь и т.п.) • Животные (исходные продукты – мясо, рыба, яйца, молоко, животные ткани, желчь, сыворотка крови.и т.п.) • Смешанные (МПА, среда Левенштейна – Йенсена и т.п.) 2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки. Это самая большая и разнообразная по составу наиболее часто применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. 3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды получают полусинтетические среды. Классификация питательных сред по консистенции:среды бываютжидкие(среды без агара),полужидкие (с агаром до 1%),плотные(агаровые – 1,5-2,5%). Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные — для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др. Классификация питательных сред по целевому назначению: универсальные (общеупотребительные) и специальные. Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов.К этой группе относятся: МПБ – мясо-пептонный бульон, МПА - мясо- пептонный агар, МПЖ – мясо-пептонный желатин и т.п. Специальные среды.Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах. Различают следующие виды специальных сред: среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие и среды накопления. 1. Среды обогащения.Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон).Кровяной агар или кровяной бульон – получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки. Среда применяется для выделения пневмококков, менингококков. 2. Элективные (избирательные) среды.Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Eh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NaCl, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся: Селенитовая среда - является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры. Висмут-сульфит агар – содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают. Желточно-солевой агар (ЖСА) –среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика». Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов. Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов. 3. Дифференциально-диагностические среды.Дифференциально-диагностические среды применяют для изучения биохимических свойств и отличия (дифференцировки) одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ. Дифференцирующие свойства данных сред создаются внесением субстрата, к которому определяется отношение микробов, их ферментативной активности и действие токсинов (среды Гисса, среды Эндо, Левина, Плоскирева, Олькеницкого, висмут-сульфит агар и т.п.). По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом: • Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т. п. Наиболее распространенными средами являются мясо-пептонный желатин (МПЖ) свернувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА). • Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами. Например, среды, включающие вещества, ассимилируемые только определенной группой бактерий. Наиболее распространенными средами данной группы являются цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера. • Среды с углеводами, многоатомными спиртами или индикаторами для обнаружения соответствующих ферментов и определения гликолитической активности микроорганизмов. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором BP) и лакмусовое молоко (среда Минкевича). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа. Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника - микроорганизмов, разлагающих лактозу. Такой средой является среда Эндо, в состав которой входит лактоза. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло- розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы - бесцветные, так как они не сбраживают лактозу. • Среды для определения редуцирующей способности микроорганизмов. В эту группу входят среды с красками, обесцвечивающимися при восстановлении под действием окислительно-восстановительных ферментов (например, метиленовый синий, кислый фуксин, бромтимоловый синий), а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка. 4. Среды накопления,на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов. 5. Консервирующие среды.Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследований.Этисреды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), гипертонический ра- створ, фосфатно-буферная смесь. Требования, предъявляемые к питательным средам • быть питательными, то есть содержать в легко усваиваемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста — витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать. • иметь оптимальную концентрацию водородных ионов — pH , так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. • Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2—7,4). Исключение составляют холерный вибрион — его оптимум находится в щелочной зоне (pH 8,5— 9,0) и возбудитель туберкулёза, нуждающийся в слабокислой реакции (pH 6,2—6,8). • Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили pH, среды должны обладать буферностью, то есть содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена. • быть |