Микробиология. 1. Химический состав бактериальной клетки
 Скачать 1.8 Mb.
|
|
агопрофилактика - способ предупреждения развития заболеваний в очагах инфекции посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов (бактериальной дизентерии, холеры, сальмонеллеза и др.). • Фаготерапия – метод лечения инфекционных заболеваний посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов, к которым чувствительны возбудители. • Фагодиагностика - метод идентификации выделенных культур микроорганизмов, основанный на способности диагностических фагов лизировать чувствительные бактерии. • Фагоиндикация – способ выявления бактериального загрязнения, когда присутствие фага рассматривается как косвенный показатель загрязненности исследуемого материала. (если есть бактериофаг в воде, значит когда-то там были бактерии) Умеренные в: 1. На лизогенных бактериях изучают механизмы функционирования различных генов; с помощью трансдукции устанавливают локализацию генов на бактериальной хромосоме. 2. Лизогенные бактерии используются при поисках противоопухолевых веществ: если препарат обладает индуцирующими свойствами, т.е. он взаимодействует с нуклеиновыми кислотами, и его можно испытывать как противоопухолевый препарат. 3. Лизогенные штаммы используют при изучении различных мутагенных факторов (излучение). 4. Умеренные фаги широко используются в генной инженерии. 5. Модель "профаг - клетка" лежит в основе вирусогенетической гипотезы происхождения опухолей. Фаготипирование – способ определения принадлежности выделенной и идентифицированной культуры к тому или иному фаговару. (т.е. установление типа) Суть: К суточной агаровой культуре добавляют 2,5мл МПБ, отправляют в термостат на 3-4 часа. Затем в чашку Петри с 25 мл агара (+мясная вода, 0,4% глюкоза, хлорид кальция) засеивают газоном культуру. Маркером на чашке петри расчерчивают 23 квадрата и наносят 23 типовых бактериофага в определенном порядке. Инкубируют 5 часов при температуре 37 градусов (и/или 18 часов при температуре 30 градусов), затем еще культивируют 20 часов при комнатной температуре. Результат записывают в виде «+». От «++++» до «-». Для фаготипирования учитывают наиболее сильные результаты (++++/++). Отличие более чем на 2 фага говорит о различных фаговарах. Фагоидентификация – установление вида бактерий по чувствительности к бактериофагу. Используются индикаторные бактериофаги. Титрование в жидкой среде по методу Аппельмана: В 10 пробирок заливают МПБ по 4,5 мл, нумеруют от 1 до 8 + контроль стерильности среды (только мпб) и контроль роста бактерий (мпб+бактерия). Затем в 1 пробирку добавляют 0,5мл фага, меняют пипетку, из 1 культуры берут 0,5 мл и переносят во 2 и так до 8, из 8 выливают 0,5 мл. Ко всем от 1-8 добавляют 0,05 мл тест-культуры, перемешивают и отправляют в термостат на 20 часов при температуре 37 градусов. Результат: в КК – муть. В 1-n пробирке прозрачно (т.к. фаг лизировал культуру). Титр определяется по пробирке, которая является последней прозрачной. Титр фага в жидкой среде – наибольшее его разведение (наименьшее кол-во), которое подавляет рост культуры. Титрование на плотной среде методом агаровых слоев по Грациа: Титруемый фаг разводят от 10-1 до 10 -10 (как в предыдущем опыте). Полученный материал из каждого разведения переносят по 1 мл в другие пронумерованные пробирки, в которые заранее наливают по 2,5 мл 0,7% МПА, расплавленного и остуженного до 45 °С (соответственно из 1-й в 1-ю и так далее до 10-й). После этого в каждую пробирку добавляют по 0,1 мл тесткультуры. Содержимое пробирок быстро перемешивают, не давая застыть агару и выливают на поверхность среды в чашке Петри с номерами, соответствующими номерам пробирок. После застывания агара чашки ставят в термостат при 37 °С. Результаты опыта учитывают через 18-20 часов. В отрицательном случае зоны лизиса бактерий на чашках с посевами будут отсутствовать. В положительном случае при большой концентрации фага (в первых чашках) произойдет сплошной лизис культуры. В тех разведениях фага, в которых находилось небольшое количество частиц фага, появятся изолированные колонии, которые необходимо подсчитать. Счет по формуле: n=y*10 x , где n – титр, y – кол-во колоний, х – степень разведения фага. Считают только там, где от 5 до 50 колоний. 17. Выпускаемые лечебно-профилактические бактериофаги и их целевая направленность. 15(пр). Назвать состав и принцип применения препаратов лечебно-профилактических бактериофагов. Препараты бактериофагов с лечебной и профилактической целью выпускаются в виде • Таблеток • Мазей • Аэрозолей • Свечей • Суспензии Преимущества лечебно-профилактических бактериофагов • Высокая специфичность в отношении штаммов-хозяев • Не токсичны • Не угнетают нормальную микрофлору • Не подавляют иммунную защиту • Не вызывают аллергических реакций • Могут применятся с антибиотиками и иммунопрепаратами По составу подразделяются на: Монокомпонентные - лекарственные средства, содержащие вирулентные фаги против одного рода или вида бактерий. Комбинированные – лекарственные средства, содержащие несколько видов монокомпонентных бактериофагов. ДИЗЕНТЕРИЙНЫЙ ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ - препарата приводит к элиминации возбудителей дизентерии Зонне и Флекснера в микробиоценозе кишечника, вследствие этого, лечению дизентерии. Показания к применению: лечение и профилактика дизентерии, санация бактерионосителей. САЛЬМОНЕЛЛЕЗНЫЙ - препарата приводит к элиминации возбудителей сальмонеллеза и, вследствие этого, лечению сальмонеллезов. Показания к применению: лечение и профилактика сальмонеллезов, санация реконвалесцентов. БРЮШНОТИФОЗНЫЙ - препарата приводит к элиминации возбудителя брюшного тифа и, вследствие этого, лечению брюшного тифа. Показания к применению: лечение и профилактика брюшного тифа. СТАФИЛОКОККОВЫЙ - Показания к применению: дисбактериоз; кишечные инфекции и другие поражения, вызванные стафилококками - карбункулез, фурункулез, абсцессы, тяжелые инфицированные поражения кожи, бурситы, плевриты, флегмоны, маститы и ангины. СТРЕПТОКОККОВЫЙ ЖИДКИЙ - дисбактериоз; кишечные инфекции (гастроэнтероколиты), холецистит. Препарат также используют при карбункулезе, фурункулезе, абсцессах, тяжелых инфицированных поражениях кожи, бурситах, плевритах, флегмонах, маститах и ангинах. СИНЕГНОЙНЫЙ - дисбактериоз; кишечные инфекции (гастроэнтероколит), холецистит, тонзиллит, фурункулез и другие заболевания, вызванные синегнойной палочкой. ПРОТЕЙНЫЙ ЖИДКИЙ - дисбактериоз; кишечные инфекции, холециститы. Препарат также назначают для лечения поражений ЛОР-органов, бронхов и легких, ран, гнойных процессов кожи и мягких тканей самого разного характера и локализации, гнойных процессов, локализованных в костных тканях и суставах. Кроме того, может быть эффективен в лечении инфекций мочевыводящих органов, при лечении септических состояний, воспалительных процессах слизистых оболочек глаз. БАКТЕРИОФАГ KLEBSIELLA PNEUMONIAE ЖИДКИЙ - Показания к применению дисбактериоз; кишечные инфекции, риносклерома, озена, воспалительные процессы в области носовых пазух или среднего уха, воспалительные процессы в мягких тканях и внутренних органах. КОЛИ ЖИДКИЙ - Показания к применению: дисбактериоз; кишечные инфекции - гастроэнтероколит, холецистит; другие заболевания, ассоциированные с энтеропатогенными E. Сoli. КОЛИПРОТЕЙНЫЙ - дисбактериоз, кишечные инфекции, энтероколит, кольпит, цистит, пиелонефрит, пиелит, сальпингоофорит, эндометрит, вызванные энтеропатогенной E. сoli и P. vulgaris и mirabilis. ПИОБАКТЕРИОФАГ КОМБИНИРОВАННЫЙ - Показания к применению: дисбактериоз кишечника другие заболевания, вызванные кишечной палочкой, стафилококками, стрептококками, синегнойной палочкой и протеями. Препарат используют для лечения инфекций лор-органов, органов дыхательной системы, мочеполовой системы, пищеварительной системы и для лечения самых разных гнойных процессов мягких тканей, суставов, костей, внутренних органов. ИНТЕСТИ-БАКТЕРИОФАГ ЖИДКИЙ - Показания к применению: дисбактериоз кишечника и другие заболевания, вызванные энтеропатогенными кишечными палочками, шигеллами, сальмонеллами, энтерококками, стафилококками, синегнойной палочкой и протеямиы видов P. vulgaris и P. mirabilis и для лечения энтероколита, поноса. ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ - Показания к применению: дисбактериоз кишечника другие заболевания, вызванные стрептококками, стафилококками, протеями, синегнойной палочкой, клебсиеллами и кишечной палочкой. Используется поливалентный секстафаг для предупреждения и терапии недугов, спровоцированных чувствительной к препарату микрофлорой. Это могут быть воспалительные процессы среднего уха, носовых пазух, горла, бронхов, легких, трахей. Также используется при инфицированных ранах, термических поражениях кожи, фурункулезе, карбункулезе, флегмоне, абсцессе, бурсите, мастите, инфекционных процессах в костях. Эффективно средство и для лечения инфекционно – воспалительных процессов органов мочевыделения: при кольпите, цистите, эндометрите, уретрите. Используют бактериофаг поливалентный и для лечения воспалительных процессов органов зрения, а также при инфекционных заболеваниях органов пищеварительного тракта, при общем заражении крови, при болезнях новорожденных младенцев, спровоцированных вышеописанными микробами. П ра к т и че ск ое за дание: 1. Описать колонии на сахарном агаре 1) Структура - однородная, мелко или крупнозернистая, волокнистая, струйчатая; 2) Поверхность – гладкая (smooth) – S–форма; шероховатая, складчатая, морщинистая (rough) – R–форма, с концентрическими кругами или радиально исчерченная; 3) Прозрачность - непрозрачная, прозрачная, полупрозрачная; 4) Цвет (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная), выделение пигмента в среду; 5) Консистенция - плотная, мягкая, слизистая, тягучая, крошащаяся. 2. Описать колонии на питательном агаре 1) Форма - округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная; 2) Размер (диаметр) - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средние (3-5 мм), крупные (более 5 мм); 3) Поверхность – гладкая (smooth) – S–форма; шероховатая, складчатая, морщинистая (rough) – R–форма, с концентрическими кругами или радиально исчерченная; 4) Профиль - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т.д.; 5) Прозрачность - непрозрачная, прозрачная, полупрозрачная; 6) Цвет (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная), выделение пигмента в среду; 7) Край - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.; 8) Структура - однородная, мелко или крупнозернистая, волокнистая, струйчатая; 9) Консистенция - плотная, мягкая, слизистая, тягучая, крошащаяся. 3 вопрос Изучить биохимические свойства выделенной культуры на средах “пестрого ряда”.(среды Гисса) В зависимости от субстрата, который расщепляют бактерии, ферментативные свойства условно подразделяются на: сахаролитические, протеолитические, гемолитические, восстанавливающие свойства, каталазную активность и др. Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий. Изучение сахаролитических свойств. Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева, а также жидкие и полужидкие среды Гисса. Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор. Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии. Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого. Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов. Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно- желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется. Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде. Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается "пестрый ряд". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом". Изучение протеолитических свойств. Протеолитические свойства бактерий изучают: а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент - коллагеназа; б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н2S, NH3. Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола - щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н2S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH3 – лакмусовая бумажка (синий цвет). Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др. 4 вопрос Описание характера роста культуры в питательном бульоне Рост в жидких питательных средах. Рост микроорганизмов в жидких питательных средах при стационарных условиях культивирования характеризуется большим единообразием по сравнению с ростом на плотных средах. Он сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Характеризуя рост в жидкой среде, отмечают: степень помутнения – слабая, умеренная или сильная; особенности пленки – тонкая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая; а при образовании осадка указывают – скудный он или обильный, плотный, рыхлый, слизистый, хлопьевидный; нередко рост микроорганизмов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа (последнее обнаруживают по образованию пены, пузырьков). Для описания характера роста в жидких средах хемоорганогетеротрофные микроорганизмы выращивают на МПБ (мясопептонном бульоне) или на другой среде, обеспечивающей хороший рост этого организма. Чаще всего используют 4–7– суточные культуры. 5.Метод титрования бактериофага по Аппельману (на жидкой питательной среде) Готовят десятикратные разведения исследуемого бактериофага в питательном бульоне. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл бульона. В 1-ю пробирку добавляют 0,5 мл исследуемого фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответствующего разведения фага с уменьшением его концентрации в десять раз. Получают разведения от 10 -1 до 10 -9 степени. Затем в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий. После инкубации в течение суток определяют титр фага. За титр бактериофага принимают то его максимальное разведение, при котором наблюдается полный лизис культуры (просветление среды). 6. Определение количества фага методом агаровых слоев по Грациа Количество бактериофагов выражают в количестве бляшкообразующих единиц на 1 мл исследуемого материала (БОЕ / мл). Бляшки – это зоны отсутствия роста бактерий в местах нанесения фага. Для расчета содержания количества бактериофагов в 1 мл фаголизата необходимо умножить количество негативных колоний в газоне индикаторной бактериальной культуры на разведение исследуемого материала. Пример расчета: на чашке Петри из1мл разведения 10-3 образовалось 43 негативных колонии(бляшек).В 1мл фаголизата содержится 43 х 10 3=43 000 фаговых частиц, т.е концентрация бактериофагов в фаголизате 43 000 БОЕ / мл Метод титрования бактериофага по Грациа (на плотной питательной среде) Питательный агар разливают в чашки Петри и подсушивают в термостате. Готовят полужидкий питательный агар по 3–4 мл в пробирке и растапливают его на водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого бактериофага в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл каждого разведения бактериофага смешивают с таким же объёмом суточной бульонной культуры чувствительных к бактериофагу бактерий и выливают эту смесь в пробирку с полужидким агаром температурой 45°C. Приготовленную смесь быстро выливают на поверхность первого слоя агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37°C в течение суток. Смеси бактериофага, культуры и полужидкого агара делают из разведений фага 10 2 –10 10 , в зависимости от предполагаемого титра фага. Не заражённые бактериофагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная бактериофагом бактерия лизируется и освобождает потомство бактериофага, которое внедряется в интактные клетки бактерий, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна или |