1. Иммунитет, понятие, виды. Пути формирования различных видов иммунитета. 2
 Скачать 93.86 Kb.
|
Иммуноблоттинг.Иммуноблоттинг (син. вестернблоттинг) - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Принцип. Антиген выделяют с помощью электрофореза и переносят его на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Постановка. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с "блотами" антигенов*. На эти полоски наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента. Результат. Изменение окраски хромогена под действием фермента. Метод широко используется в качестве подтверждающеготеста при диагностике ВИЧ- и др. инфекций. Получение и применение моноклональных антител.Моноклональные антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы (В-лимфоцита). Моноклональные антитела (МАТ) секретируются иммунными клетками, происходящими от единственной антителообразующей клетки. Поэтому МАТ направлены только против определенного эпитопа иммуногенного вещества, так называемой "антигенной детерминанты". Для получения МАТ изолируют лимфоциты из селезенки иммунизированной мыши (1) и производят их слияние с опухолевыми клетками мыши (клетками миеломы) (2). Это необходимо, так как жизнеспособность антителопродуцирующих лимфоцитов в культуре ограничена лишь несколькими неделями. При слиянии с опухолевой клеткой возникают гибридные клетки, так называемые гибридомы, которые являются потенциально бессмертными. Слияние клеток (2) является редким событием, частота которого повышается в присутствии полиэтиленгликоля [ПЭГ (PEG)]. Отбор продуктивных гибридных клеток проводится при длительной инкубации первичной культуры в ГАТ-среде (НАТ-среде) (3), содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин, аналог дигидрофолиевой кислоты, конкурентно ингибирует дигидрофолат-редуктазу и тем самым биосинтез дТМФ. Поскольку дТМФ существенно необходим для синтеза ДНК, миеломные клетки не могут выживать в присутствии аминоптерина. С другой стороны, клетки селезенки могут преодолевать действие ингибитора, используя для синтеза ДНК гипоксантин и тимидин, однако и они существуют в течение ограниченного времени. Только гибридома выживает в виде культуры в среде ГАТ, так как эти клетки обладают одновременно бессмертием миеломных клеток и способностью клеток селезенки приспосабливаться к аминоптерину. В действительности продуцировать антитела способны только единичные гибридомные клетки. Такие клетки необходимо выделить и размножить клонированием (4). После тестирования клонов на способность образовывать антитела отбираются положительные культуры, которые снова клонируются и подвергаются последующей селекции (5). В результате получают гибридому, продуцирующую моноклональные антитела. Производство моноклональных антител этими клетками осуществляют in vitro в биореакторе или in vivo в асцитной жидкости мыши (6). Диагностикумы_и_диагностические_сыворотки_–_препараты_для_постановки_серологических_реакций._Их_получение_и_применение.'>Диагностикумы и диагностические сыворотки – препараты для постановки серологических реакций. Их получение и применение.Диагностические сыворотки – содержат известные антитела. Их получают путем гипериммунизации животных (лошадей) соответствующей вакциной. К диагностическим специфическим сывороткам, применяемым для обнаружения в тех или иных материалах антигенов или для определения вида и даже типа микроба или вируса, относятся агглютинирующие, преципитирующие и лизирующие (комплементсвязывающие). Такая классификация основана на функциональной способности специфических гамма-глобулинов склеивать (агглютинировать), осаждать (преципитировать), растворять (лизировать) соответствующие антигены. Диагностикумы- содержат известные антигены, т.е. убитые микробы или их частицы. Диагностикумы бывают бактериальные (содержат убитые микробы) и эритроцитарные (содержат эритроциты, на поверхности которых адсорбированы антигены микробов). Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации. |