практические навыки по микробиологии. 1. микроскопические методы исследования цели задачи виды микроскопии и их применение в микробиологической диагностике

• Название: 1. микроскопические методы исследования цели задачи виды микроскопии и их применение в микробиологической диагностике
• Анкор: практические навыки по микробиологии
• Дата: 10.01.2021
• Размер: 1.02 Mb.
• Имя файла: 1-8.docx
• Тип: Задача; #166876
• страница: 5 из 8

Методы дезинфекции

Различают механический, физический и комбинирован­ный методы дезинфекции.

Механический метод дезинфекции Удаление грязи, частично микроорганизмов достигает­ся применением таких способов:

• 
  влажная уборка помещений и обстановки;
  
• 
  выколачивание одежды, постельного белья и постель­ ных принадлежностей;
  
• 
  освобождение помещений от пыли с помощью пыле­ соса, побелка и окраска помещений;
  
• 
  мытье рук социальным, гигиеническим, хирургиче­ ским способом.
  

Физический метод (термический) дезинфекции

Воздействие физических факторов на предметы являет­ся основой этого метода.

Физический метод дезинфекции достигается следующи­ми способами:

• 
  использование солнечных лучей;
  
• 
  облучение ультрафиолетовыми излучателями для обеззараживания воздуха и поверхностей в помеще­ниях;
  
• 
  проглаживание горячим утюгом, обжиг, прокали­вание;
  
• 
  сжигание мусора и предметов, не имевших ценности;
  
• 
  обработка кипятком или нагревание до кипения;
  
• 
  пастеризация;
  
• 
  тиндализация (дробная пастеризация в течение шести-семи дней при 60 ^аС, экспозиция — 1 час);
  

• 
  кипячение в дистиллированной воде — 30 мин, а с добавлением натрия двууглекислого (питьевой соды) — 15 мин при полном погружении.
  
• 
  воздушный метод дезинфекции (режим дезинфекции: без упаковки, в сухожаровом шкафу при t° — 120 °С, экспозиция 45 мин с момента достижения заданной температуры) используется, если изделия из стекла, металлов, термостойких полимерных металлов не загрязнены органическими веществами;
  
• 
  паровой метод (автоклавирование) используется, если изделия не требуют предварительной очистки
  
• 
  камерная обработка. Сущность камерной дезинфек­ции заключается в прогревании содержимого камер горячим воздухом (паром) до определенной темпера­ туры и при избыточном давлении.
  

Физический метод — самый надежный и безвредный для персонала. Если позволяют условия, а именно: обору­дование, номенклатура изделий — следует отдать пред­почтение этому методу.

Химический метод дезинфекции

Наиболее широко в ЛПУ используется химический метод дезинфекции, основанный на применении растворов хими­ческих средств различными способами.

К химическим способам дезинфекции относятся:

• 
  орошение;
  
• 
  протирание; . .
  
• 
  полное погружение;
  
• 
  распыление.
  

Все химические соединения, используемые в качестве дезинфектантов, можно разделить на 7 основных групп:

- галоидсодержащие;

- кислородсодержащие;

- гуанидины;

- поверхностно-активные вещества

- альдегидсодержащие;

- фенолсодержащие;

- спирты.

Требования, предъявляемые к дезинфицирующим средствам:

1. Должны обладать широким спектром антимикробного действия;

2. Быть активными в небольших концентрациях;

3. Хорошо растворяться в воде;

4. Быстро проникать в микробную клетку и прочно связываться с ее структурами;

5. Должны быть высокоактивными в присутствии органических веществ;

6. Должны быть безвредными для животных и людей;

7. Не должны портить объекты дезинфекции, обладать малым латентным периодом;

8. Должны быть химически стойкими, доступными с точки зрения стоимости, производства, желательно, чтобы они не обладали неприятным запахом
17. Методы контроля стерилизации и дезинфекции.

Контроль стерилизации

1) Персонал должен строго соблюдать и документировать установленный режим стерилизации.

2) О поддержании определенной температуры можно судить по изменению окраски химических индикаторов (бензойной кислоты, мочевины), которые помещают на поверхности и в глубине стерилизуемого объекта.

3) Должен регулярно проводиться технический контроль, помещая внутрь стерилизуемых материалов биотесты, приготовленные из термоустойчивых бацилл (био-тест винар).

4) Для микробиологического контроля проводят посев кусочков материала, смывов с предметов после стерилизации на среды, позволяющие обнаружить анаэробные бактерии, грибы. Отсутствие роста через 14 дней инкубации свидетельствует о стерильности материала.

Контроль дезинфекции

Осуществляется путем бактериологического контроля смывов из лечебных и других учреждений, взятых стерильными ватными тампонами и высеянных на питательные среды. Рост УПМ (боль­шая и разнородная в систематическом отно­шении группа микробов, которые вызывают у человека болезни при определенных усло­виях) –неэффективная дезинфекция.

Контроль качества стерилизации и дезинфекции

Контроль режима паровой и суховоздушной стерилизации

Для контроля режимов стерилизации используют три вида контроля:

- химический (каждый цикл стерилизации);

- термический (1 раз в 2 недели);

- биологический (2 раза в год).

Химический и термический контроль режима стерилизации должен проводить оператор парового стерилизатора.

Биологический контроль проводит бактериолог или сотрудник дезинфекционных станций по заказу бактериологической лаборатории. При отрицательном результате контроля использование всей партии материала запрещается, и он повторно обрабатывается.

Химический контроль

Контроль паровой стерилизации

Этот вид контроля проводят при каждом рабочем цикле с помощью бумажных индикаторов стерилизации (НСТО «Винар») или химических веществ — тестеров.

При проведении исследования в контрольных точках рабочей камеры устанавливают герметично запаянные ампулы с химическим тестовым веществом или к стерилизационным коробкам прикрепляют индикаторные полоски.

Число контрольных точек зависит от емкости стерилизационной камеры:

- до 100,0 л - 5 контрольных точек в камере;

- 100,0 л - 750,0 л - 11 контрольных точек в камере;

- свыше 570,0 л - 13 контрольных точек в камере.

1-ая точка находится у загрузочной двери, вторая - у противоположной стенки (в вертикальном автоклаве - в верхней и нижней части камеры). В 1-ой и 2-ой точках тесты располагаются вне стерилизуемых изделий, а в остальных точках тесты располагают в центре стерилизационных коробок.

Контроль суховоздушной стерилизации

Число контрольных точек зависит от емкости стерилизационной камеры:

- до 80,0 л - 5 контрольных точек в камере;

- свыше 80,0 л (однокамерный) - 15 контрольных точек;

- свыше 80,0 л (двухкамерные) - 30 контрольных точек.

В контрольных точках рабочей камеры используют герметично запаянные ампулы с химическим тестовым веществом или индикаторную полоску, которые прикрепляют к упаковкам или стерилизуемым изделиям.

При контроле в 5 точках 1 точка располагается в центре камеры, а точки 2, 3, 4, 5 расположены в нижней части камеры по углам, причем 2 и 5 точки находятся перед загрузочной дверью справа и слева, а 3 и 4 точки - глубине камеры.

В случае 15 точек - точки 1, 2, 3 располагаются в центре камеры на трех уровнях сверху вниз; а точки 4-15 - по углам, но также на трех уровнях (точки 4-7 - низ; точки 8-11 - середина; точки 12-15 - верх). Угловые точки нумеруются против часовой стрелки, начиная с правого нижнего угла.

Если контрольных точек - 30, то для каждой камеры их расположение повторяется также как для 15 точек. При этом каждая контрольная точка должка быть расположена на расстоянии не ближе 5,0 см от стенок камеры.

После окончания цикла стерилизации индикаторные системы (ампулы с химическим тестовым веществом) извлекают из контрольных точек сравнивают с эталоном.

Термический контроль

Этот вид контроля проводят 2 раза в месяц, используя поверенный максимальный термометр, цена деления которого не более 1^оС, а диапазон измерений превышает контролируемую температуру. При этом термометр размещают в середине стерилизационной камеры. После окончания цикла стерилизации и остывания термометра до комнатной температуры, снимают показания и заносят в журнал.

Биологический контроль

Этот вид контроля проводят 2 раза в год. Для этого используют биотесты, предназначенные для конкретного вида паровой или суховоздушной стерилизации.

Пронумерованные пакеты с биотестами размещают в контрольных точках стерилизатора. После проведенной стерилизации в пробирки с биотестами вносят 0,5 мл цветной питательной среды, начиная со стерильной пробирки для контроля питательной среды и заканчивая контрольным тестом, не подвергавшимся стерилизации (контроль культур).

Далее пробирки инкубируют. После чего проводят учет изменения цвета питательной среды. В контроле (стерильная проба) цвет среды не изменяется. В пробирке с контролем культуры цвет среды должен измениться на цвет, указанный в паспорте, что свидетельствует о наличии жизнеспособных спор.

Работа считается удовлетворительной, если цвет питательной среды во всех биотестах не изменился. Результаты заносят в журнал и регистрируют.

При необходимости контроля за стерильностью медицинских изделий, подвергнутых стерилизации, лаборант бактериологической лаборатории или операционная сестра под руководством сотрудников баклабораторий осуществляют забор проб на стерильность.

Исследование проводят согласно «Методическим рекомендациям по контролю стерильности изделий медицинского назначения». Пробы засевают на питательные среды с соблюдением правил асептики в боксах бактериологической лаборатории. В случаях, когда контролю подвергаются изделия большого размера, пробы забирают путем смыва с них с помощью стерильной салфетки. При отсутствии роста микроорганизмов во всех посевах из проб изделий одной загрузки в стерилизатор они считаются стерильными. При наличии роста хотя бы на одной питательной среде производят повторный контроль удвоенного количества образцов из данной загрузки.

18.Определение ОМЧ воздуха методом Коха.

1)Чашки устанавливают в открытом виде на различной высоте от пола от 5 до 40 минут.

2)Посевы помещают в термостат на 24-48 ч в при t 37⁰С.

3)Определение ОМЧ методом седиментации по Коху:

Подсчитать колонии, расчет ведется по В.Л. Омелянскому: на поверхности площадью 100 см 2 за 5 мин оседает такое кол-во микробов, которое содержится в 10 л воздуха.

Площадь чашки Петри 78,5 см2, кол-во колоний считают и вычисляют по пропорции в 1м3.

Х – количество микробов в 1м³ воздуха

X =      а – число колоний, выросших на чашке

            в – площадь чашки Петри
19.Определение ОМЧ воздуха методом Кротова.

Определяют с помощью аппарата Кротова, принцип действия которого основан на чистой механической аспирации воздуха через щель в крышке прибора, расположенной над вращающейся поверхностью питательной среды в чашке Петри, вследствие чего происходит инерционное осаждение бактерий воздуха на поверхность питательной среды. Затем чашку закрывают и инкубируют 18-24 часа, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

20.Определение коли-титра и коли-индекса воды методом мембранных фильтров.

Коли-титр — наименьшее кол-во воды (мл), в котором обнаружена хотя бы одна кишечная палочка.

Коли-индекс - кол-во кишечных палочек, обнаруженных в 1л исследуемой воды.

1)Для определенияя коли-титра используют нитроцеллюлозный фильтр №3 (с размером пор 0,7 микрон и диаметром).

-Через него фильтруют 500мл воды в течение 2,5 мин

-Затем фильтр переносят стерильным пинцетом на чашку со средой Эндо.

-Через сутки инкубируют в термостате при 37⁰С (на пленке появляются темно-красные колонии с металлическим блеском (E.Coli), которые подсчитывают).

-Делают мазок, идентифицируют

-В случае обнаружения «Гр-» палочек остальную часть колонии пересевают в глюкозо-пептонную среду и инкубируют при 43⁰С (t ?)
-Делают мазок, идентифицируют

-При «+» бродильной пробе присутствуют кишечные палочки - доказано.
(Бродильный метод: Для исследования водопроводной воды делают посев 4 проб по 100 мл и 10 проб по 10 мл- в концентрированную среду; или 3 проб по 10 мл и 3 проб по 100 мл- в глюкозопептонную среду. Посевы инкубируют 24 ч при 37 градусах. Брожение - наличие пузырьков газа в поплавке. Из забродивших проб производят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест для дифференцировки эшерихий: стеклянной палочкой снимают 2-3 изолированные колонии с поверхности среды и наносят штрихом на фильтровальную бумагу смоченную диметил-п-фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте- цвет бумаги не изменится, при положительном- окрашивается в синий в течение 1 мин. Эшерихии- оксидазотрицательны. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по таблицам ГОСТ.)

2) Коли-индекс определяется по кол-ву кишечных палочек в 1 л воды (необходимо 1000 разделить на число, показывающее коли-титр)

Т. к. фильтровали 500 мл воды, то в 1 л будет 4x2=8 бактерий. Если коли-индекс равен 8, то коли-титр равен 1000:8=125.

21.Определение коли-титра и коли-индекса воды методом Эйкмана.

Демонстрация определения коли-титра воды по ме­тоду Эйкмана (двухфазно-бродильный метод)

Общий объем исследуемой воды 333 мл. Исследо­вание проводится на глюкозопептонной среде Эйкмана (вода, пептон, глюкоза). Концентрированная среда Эйкмана заливается в три флакона по 100 мл в каждый, в 3 пробирки по 1 мл и в 3 пробирки по 10 мл. Иссле­дуемая вода засевается во флаконы по 100 мл, в первые 3 пробирки по 10 мл, в последующие 3 по 1 мл воды. Таким образом, в 9 емкостей засевается 333 мл воды. Посевы помещают в термостат на сутки. Далее из всех емкостей делаются высевы на среду Эндо. Для этого чашку со средой Эндо делят на 9 секторов. В за­висимости от количества пробирок и флаконов, давших рост кишечной палочке на среде Эндо (темно-красные колонии с металлическим блеском), цифровое значение коли-титра находят по специ­альной таблице.

22.Метод определения ОМЧ и фекального загрязнения почвы.

ОМЧ почвы - общее кол-во микроорганизмов в 1 г почвы.
Для определения микробного числа почвы берут 1г с глубины 10-20 см . Разводят стерильным физ.раствором в соотношении 1:10, 1:100, 1:1000. Засевают 0,1мл на питательную среду, ставят в термостат с экспозицией 37℃ на 24часа. Подсчитывают количество колоний и делают пересчет на 1 грамм почвы.
Определение ОМЧ почвы:
а)Посев 10-кратных разведений почвы (1:10, 1:100 и т.д.) в чашки Петри на МПА;
б)Инкубация (37⁰С 48ч);
в)Подсчет числа колоний для каждого разведения;
г)Расчет микробного числа почвы(с учетом навески почвы, разведения, объема посева), зная, что 1 колония – это 1 клетка.
ОМЧ=n(кол-во колоний)*0,1(кол-во посев. жидк.)*10³(степень развития)
Определение фекального загрязнения:
1)Определение коли-титра почвы:
а)посев 10-кратных разведений почвы на жидкую среду Кесслера(содержит желчь, лактозу, пептон);
б)инкубация 37⁰С, 24 часа;
в)пересев «+» проб (образование газа и диффузное помутнение) на среду Эндо =>инкубируют 37⁰С, 24 часа;
г) на среде Эндо E. coli образуют тёмно-красные колонии с металлическим блеском;
д)расчет коли-титра (определяют кол-во почвы в гр., в котором обнаружена клетка кишечной палочки).
2)Определение перфрингенс-титра почвы:
а) почвенную суспензию прогревают 10-15 мин при 80⁰С для того, чтобы неспоровые бактерии не росли на среде
б )посев 10-кратных разведений почвы на среду Вильсона-Блера и инкубация 37 - 43⁰С, 3-18ч или посев на среду Тукаева (молочная среда) и инкубация 3 – 4 часа;
в)на среде Вильсона-Блера C. perfringens образуют чёрные колонии  а на среде Тукаева наблюдается створаживание молока, а газ разрывает сгустки казеина и вытесняет в верхнюю часть пробирки
г)расчет перфрингенс-титра (определяют кол-во почвы в гр., в котором обнаружена клетка C. perfringens).
Наличие C. perfringens подтверждается микроскопически (готовят мазок, окрашивают по Грамму и микроскопируют, под микроскопом видны крупные грам «+» палочки)
Определение перфрингенс-титра является важным критерием для санитарной оценки почвы и ее самоочищения, так как в почве, загрязненной фекалиями, уже через 4-5 мес эшерихии исчезают, а C. perfringens обнаруживаются в титре 0,01. Перфрингенс-титр дает возможность судить о давности фекального загрязнения.

23.Определение чувствительности к антибиотикам методом индикаторных дисков.

Метод стандартных индикаторных дисков – он позволяет охарактеризовать культуру бактерий, выделенную от больного, как устойчивую, умеренно устойчи­вую, умеренно чувствительную, чувствительную или высоко чув­ствительную к тому или иному антибиотику. Для этого из суточной чистой культуры со скошенного агара готовят бактериаль­ную взвесь густотой 5×10⁸ м.т./мл и засевают 1 мл, нанося на всю поверхность специальной твердой питательной среды АГВ (Питательная агаровая среда Гивенталя–Ведьминой), раз­литой в чашки Петри. Посев подсушивают 20-30 минут и на­кладывают на него стандартные маркированные бумажные дис­ки, содержащие определенную концентрацию того или иного ан­тибиотика. Диски накладывают на расстоянии не менее 10 мм от края чашки и 20 мм друг от друга. Посевы инкубируют в термо­стате. Через 24 часа измеряют диаметр зон задержки роста во­круг дисков. В зависимости от его величины (d в мм) культуру относят к той или иной группе чувствительности. Антибиотики, к которым данный штамм бактерий оказался высоко чувстви­тельным, и рекомендуются для лечения.