Микробиология. 1. Химический состав бактериальной клетки
 Скачать 1.8 Mb.
|
|
изотоничными для микробной клетки; то есть осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая 0,5 % раствору натрия хлорида. • быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды. • плотные среды́ должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию. • обладать определённым окислительно-восстановительным потенциалом, то есть соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH 2 Например, анаэробы размножаются при RH 2 не выше 5, а аэробы — при RH 2 не ниже 10. • быть по возможности унифицированным, то есть содержать постоянное количество отдельных ингредиентов. Желательно, чтобы среды были прозрачными — удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами. 5 вопрос Дыхание бактерий Дыхание (биологическое окисление) – окислительно-восстановительные реакции, идущие с выделением энергии и образованием АТФ. Субстраты дыхания: глюкоза, аминокислоты, спирты и др. Аэробное дыхание – участвует кислород. Анаэробное дыхание – без участия кислорода. При аэробном расщеплении выделяется значительно больше энергии, т.е. оно энергетически более выгодно, чем анаэробное расщепление. Брожение – неполное окисление в анаэробных условиях. Продуктами брожения могут быть этиловый спирт, молочная, масляная, уксусная, пропионовая кислоты. Различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое, маслянокислое, пропионовокислое и другие виды брожения. По потребности микроорганизмов в кислороде выделяют пять групп: 1. Облигатные (строгие) аэробы способны получать энергию только путем дыхания и поэтому обязательно нуждаются в молекулярном кислороде. Энергию получают окислительным метаболизмом, используя кислород как терминальный акцептор электронов в реакции, катализируемойцитохромоксидазой. Пример: представители родовPseudomonas иBacillus. 2. Облигатные (строгие) анаэробы не способны расти и размножаться в присутствии кислорода, поскольку у них отсутствуют ферменты, расщепляющие токсические соединения кислорода.Для них как тип окислительно-восстановительных процессов характерна ферментация, при которой происходит перенос электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору. Тип метаболизма у них — бродильный. Пример: микроорганизмы родовClostridiumи Bacteroides. 3. Факультативные анаэробыспособны расти и размножаться как в присутствии кислорода, так и в его отсутствии.Они обладают смешанным типом метаболизма и могут ис- пользовать в качестве терминальных акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и органические соединения. Процесс получения энергии у них может происходить кислородным дыханием в присутствии кислорода, а в его отсутствиипереключаться на брожение. Пример: Escherichia coli и Saccharomyces. 4. Микроаэрофилы нуждаются в низком содержании свободного кислорода 2-10%. Естественной средой обитания микроаэрофилов является мукозный слой, покрывающий эпителий желудка, где концентрация кислорода невелика. У микроаэрофилов имеются ферменты, которые инактивируются при контакте с сильными окислителями иактивны только при низких значениях парциального давления кислорода, например фермент гидрогеназа. Многие микроаэрофильные бактерии растут быстреев избыточном количестве углекислого газа (до 20%), поэтому их называют капнофилами.Пример: Helicobacter pylori, Campylobacter. 5. Аэротолерантные микроорганизмыспособны расти в присутствии атмосферного кислорода, но не использовать его в качестве источника энергии. Они осуществляют анаэробный метаболизм (брожение), но устойчивы к действию кислорода при его обычных концентрациях. Пример: Streptococcus pyogenes, Lactobacillus. Методы культивирования анаэробных микроорганизмов Для выращивания анаэробов необходимо создать определённые условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и внешнего. Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду. Для культивирования анаэробов применяют физические, химические и биологические методы. Физические методы Кипячение среды – наиболее простой способ удаления растворенного в ней кислорода. Для этого непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят на водяной бане в течение 10-20 мин, в результате чего из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Свежепрокипячённую среду быстро охлаждают под струёй холодной воды, чтобы не произошло насыщение ее кислородом воздуха. Среду засевают материалом и заливают сверху вазелиновым маслом. Посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин. Активно связываются с кислородом воздуха животные ткани паренхиматозных органов (печени, селезенки). Можно применять и ряд неорганических восстановителей: сульфиды, сероводород, цитрат титана. Редуцирующие вещества должны вводиться в концентрациях, не угнетающих рост микроорганизмов. На свойстве животных клеток поглощать кислород основано применение сред: Китта-Тароцци. Эта среда широко применяется для культивирования анаэробов. В её состав входят: мясо-пептониый бульон, печень животного (обычно говяжья). Бульон сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве или 0, 5 атм. -30мин. Среду Вильсона-Блера готовят из мясо-пептонного агара к которому добавляют глюкозу, Na 2 SОз, хлористое железо-- FeC1з. На этой среде анаэробные микроорганизмы, возбудители газовой анаэробной инфекции, столбняка, ботулизма растут в глубине агара. При этом осуществляется восстановление сернистокислого натрия до сернистого, последний же вступает в реакцию с хлорным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет. Наблюдается в пробирках и разрыв среды, свидетельствующий об газообразовании. Метод Вейон-Виньяла Заключается в том, что расплавленный в пробирке и охлаждённый до 50 ° питательный агар засевают исследуемым материалом, тщательно перемешивают и натягивают его в пипетку Пастера. После застывания среды запаивают пипетку с обоих концов или заливают концы парафином и помещают в термостат. Внутри трубки развиваются отдельные колонии анаэробов. Для выделения колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлёй и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде. Создание вакуума в специальных аппаратах (анаэростатах) Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате. Анаэростаты - это воздушные эксикаторы, они представляют собой металлические цилиндрические сосуды с герметически закрывающейся крышкой. Они снабжены манометром, который показывает степень разряженности воздуха и краном для присоединения к вакуумному насосу Из анаэростата вакуумным насосом откачивается воздух. Анаэростаты способны сохранять высокие разряжение в течение длительного времени. Пробирки и чашки Петри с анаэробными микроорганизмами сразу после посева помещают в анаэростат. Колонии анаэробов в вакуумных условиях растут на поверхности плотной питательной среды. Химический метод Метод Аристовского Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 37 °С на 24- 48 часов. Биологический метод В почве, воде, человеческом и животном организме анаэробы постоянно встречаются с аэробами. При этом аэробы, поглощая необходимый для их жизни кислород, создают условия, благоприятствующие развитию анаэробных микроорганизмов. Тот же принцип лежит в основе биологических методов культивирования анаэробов в лабораторной обстановке. Для этого используют метод Фортнера. В чашку Петри наливают толстым слоем питательный агар. Когда агар застынет посредине чашки стерильным скальпелем вырезают бороздку шириной 1-1,5 см. Затем одну половину среды засевают культурой аэроба, а другую - анаэробной культурой. Щель между дном и крышкой чашки промазывают вакуумной смазкой или заливают парафином. Затем чашку помещают в термостат. Быстрорастущие аэробы поглощают находящийся в чашке кислород и создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов. 2. Метод Хеннеля (“часовых стекол”). Он является своеобразной модификацией предыдущего. Материал, который содержит анаэробные возбудители, засевается на поверхность питательной среды диаметром 2-2,5 см. Сверху он покрывается “часовым стеклом”, заполненным слоем МПА и засеяным Serratia marcescens . Аеробни микробы, поглощая кислород, создают условия для благоприятного роста анаэробных возбудителей. В высоко специализированных лабораториях пользуются специальной анаэробной техникой, которая включает использование питательных сред без кислорода с обновителями, выполнения посевов и пересеваний в атмосфере инертных газов, углекислоты и тому подобное. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов Необходимым условием при культивировании анаэробов является защита их от токсического воздействия молекулярного кислорода. Это достигается при помощи физических, химических и биологических методов. Физические методы: 1. Регенерация сред. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят их кипячение в течение 15-20 минут на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 45-50°С. После посева культуры для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином. 2. Посев в “высокий столбик агара”. Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С и вносят исследуемый материал. Пробирки с посевами помещают в обычный термостат. В высоком столбике плотной или полужидкой питательной среды кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5-2,0 см от поверхности, а в глубине остаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов. 3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в механическом удалении воздуха из герметически закрытого сосуда, который называется анаэростат, при помощи вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом или бескислородной газовой смесью. Химические методы: 1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде 2. Применение гидросульфита натрия для поглощения кислорода из замкнутого пространства. 3. Использование редуцирующих веществ. Для связывания остатков кислорода в питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин. 4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах). Для образования водорода и двуокиси углерода используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород генерируется таблетками боргидрида натрия. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия. Биологический метод Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – лабораторную культуру известных аэробных бактерий. После посева чашку герметично закрывают крышкой. Вначале вырастают аэробы, поглощающие кислород, а затем – анаэробы. Для получения изолированных колоний облигатных анаэробов используют следующие методы: Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэростат и выдерживают в термостате при 37°С в течение 24-72 часов. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Пробирки инкубируют в обычном термостате. Метод Виньяля-Вейона. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в 0,5% расплавленном агаре. Содержимое пробирки выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках располагается стеклянная пластинка размером 6x6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри. Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод “перевернутых чашек”. При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином и термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов. Выращивание чистой культуры анаэробов производят путем посева материала из изолированной колонии на среду Китта-Тароцци, в состав которой входит мясной бульон, глюкоза и кусочки печени или фарша. Для предотвращения доступа кислорода среда покрыта слоем вазелинового масла. 6. Классификация бактерий по отношению к температурному режиму. Влияние света на бактерии. Температура. Микроорганизмы лишены механизмов, регулирующих температуру, поэтому их существование определяется температурой окружающей среды. Микроорганизмы становятся недеятельными, если температура окружающей среды опускается несколько ниже 0°С, большинство их не может жить при температуре выше 40°С, в то же время некоторые размножаются при 70—75 и даже 105°С. Психрофилы (от греч. психрос — холод) — «холодолюбивые» организмы. К психрофилам относятся некоторые почвенные и морские бактерии, а также болезнетворные для рыб и водных растений микроорганизмы. Среди психрофилов имеются бактерии и грибы. Психрофилы встречаются главным образом в холодных районах земного шара с устойчивым температурным режимом. Мезофилы (от греч. мезос — средний, промежуточный) имеют температурный оптимум 30—45°, а минимум 10—15°С. Большинство микроорганизмов относятся к этой группе, в том числе болезнетворные. Патогенные для человека и теплокровных животных микробы имеют оптимум около 37°С. Термофилы (от греч. термо — тепло) — теплолюбивые микроорганизмы, развиваются в зоне высоких температур. Минимум не, ниже 35—40°С, оптимум 55—75°С. Облигатные термофилы не растут уже при 37°С, но факультативные формы способны развиваться при 30—35°С и даже при более низкой температуре. В природе термофильные микроорганизмы обитают в горячих источниках и принимают непосредственное участие в процессах самонагревания навоза, сена, зерна и т. д. Термофильные формы имеются у бактерий, актиномицетов, водорослей, грибов и простейших. Свет . Видимая часть света оказывает некоторое отрицательное действие на микроорганизмы, особенно лишенные пигмента. Микробы, живущие на субстратах, которые подвергаются воздействию солнечных лучей, содержат в своих клетках каротиноидные пигменты. Эти пигменты обладают защитным свойством против ультрафиолетовых лучей и видимого излучения. Многие микрококки и сарцины, обнаруживаемые в воздухе, также содержат каротиноидные пигменты и поэтому не гибнут на солнечном свету. Ионизирующая радиация (рентгеновские лучи, а-частицы, у-из - лучение и др.) при низких дозах оказывает мутагенный эффект, а при высоких — обладает летальным действием на микроорганизмы, что позволяет использовать ее для стерилизации различных материалов, консервирования пищевых продуктов и т. д. При этом свойства стерилизуемого материала не изменяются. 7. Понятие о бактериальной культуре. Понятие о чистой и смешанной культуре, штамме, клоне. Бактериальная культура — это искусственно выращиваемое на питательных средах скопление бактерий одного вида, являющихся потомками одной бактериальной клетки. Чистая культура - совокупность микробов одного вида или варианта, полученная из одного образца материала и содержащаяся в определенном объеме среды. Смешанная культура - совокупность популяций бактерий разных видов. Колония – обособленная совокупность бактерий - потомство одной клетки, накопленная на плотной питательной среде. Клон – потомство одной клетки. Штамм – чистая культура микроорганизмов, выделенная из определенного источника, обладающая однородными свойствами. Размножение – увеличение числа особей. Способы размножения бактерий: а) деление клетки на 2 части (бинарное деление); б) почкование; в) распад нитевидных клеток; г) при помощи спор (актиномицеты). Рост – увеличение массы в результате синтеза клеточного материала. Во время роста бактерии потребляют питательные вещества, и если объем питательной среды не изменяется, то наблюдается ее истощение и прекращение роста. Культивирование (выращивание) бактерий в такой среде называют периодическим, а культуру – периодической. Если при культивировании непрерывно подается свежая питательная среда, то такое культивирование называется непрерывным, а культура непрерывной. Рост периодической культуры на жидкой питательной среде разделяют на несколько фаз:. I фаза – лаг-фаза – период между посевом и началом размножения; II фаза – фаза логарифмического роста – период интенсивного деления бактерий и рост количества клеток; III фаза – фаза стационарного роста – количество клеток не меняется и равно максимальной концентрации (М-концентрация); IV фаза – фаза гибели - снижение количества живых клеток; V фаза – фаза уменьшения скорости отмирания клеток – клетки переходят в состояние покоя. на жидких и плотных питательных средах называется культуральными свойствами бактерий. Вопрос 8. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний (цель, материалы для исследования, основные этапы). Содержание 1, 2, 3, 4 этапов выделения и идентификации чистых культур аэробных бактерий. Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод. Цель бактериологического метода заключается в: • выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, • накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности • определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам. МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Выбор материала для лабораторного исследования определяется локализацией патологического процесса, особенностями патогенеза болезни и биологическими свойствами возбудителя. Успех бактериологического исследования зависит от правильности забора материала.Х ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ПРОЦЕДУРЕ ЗАБОРА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ - Материал для исследования забирать до начала антибактериальной терапии (АБТ) – в стационаре при необходимости незамедлительного назначения АБТ материал берется сразу при госпитализации пациента! - При сборе и транспортировке исследуемого материала соблюдать соответствующие меры предосторожности – использовать средства индивидуальной защиты – перчатки, маски (образцы проб считать инфицированными!). - Материал должен соответствовать инфекционному процессу (например, мо Забор проб, требующих использования инвазивных методов, должен производить врач. - Пробы брать из тех мест, где присутствуют и размножаются микроорганизмы (непосредственно из очага поражения!). - Пробы собирать в стерильные (!) транспортные емкости, которые предназначены для сбора и транспортировки конкретного вида материала. - Отбирать достаточное количество материала. - Надлежащим образом маркировать контейнер с материалом и заполнять сопроводительный документ (направление) с указанием наименования материала для исследования, даты и времени его взятия; ФИО, пола и возраста пациента; названия учреждения, отделения, № палаты; № истории болезни, диагноза (показания для бактериологического исследования), предшествующей антибактериальной терапии; фамилии и подписи врача, направившего материал для проведения бактериологического исследования; контактного телефона. - Наружные стенки контейнера и сопроводительный документ (направление) не должны быть контаминированы биологическим материалом. - При транспортировке клинического материала обеспечить сохранение жизнеспособности возбудителя (например, хранение образцов ликвора и крови при температуре 35–37 °С). - Транспортировать полученный образец в лабораторию в максимально сжатые сроки – обычно в течение 1,5–2 часов от момента забора. Допускается хранение некоторых образцов (кроме образцов, полученных из стерильных в норме локусов) в холодильнике (при 4 °С), но не более 24 часов. Хранение материала в коммерческих транспортных средах возможно при комнатной температуре в течение 48–72 часов. - Пробы транспортировать в герметично закрытом контейнере (переносках, укладках) с использованием мер, защищающих от проливания биологических жидкостей. Образцы без сопроводительного документа (направления), а также должным образом оформленное направление без образца в бактериологическую лабораторию не принимаются!крота, а не слюна; отделяемое из глубины раны, а не с ее поверхности). ОСОБЕННОСТИ ЗАБОРА ПРОБ И ТРАНСПОРТИРОВКА ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ НА АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ Во избежание контакта с атмосферным воздухом при исследовании на анаэробы образцы клинического материала получают с использованием инвазивных методов забора (пунктаты закрытых полостей – синовиальной, перитонеальной, плевральной, перикардиальной, суставной жидкостей; пункционные и тканевые биопсии; кровь; пункционная моча; пунктаты абсцессов; костный мозг). После забора материала его необходимо немедленно доставить в бактериологическую лабораторию. При невозможности немедленной доставки образцы проб нельзя хранить в холодильнике, так как абсорбция кислорода быстрее происходит при низких температурах, кроме того, некоторые виды анаэробов (Bacteroides, Fusobacterium) не переносят охлаждения. Анаэробные бактерии растут на 5–7 суток дольше аэробных, таким образом, выдача результата исследования затягивается в среднем до 10 суток, что значительно снижает клиническую значимость микробиологического исследования. Также исследования на анаэробные бактерии требуют специфического оборудования (анаэростаты, анаэробные станции) и значительные затраты на расходные материалы, которые не могут себе позволить небольшие лаборатории, поэтому в обычных практических микробиологических лабораториях довольно редко проводят рутинные исследования на анаэробы и практические врачи назначают антианаэробную терапию эмпирически. |